Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Fareden Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreleri İzole Etmenin ve Üretmenin Ekonomik ve Verimli Protokolü. Hayvan denekleri içeren prosedürler, Nanjing Tıp Üniversitesi Kurum Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır.One.Giriş. Tümör bağışıklık araştırmalarındaki artışla birlikte, DC hücrelerine olan talep giderek artmaktadır.

Bununla birlikte, DC’ler tüm dokularda nadirdir. Esas olarak kemik iliğinin DC’lere farklılaşmasını indükleyen geleneksel yöntem karmaşık ve maliyetlidir. İki. Kemik iliğinin izolasyonu ve BM hücrelerinin hazırlanması Fareleri feda ediyoruz ve fare ameliyat masasına sabitliyoruz.

Sol maruz kalan kasların ve femoral arterin derisini kesin. Femoral arteri doğrudan kesmeyin. Aksi takdirde, ağır kanamaya neden olur ve görüş alanını kirletir.

Femur çevresindeki tüm kasları kesin. Femur başının prolapsusu gözlenene kadar farenin alt uzuvlarını yavaşça dışa doğru gerin. Alt ekstremiteleri vücuttan ayırın.

Serbest ve eksiksiz bir femur elde etmek için arka bacağını kesin. Gazlı bez kullanarak kasları çıkarın. Kasları doğrudan yırtmayın.

Farelerin femuru kırılgandır. Femuru iki ila beş dakika boyunca% 75 alkole yerleştirin. Üç. BMDC’nin enjeksiyon kültürü Artık alkolü PBS ile durulayın.

Femurun orta ve alt kısmını hemostatik forseps ile kelepçeleyin ve femur alt ucunu başka bir hemostatik forseps ile kelepçeleyin. Hemostatik forseps tam anlamıyla femura uygulanır ve femur epifizyel hattan kopar. Kemik iliği boşluğunu epifizyal hattan delmek için bir ml şırınga kullanın.

Tam orta iki parça kullanın, kemik beyazlaşana kadar kemik iliği boşluğunu yıkayın. Yıkama sıvılarını toplayın. GM CSF / IL-4 içeren tam ortamın 24ml ile desteklenmesi ve kuyucuk başına 4 ml’lik 6 delikli bir plakada tohumlanması. Dört.Sonuçlar.

İki gün sonra, GM-CSF / IL-4 içeren tüm ortamları değiştirin. Yarısı dördüncü, altıncı ve sekizinci günde GM-CSF / IL-4 içeren komple ortamın yerini aldı. Hücre sayısı yedinci günde zirveye ulaştı ve daha sonra kademeli olarak azaldı.

DC hücreleri, tipik bir olgun DC hücre morfolojisi gösteren çok sayıda sinaps oluşturdu. Akış alt metrik analizleri, CD11c oranının altıncı günde% 71’i empoze ettiğini, geniş oranın 10. günde% 96.1’e yükseldiğini göstermektedir. CD11c, CD80 ve MSC2’nin ekspresyonu, ekim süresinin artmasıyla birlikte giderek artmıştır. Beş.Sonuç.

Kısacası, kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri farelerden izole etmek ve üretmek için ekonomik ve verimli bir protokol oluşturduk, bu da kemik iliği hücrelerini ayırmak için sadece 10 dakika sürüyor. Altı ila yedi günlük kültürden sonra ml başına 10ng, GM-CSF ve IL-4 ile çok sayıda yüksek saflıkta DC hasat edildi.