使用自制双辉光萤光素酶检测的高通量筛选功能

Biology

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Summary

我们目前确定采用高通量机器人转染和一个自制的双发光荧光素酶检测转录调控因子的快速和廉价的检查方法。该协议迅速产生直接并排端功能数据数以千计的基因,很容易修改针对任何感兴趣的基因。

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Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

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Abstract

我们提出了一种快速,廉价的高通量筛选的协议,以确定α-突触核蛋白与帕金森病相关的基因的转录调节。 293T细胞瞬时转染从一个排列的ORF表达文库质粒连同荧光素酶报告质粒,在1个基因的每孔微孔板格式。 48小时,以确定每个基因库后的α-突触核蛋白的转录,归表达从内部控制结构(一hCMV启动子指导海肾萤光素酶)的影响后,萤火虫荧光素酶活性测定。该协议是由封闭在一个生物安全柜台式机器人,它在96孔板进行无菌液体处理提供便利。我们的自动转染协议很容易适应高通量慢病毒库生产或需要三转染的大量独特的文库质粒的共轭等功能筛查方案nction用一套共同辅助质粒。我们还提出一种廉价的和验证的替代市售的双荧光素酶试剂,它采用PTC124,EDTA和焦磷酸盐来抑制萤火虫荧光素酶活性之前, 海肾萤光素酶的测定。使用这些方法,我们筛选7,670人的基因并确定了68监管α-突触核蛋白。这个协议是很容易修改的目标感兴趣的其他基因。

Introduction

找出关键基因的调控元件,并在他们身上起作用的因素的能力是根本的为众多生物过程的探索。然而,识别,调节基因表达的稀有细胞类型的因素,如特定神经元群体,是具有挑战性的。在这里,我们提出了一个协议,用于识别α-突触核蛋白(SNCA)的新的转录调节,与帕金森氏症有关,表现在多巴胺能神经元在黑质的基因收杆中脑的致密区。我们使用的是高通量,双荧光素酶, 在体外记者屏幕解构α-突触核蛋白表达在293T细胞中实现这一点。 α-突触核蛋白的启动子是第一个克隆到含有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒。含有组成型活性的启动子的控制下的海肾荧光素酶的市售质粒作为内部对照。成分股ë记者构建体共转染到293T细胞中微孔板与从DNA表达文库质粒,使得每孔转染了一个单一的文库质粒。 48小时后,对于每一个记者荧光素酶活性被依次使用双辉光测定法测量。在每个孔中的海肾荧光素酶的活性(F:R比率)板基于归一化后的α-突触核蛋白的响应于每个文库的基因的相对表达通过的萤火虫的比率推断。

该协议提供了筛选大量的基因(〜2,500每星期)就其使用最少的人力(1-2人),最低的成本(约300试剂费用为每微孔板检测),以式激活报告基因的能力的能力。神经细胞的基因的转录调节子( ,α-突触核蛋白),这是很难培养的神经元耐火遗传操作来研究,可以比在此直接功能测定并排侧。我们在包括我们协议的详细方法进行克隆和含有α-突触核蛋白的启动子的质粒的增长,因为我们发现,当用常规方法(见讨论)生长含有该区域的质粒是不稳定的。我们还包括了一种廉价的替代市售的双荧光素酶试剂,用于高通量测定法。这个协议可以很容易地适应目标的感兴趣的其它调控元件,或以任何需要高通量的瞬时转染过程。

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Protocol

对于一个实验性的概述,参见图1。

1,准备报告质粒含有α-突触核蛋白启动子

α-突触核蛋白基因( 图2)的调控元件跨度约10 kb的,从上游NACP(淀粉样肽的非A的β成分)二核苷酸重复序列1,2到2内含子3,我们在包括这个区域的一部分本报记者构造。我们发现,含有内含子2的成长需要特别程序质粒,概述如下。荧光素酶质粒,pGL4.10和pGL4.75( 图3),可购自Promega公司,并且可以使用常规的分子生物学协议来传播。

  1. 使用配方在表1表2中的引物扩增的2个组分的α-突触核蛋白的启动子在不同的PCR反应。
  2. VERIFY PCR产物上使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen),洗脱在50μl的TE液(Tris-EDTA)的琼脂糖凝胶和清洁。存储洗脱0.9kb的片段于-20℃以备将来使用。
  3. 消化的3.4kb的PCR片段的总体积,以及5微克pGL4.10的,用SacI和XhoI。治疗的载体以小牛肠碱性磷酸酶(Roche)和凝胶纯化使用的PureLink快速凝胶提取试剂盒(Invitrogen)中。
  4. 用T4 DNA连接酶(NEB)结扎片段和载体。清洗用的PureLink PCR微试剂盒(Invitrogen)将完成的反应,洗脱在10μl的TE缓冲液中。
  5. 变换2微升的清洗,连接反应成20微升ElectroMAX Stbl4感受态细胞(Invitrogen)中,并根据制造商的说明电穿孔。摇动在30℃培养箱中,在225 rpm离心90分钟。传播2卷上含有100毫克/毫升氨苄青霉素和孵化在30℃下2天。
  6. 用牙签,选择接种4-6小菌落于2ml结核病(极品肉汤)。在30℃摇床的O / N。种植这些小量制备文化
  7. 从1.5ml每种小量培养使用的PureLink HiPure质粒小量提取试剂盒(Invitrogen)纯化的质粒DNA。
  8. 消化小量制备用BamHI和electrophorese在琼脂糖凝胶上。正确的克隆应该产生2.8 kb的和4.9 kb的片段。
  9. 从一个新鲜的LB(卢里亚肉汤)板的正确克隆重新划余下的小量培养和成长在30℃下2天。
  10. 选择一个小菌落,接种1.5ml的结核病发酵剂培养物。摇O / N为30°C。不要让起子培养成长到饱和。
  11. 淡化整个发酵剂每150ml预热结核病和动摇在30℃下2天。之前继续到下一个步骤中,使用1.5ml该培养物需额外小量制备和消化来确认克隆中replicati未变异上。
  12. 从使用的PureLink HiPure质粒大量制备试剂盒(Invitrogen)的余下培养纯化质粒DNA。这中间质粒的预期收益率是每150毫升培养50-150微克。
  13. 解冻0.9 kb的片段定格在步骤1.2。重复步骤1.3至1.12克隆的0.9 kb的片段到中间质粒,消化,而不是用KpnI和SacI。结扎,变换,选择和成长为maxipreps如上。消化用BamHI应产生5.8 kb的和2.8 kb的片段。这是将被用于在屏幕的质粒。

2,准备293T细胞中,记者质粒和DNA库的筛选

293T细胞首先被接种到96孔板中,并转染次日。报告质粒和文库的DNA稀释到96孔板中。我们在美国马萨诸塞州总医院(获得的转染级DNA文库板从DNA核心获得=“_blank”> dnacore.mgh.harvard.edu)。这个协议transfects单个库板染293T细胞2相同的板( 图1),从而2细胞的板应接种每个库板进行筛选。

注:细胞生长介质中无酚红或抗生素,因为这些干扰荧光素酶检测和转染过程中增加毒性,分别为。

  1. 每个库板被屏蔽,重悬胰蛋白酶处理的293T细胞以1.5×10 5细胞/ DMEM中含有14%FBS的ml的浓度。倾入无菌容器(爱思进)。
  2. 将水库,2透明底96孔板(Corning)中,和一箱过滤器枪头(安捷伦)在机器人上甲板。分配100μl的细胞分化为两个板的各孔中,为每孔1.5×10 4个细胞的密度。
  3. 离心电池板在50×g离心2分钟,使用低斜坡速度,以确保平等贯穿每个孔中的细胞密度。在37°C和10%的CO 2 O / N。
  4. 淡化萤火虫和海肾报告质粒至5纳克/微升的无血清培养基。在一个15毫升的锥形管结合稀释液中为5:3萤火虫到海肾质粒的比例(体积比)。
  5. 移液管的组合的质粒到96孔板的各孔中,分配每个库板17微升,加2-10微升过剩,在每孔中。
  6. 获得的转染级DNA文库板如上述稀释至13.3纳克/微升用无内毒素的水。每孔的最小体积应为28微升。

3,进行转染

在屏幕的第2天,报告质粒和文库的DNA转染到293T细胞中。

  1. 对于每个库板,以聚苯乙烯试管混匀107.5微升RT Optifect(Invitrogen公司)的4.3毫升血清的培养基(1:40稀释)。孵育5分钟,在室温和Ñ​​免除44微升(每个库板)到96孔聚苯乙烯V形底平板(Greiner)中的每个孔中。
  2. 放置板的稀释Optifect,报告质粒(步骤2.5),库的DNA(步骤2.6),和一个盒上的机器人甲板枪头。
  3. 吸17微升报告质粒,43微升稀释Optifect,和26微升的DNA库中,每次插入抽吸之间的5微升的空气间隙。该文库DNA应该最后吸气,以防止交叉污染。免除提示的内容到一个新的聚苯乙烯V形底板,混合,盖,并预留20分钟,使脂质/ DNA复合物的形成。如果转多个库板,更换枪头和库板,并重复。
  4. 揭开Optifect / DNA混合物板,并将其放置在机器人上甲板2板293T细胞。使用单一框的枪头,吸80微升的Optifect的:DNA混合物,慢慢地免除40微升到细胞的每块板。如果反fecting多个库板,重复所有Optifect:DNA的板块。覆盖细胞。
  5. 离心细胞板在1200×g离心30分钟。覆盖,并返回到培养箱中。
  6. 于室温孵育4-6小时。在此培养后,通过混合12毫升DMEM含10%FBS和10微克/毫升环丙沙星(的CellGro)对于每个转染的库板制备的新鲜培养基。倒入新鲜介质装入无菌水库。
  7. 将2盒机器人的提示,细胞的单盘,含有新鲜媒体和废物储存到机器人甲板上的水库。从细胞中吸出100μl的媒介,分装到废物储存器部分地填充有70%的乙醇。使用新鲜的秘诀,吸100微升新鲜培养基,慢慢地分配到细胞。重复单元的各个板块。
  8. 返回板的培养箱中培养48小时。

4,进行双荧光素酶检测

在屏幕的第4天,在萤火虫和海肾萤光素酶测定法进行。

注:双萤光素酶测定,需要顺序加入2测定缓冲液,3X萤火虫测定缓冲液和3X Renilla荧光测定缓冲液中,如表3中描述的萤火虫和海肾萤光素酶不分泌,从而细胞必须测定荧光素酶活性之前裂解。 。萤火虫测定缓冲液中裂解细胞,并提供了底物的萤火虫荧光素酶; Renilla荧光测定缓冲液淬灭萤火虫信号且提供基片的海肾荧光素酶。

  1. 每个库板,如表3中所述制备8毫升的3X萤火虫测定缓冲液从储液,并免除82微升到96孔V形底的板的各孔中。
  2. 每个库板,还准备12 3X Renilla荧光测定缓冲液中,并分配122微升到96孔V形底的板的各孔中。抛开两者的萤火虫和海肾检测缓冲区。
  3. 放置一个方块的枪头,一个废物储存器,和2板的细胞(来自相同的库板转染)在机器人上甲板。
  4. 从各板吸60微升媒体并丢弃在废物储存部分地填充有70%的乙醇。盖板及待用。如果转多个库板,重复板的所有集合。
  5. 放置2盒枪头,3X的萤火虫测定缓冲液中的板,并在机器人上甲板的一组细胞的板。
  6. 吸出40微升3X萤火虫测定缓冲液中,并将其添加到细胞中的所述第一板,充分混合。切换至新的枪头,然后为第二单元板。把细胞在室温下10分钟,完成裂解。如果转多个库板,更换的提示和电池板的框,然后重复。
  7. 从每个细胞板在一个光度计,记录为1秒,每孔的每个孔中记录的发光。返回板到机器人甲板。
  8. 放置2盒枪头,3X的Renilla荧光测定缓冲液中的板,并在机器人上甲板的一组细胞的板。
  9. 吸出60微升3X Renilla荧光测定缓冲液中,并将其添加到细胞中的所述第一板,充分混合。切换到枪头一个新的框,然后为第二单元板。如果转多个库板,重复单元板的所有集合。
  10. 从光度计所有板块记录发光,记录每孔1秒如上。丢弃板。

5。数据分析

  1. 计算萤火虫: 海肾荧光比(“F:R比率”)由海肾萤光信号的计数除以萤火虫信号的计数每口井。
  2. 通过将在F计算感应值:每个孔的平均F R的比值:所述板的R比,不包括孔中的最高和最低的25%。
  3. 跨重复平均感应值为一个单一的转库板。基因诱导或抑制α-突触核蛋白比三褶皱更被认为是“点击”在此屏幕上,并受到进一步的验证和二次筛选。

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Representative Results

典型的荧光素酶值,F:R比和为一个单一的半板的感应值被显示在图4中注井H2,32倍诱导的命中。基因会引起过度的毒性(例如,井E3),或井转染较差,会产生低的值既萤火虫和海肾萤光素酶,但平均感应值。基因会引起非特异性诱导荧光素酶活性,也许是通过与pGL4骨干相互作用,将导致萤火虫和海肾萤光素酶一样,产生的平均感应值。大的差异在重复之间的感应值应高度怀疑为执行错误。重要的是要验证的是报告分析的线性范围内进行的屏幕,这样的克隆,导致表达增加将被认为是增加的荧光素酶活性是很重要的。我们转染各报告基因的增加量来验证线性我们的实验条件下的报告基因分析中( 图5)。同样重要的是要迅速地进行测定后的温育步骤,以避免非线性由于衬底耗尽。我们添加试剂( 图6)后观察到的显著萤火虫荧光素酶活性达1小时。

图1
图1的试验概要。文库DNA中的每个单块板是结合2报道构建并用于转染细胞的复制版。 48小时后,各荧光​​素酶报告活性的顺序测定。在特定诱导的SNCA启动子质粒的每个库的质粒是由萤火虫到海肾荧光素酶板型normalizatio后比计算Ñ​​。

图2
图2示意图α-突触核蛋白的5'区域(SNCA),位于4号染色体,在萤火虫报告质粒使用的引物名称对应表2中的序列。哈奇标记表示从图中淘汰了约8 kb的片段,否则按比例绘制。用于SNCA ATG起始密码子位于外显子3。

图3
在此筛选方法中使用图3。荧光素酶报告质粒的 SNCA基因组区域被克隆到PG的多克隆位点L4.10紧接在萤火虫荧光素酶的上游。与病毒hCMV-IE1(人巨细胞病毒立即早期1)的启动子引导的Renilla荧光素酶的表达质粒被用作内部对照。两种质粒均购自Promega公司。

图4
图4为半单个96孔板中的代表性结果。 A.生萤火虫荧光素酶计数B.海肾萤光素酶计数C. F:R比,通过划分每个F B中D.感应值,每口井计算,除以A的值由值计算:R比率由平均F:R比率的板,不包括孔的顶部和底部的25%E.图形感应值表示为单块板,具有良好的H2,积极打击,突出显示。命中H2是以前没有与SNCA表达相关的神经元转录因子。 点击这里查看大图

图5
图5。线性度测定。转染细胞与强和hCMV-IE1启动子控制下的增加量的萤火虫和海肾荧光素酶的质粒,并测定与上面的协议。 (DNA转染的总量保持不变通过使用中性平衡器质粒)A.萤火虫的线性检测。需要注意的是萤火虫的活动,通过广泛的范围值。B. 海肾线性分析的仍然是线性的。注意以上15纳克/孔的曲线变平。

ntent“FO:保持together.within页=”总是“> 图6
。图6的衰减信号为萤火虫萤光素酶测定的时间过程萤光素酶试剂加入到一个单一的板转染了CMV-荧光素酶构建在时间0;进行了连续测量而不增加另外的试剂。

元件 终浓度
BAC 2002-D6在5纳克/微升 4微升 -
5X的Phusion GC缓冲液 20微升 1X
DMSO 6微升 6%
的dNTP(10公厘) 2微升 200微米
正向引物(100微米) 1微升 10微米
ŘEVERSE底漆(100微米) 1微升 10微米
双蒸2 O 65微升 -
Phusion DNA聚合酶 1微升 -
总计:100微升

表1 PCR建立用于扩增α-突触核蛋白的启动子。

名称 序列 限制网站
SNCA7 5'-GTC GGTACC tgaagttaacctcccctcaatacc-3' KpnI位
SNCA8 5'-TGC GAGCTC aagaagacagccatctgcaagcc-3' SacI位
SNCA1 5'-TCT GAGCTC tctgagcatttccctaggtg-3' SacI位
SNCA2 5'-标签CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3' XhoI位

。表2的引物用于扩增α-突触核蛋白的启动子的NACP重复扩增子应该产生一个0.9kb的片段;其他扩增子长度为3.4 kb的。为引物的位置,请参考图2。

答:3X萤火虫缓冲液
库存解决方案 (在-80°C店) 每100毫升3X萤火虫测定缓冲液体积 最终浓度(3X)
500 mM的DTT 3.0毫升 15毫米
10毫米辅酶A 6.0毫升 0.6毫米
100毫摩尔ATP 0.45毫升 0.45毫米
80毫克/ mlluciferin 0.525毫升</ TD> 4.2毫克/毫升
的Triton裂解液 90.025毫升 -
B.海卫裂解液
组件 (存储在室温) 每100毫升的Triton裂解液体积 终浓度
的Tris-HCl粉 1.705克 0.1082 M
Tris-碱粉 0.508克 0.0419 M
5 M氯化钠 1.50毫升 75毫米
1米2氯化镁 0.30毫升 3毫
的Triton X-100纯液体 0.75毫升 0.25%
至100ml总体积 -
C. 3X 海肾萤光检测缓冲液
每〜100毫升3X 海肾萤光检测缓冲液体积 最终浓度(3X)
10毫米PTC124在DMSO 0.6毫升 0.06毫米
2 mm(高)-CTZ在乙醇 0.5毫升 0.01毫米
海肾百毫升 -
D. 海肾
组件 (存储在室温) 每100毫升的Renilla盐体积 终浓度
的0.5M的Na 2 EDTA 9.0毫升 45毫米
焦娜 1.34克 30毫米
氯化钠 8.33克 1.425 M
水至100ml总体积 -

表3。股票的解决方案和检测缓冲区萤火虫和海肾萤光素酶检测。答:3X萤火虫分析缓冲液配方。 DTT,二硫苏糖醇。除非另有说明,所有组分均溶于水中。B.的Triton裂解缓冲液配方。C. 3X Renilla荧光测定缓冲液配方。 H-CTZ,H-腔肠素。使2毫米H-CTZ加入10毫克H-CTZ到12.2毫升100%乙醇和120μL浓盐酸。 PTC124溶于DMSO中。D. 海肾盐配方。的Triton裂解缓冲液和海肾盐可稳定数周,在4℃和RT分别。 3X萤火虫测定缓冲液和3X Renilla荧光测定缓冲液应在3-4小时内进行荧光素酶测定法的混合。

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Discussion

α-突触核蛋白有牵连的帕金森氏病(PD)作为路易体4,考虑特殊病征为疾病细胞内的夹杂物的成分。众多的全基因组关联研究已发现,单核苷酸多态性在α- ​​突触核蛋白与风险偶发性帕金森氏5,6,7增加。虽然比散发性PD不太常见,家族性帕金森病也可在α- ​​突触核蛋白8所造成的突变,以及复制和α-突触核蛋白基因9,10,11的三重,这种现象也出现在散发性PD 12。总而言之,这些研究加强α-突触核蛋白的核心帕金森病的发病机制。该屏幕的目的是确定基因调节α-突触核蛋白,因此可能在帕金森病的发病机制中发挥作用。使用此协议,我们筛选7,670人的基因并确定了154初步命中(至少3倍的诱导剂),占140独特的基因。这些点击是受使用新的DNA制剂,以确定命中重现二次检测。在3倍范围命中再现随后的荧光素酶检测28%。再现性提高到59%,69%,和78%的4 - ,5 - ,和5倍的诱导剂,分别。点击与归纳超过7倍的再现100%的时间。我们最终确定了68项新的α-突触核蛋白的转录调节因子。

一些证据表明,我们获得了68命中是α-突触核蛋白的实际监管。我们确定的命中清单包括GATA3,转录因子GATA家族的前面显示调节SNCA表达3转录因子的成员。进球的几个已知的SNCA监管机构之一,提供了很大的信心,我们的屏的可靠性。此外,我们独立评分为神经元击中转录因子的同一个家庭的几名成员,提示屏幕是可重复的,而不是基因鉴定在随机的。最重要的是,在更多的后续试验,我们的最高的命中能力来调节神经细胞内源性的SNCA表达过表达和敲除实验进行了验证。我们过度几个最佳的击中使用BacMamvectors在SY5Y多巴胺能细胞3,并能增加内源性SNCA水平2-8倍,而这些命中的shRNA的敲除导致减少SNCA mRNA水平。这些研究得出结论证明,我们的排名靠前是内生的SNCA水平的监管机构,不属于解构荧光素酶系统的简单的文物。将需要额外的后续研究,其他的打击,以确定在我们的屏幕上点击的完整列表,真正的假阳性和假阴性率。命中及其对帕金森病关系的完整描述是在准备14。

考虑我们的筛选方法的局限性是很重要的。应当OBV白条,屏幕也不会发现任何监管机构不会出现在筛选库。虽然我们的筛选库是相当大的,含有人类基因组的约四分之一,这是不全面的。由于我们分析的简单性,额外的库可以筛选提供方便。我们增加基因的,包括命中旁系,当可筛选有针对性地数量,在我们的二次检测。我们也不会得分的必然基因组区域所包括本报记者构造之外的任何打击。为了最大限度地提高包括固有区域的机会,我们的记者包含在SNCA启动子中发现的多个转录起始位点的直接侧翼序列。这很可能是其他因素结合区域远远超出眼前的启动子区域,调节SNCA表达。这些可以通过用另外的上游和下游区域的执行画面被检测到,如果需要的话,虽然只〜10 kb的在一个时间可以是由于在有效克隆到质粒载体和高拷贝数pGL4载体的稳定性限制ssessed以这种方式。或者,所述荧光素酶构建体可以被改造成含有SNCA基因座的BAC的DNA。一个缺点的一种方法是,即使在理想条件下的BAC的转染是> 100倍效率较低然后质粒15。另一种方法是“敲入”的荧光素酶报告为内源性SNCA基因,一种方法,是更为艰苦的话,我们的做法。我们也不会进球这已经表示在饱和水平,使过度不会导致增加的荧光素酶活性的任何打击。为此,我们选择了采用非神经293T细胞,这可能缺乏神经因子调控SNCA,而事实上我们也进球了一些神经元转录因子。 293T细胞的一个潜在的缺点,但是,是我们可能不会进球的任何基因作为一击,如果它需要一个DDITIONAL神经因子才能正常工作。因此,像所有画面,我们的研究可能会错过一些潜在的SNCA监管机构。然而,在实践中,68命中,我们获得增加的SNCA已知的监管机构超过10倍的数量,将需要多年的工作跟进,所​​以额外的命中可能没有必要在我们的例子。

同样重要的是认识到使用这种方法时可能发生的潜在的工件。在化学屏,荧光素酶是臭名昭著的artifactually得分化合物的荧光素酶蛋白质的稳定,而不是通过诱导转录。为了排除蛋白质稳定的文物,我们筛选了命中反对其他几个子 - 荧光素酶的结构,并没有发现这似乎由组成型启动子表达提升行动转录后的任何点击。另一个潜在的神器可能是其绑定到pGL4载体骨架,而不是一个反式激活因子在SNCA启动子。我们所采用的pGL4载体,其已被广泛地突变以去除转录因子结合位点来避免该问题。以评估是否有任何我们的命中所需要的载体骨架的感应,我们用PCR扩增SNCA-荧光素酶载体区域没有任何支柱,用这种线性片段作为一名记者进行二次分析。我们发现我们的完整质粒记者有一个例外的骨干线性无结构之间的感应值没有显著差异。 GATA2表明〜15倍的诱导用质粒记者,但只有〜2.7倍,与线性记者,这表明一些GATA2诱导可能是由于结合到主链组件。

许多其它的方法来确定转录调节进行了描述。近30年来, 通过转染报告基因表达的强病毒启动子顺式作用转录控制元件的映射是东部时间ablished 16。这种方法有时被称为“扑子”,已经失宠的细胞类型特异性启动子的映射,因为它是很难获得和转染合适的原代细胞系,而该行可能不能准确地代表他们的原籍组织。通过提供一个解构报告系统检测之间的融合基因库和特定的顺式作用元件相互作用的酵母单杂交系统17绕开这个问题。我们的做法是类似的解构设计的酵母单杂交系统,但在我们的系统中,我们采用正常表达克隆,而不是基因融合,我们采用哺乳动物细胞,而不是酵母,和我们使用机器人,让并排侧定量功能读数为每个测试基因。一个有前途的方法,称为染色质隔离段(PICH),它可以识别的蛋白绑定到特定的基因组区域已经描述18蛋白质组学,但尚未已成功地应用于单拷贝人类基因。全基因组染色质免疫沉淀(芯片起和芯片芯片)的研究已经用来识别大规模19顺式作用区域。这种方法潜在的强大,但是,像PICH,可能是细胞类型,如这是不容易在同质的文化得到特定神经元群体的那么有用。此外,当我们已经检查的ChIP数据库为我们验证的命中,他们还没有表现出这些命中结合的SNCA启动子。这样做的原因是不明确的,因为我们已经能够证明这些因素对SNCA启动子由传统的芯片14的结合;但它可能是由于缺乏被雇用在使用微阵列读数(芯片芯片)芯片研究整个SNCA启动子区。因此PICH,芯片起,和其他蛋白质的方法可能是最有用的耦合到直接读数的功能,我们的方法时产生。

双荧光素酶实验采用萤火虫和海肾萤光素酶提供用于高通量形式20多项研究细胞内过程的敏感方法。目标启动子的融合到萤火虫荧光素酶已被用于研究许多目标体外转录调控的启动子和结构,包括α-突触核蛋白1,2。我们开发了一种廉价的替代市售的双荧光素酶试剂,其提供可靠的信号,是线性在我们的分析的范围( 图6)。我们的方法是改编自慷慨罗恩·约翰逊在美国国立卫生研究院和先前描述的非商业的双荧光素酶检测21提供了一个协议。萤火虫测定缓冲液中裂解细胞,并提供了ATP和荧光素,荧光素酶的底物。该测定得到了半衰期约为1小时( 图7)的辉光反应。 海肾分析缓冲液淬火fireflY信号,并提供适当的底物(腔肠素)。注意,Renilla荧光测定缓冲液本身不会裂解细胞,并且必须在与任何的Triton裂解缓冲或萤火虫测定缓冲液混合使用。我们发现,前面所述的海肾萤光分析缓冲液容易沉淀在室温,从而消除了我们硫酸钠和60%下降焦磷酸钠的用量。我们的分析还包括PTC124,萤火虫荧光素酶22的强效抑制剂,有助于额外猝灭测定中。淬火活动也由EDTA,NaCl和焦磷酸盐的海肾缓冲区提供。有了这些新的配方,萤火虫活动的约99.5%是由海肾缓冲液淬火。两个萤火虫和海肾荧光素酶的信号的强度和再现性通过加入缓冲液的后混合(步骤4.6和4.10)略有提高。

根据我们的经验,完整的一在pGL4.10 lpha-突触核蛋白启动子是唯一有困难的,因为富含GC的区域和复杂的二级结构,内含2也许是为了放大和克隆,我们都与STBL4能干细胞,这是不稳定的插入克隆优化的最成功的。即使下面的预防措施,我们经常恢复了突变,其中E。大肠杆菌的基因组DNA插入到构建体的3'末端。当用BamHI(与5.8 kb的和2.8 kb的在正确的克隆)消化这种突变产生约5.8 kb的4 kb的条带,并出现在选择平板上的菌落较大。感受态细胞中,在30℃和小心防止生长培养物达到饱和减少,但不能消除,恢复突变体的可能性。我们建议通过验证限制消化所有的DNA制备和凝胶电泳转染前的纯度。

此筛选方案很容易适应其他的启动子,一d必须作相应的最佳化,利用已公知,以调节靶启动子作为阳性和阴性对照的基因。几个注意事项适用于报告质粒的克隆和转染。当克隆的目标启动子插入荧光素酶报告质粒,该荧光素酶的起始位点应接近靶基因的翻译起始位点。双荧光素酶的屏幕通常是放置在海肾质粒最小启动子的控制下,如HSV-TK启动子,以最小化质粒骨架的影响。然而,我们发现,诱导该启动子我们积极的控件之一,因此,我们选择了CMV启动子。各报告基因质粒的相对量应根据经验来确定,并通过各启动子的组成性活性的影响。理想的基线(转染,但非诱导)荧光素酶计数应至少五到十倍以上背景,从未转染细胞,以允许检测图书馆,A的该压制ÿ基因或引起毒性,这将导致较低的信号。在筛选之前,验证预期的荧光素酶计数落入每个测定法的线性范围内,其可以光度计之间变化。 (请注意,我们的Renilla荧光计数典型地落在我们的测定法的线性范围的上端。)我们发现,增加文库DNA到萤火虫报告质粒的比率导致了较高的导入装置,因此,我们使用该记者的最小量。

转染协议必须优化为好。我们选择了293T细胞对它们的相对容易的转染,其中的效率提高了50倍与另外一个离心步骤(步骤3.5)中。多巴胺能线SY5Y是通过在我们手中100倍少转染的,并且,如上面所讨论的,可能不是最优的用于进行过表达的筛选。我们的最佳检测时间是凭经验确定为48小时,因此我们的细胞接种在低初始密度,必须利用Optifect,它被设计来转染细胞在10-70%汇合的。其它细胞系,可能需要不同的起始密度和不同的转染试剂。我们选择了转染后改变细胞培养基中添加抗生素(这可能会导致中毒,如果目前的转染过程中)。虽然这降低了细菌污染的可能性,它在材料(尤其是机器人枪头)增加了成本,因此该步骤的必要性,应适应这种协议的其他系统时进行评估。萤光素酶测定法可以以最小的优化使用,但在高通量与不同的细胞类型进行该测定之前,验证细胞被的Triton裂解缓冲液中适当地溶解。注意的Triton X-100使腔肠素的自发荧光。在我们的实验中海肾萤光信号强大到足以轻视这种效果,但优化此法用于其它类型的细胞时,限制的Triton X-100的体积为英里所需的细胞裂解nimal量。

我们已经提出了用于识别α-突触核蛋白的新的转录调节剂使用细胞瞬时转染了双荧光素酶报告系统的快速且相对便宜的检查方法。这个协议是很容易地修改,以针对感兴趣的其他基因,并且也可以适用于任何需要高通量的转染,如慢病毒生产23的应用程序。

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Disclosures

这项工作是由发牌BacMamreagents(美国专利5731182)获得特许权使用费的支持。

Acknowledgments

我们感谢在麻省总医院的DNA核心的约翰Darga制备的DNA筛查图书馆。 PerkinElmer公司的克里斯托弗Chigas为我们WALLAC 1420照度计的宝贵支持。史蒂芬Ciacco的和安捷伦的马丁Thomae规定的布拉沃机器人的支持。我们感谢罗恩·约翰逊和史蒂夫·提图斯在NIH慷慨地提供他们的双荧光素酶发光分析方案。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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