Очистка и микроРНК профилирования экзосом полученные из крови и питательных сред

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Наличие устойчивых микроРНК (микроРНК) в экзосомах породила огромный интерес в качестве нового способа межклеточной коммуникации, на их потенциальную применимость в качестве биомаркеров и в качестве маршрута для терапевтического вмешательства. Здесь мы показываем, экзосома очистка от крови и питательных сред последующей количественной ПЦР для выявления микроРНК время транспортировки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Короткие микроРНК некодирующих модулировать экспрессию генов, связываясь с мРНК-мишенью. Семенной комплементарности последовательностей из ~ 7 пар оснований позволяет микроРНК связываются с мРНК-мишенью в результате ингибирования трансляции или к снижению стабильности мРНК, оба из которых могут привести к снижению экспрессии целевого белка 1. Исследования, проведенные за последнее десятилетие однозначно доказала фундаментальную роль микроРНК в обеспечении клеточных функций. Там был также значительные усилия направляются рассекает микроРНК опосредованной молекулярные изменения, лежащие в основе различных заболеваний 2,3. Кроме того, недавняя идентификация стабильного микроРНК в жидкостях организма 4-6 проложил путь к их использованию в качестве новых биомаркеров поддаются клиническому диагнозу.

Один из режимов микроРНК транспорта в жидкостях организма через экзосомах, мелкие пузырьки, которые несут мРНК, белков, липидов посредников, и микроРНК в клетки-реципиента с помощью системного циркулирующей кровииона 7-14. Это приводит к модуляции экспрессии гена в клетки-реципиенты и представляет собой новый механизм сотовой связи. Например, клетки могут модулировать иммунные регуляторные процессы путем секреции и / или поглощающие экзосомы содержащий биомолекул, участвующих в воспалении, такие как интерлейкин-1β (IL1β), фактора некроза опухоли-α (ФНО), трансформирующий фактор роста-β5 (TGFβ5), а также микроРНК, регулирующие эти гены 13. Как аберрантная экспрессия микроРНК является общей чертой в различных заболеваний человека, эти молекулы предлагаем увлекательные новые возможности для открытия и проверки новых терапевтических мишеней 2.

Циркуляционный микроРНК присутствуют во всех биологических жидкостях, и известно, что состав экзосомы отличается на основе источника клеток, из которых они были освобождены. Таким образом, они предлагают путь к изучению физиологического состояния клеток и, как клетки изменяются в сигнализации дажеTS в ответ на стресс, включая заболевания. Изучение изменений в состав экзосома может дать представление сигнала и исследовать их потенциальную полезность в качестве биомаркеров или терапевтическое вмешательство маршрутов.

Здесь мы продемонстрируем очистки экзосом из нескольких источников на основе опубликованных протоколов. Эти экзосомах будет использоваться для выделения РНК последующим кПЦР для выявления и измерения уровней микроРНК присутствуют в экзосомах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием образцов крови у человека и грызунов были выполнены с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов. Человека субъектов были зачислены после дать информированное согласие, утвержденного Drexel University медицинский колледж совета организации и все процедуры исследования, проведенные на животных, были одобрены Институциональные уходу за животными Drexel и использованию комитета.

1. Exosome очистка от крови (~ 5,5 ч)

СОВЕТЫ

  • Мы ресуспендируйте экзосомах из одной пробирки с кровью (~ 10 мл крови человека и ~ 2 мл крови мышей) в 300 мкл буфера для лизиса РНК из набора для выделения микроРНК Mirvana.
  • Для очистки экзосом из клеточной культуральной среде, носитель центрифугировали при 500 х г в течение 10 мин для удаления клеток и фильтровали через 0,22 мкм фильтр после центрифугирования при 12000 х г. Экзосома очистка от среды для культивирования клетокне требует разбавления в ЗФР, PBS стирки или на вторую стадию ультрацентрифугирования.
  • Если очищенных экзосомах будет использоваться для протеомики исследований, добавление центрифугирование в градиенте сахарозы шагом после центрифугирования шаг уменьшения количества белковых агрегатов и загрязнителей 15.
  • Наблюдаемая морфология экзосомы может различаться в зависимости от источника и этапы обработки для ПЭМ. Мы не наблюдали чашеобразных морфологии экзосомах которая была ранее отнесенных на различия в обработке образцов 9,15. Наши ПЭМ-изображения, включая метки антител аналогичны предыдущим сообщениям из различных источников, в том числе крови, желчных и корковых культуры полученные экзосомах 9,16,17.
  1. Инверсия ЭДТА покрытием трубки, содержащей кровь 5x и месте в вертикальном положении при комнатной температуре в течение 10-60 мин.
  2. Центрифуга при 2000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Собирают верхний слой, плазма, в 15 мл пробирок и держать на льду.
  3. Развести жидкость с равным объемом PBS. Центрифугируют 30 мин при 2000 х г при 4 ° С.
  4. Передача в центрифужные пробирки, добавляют 1X PBS в общем объеме 24 мл, и центрифугируют 45 мин при 12000 х г при 4 ° С.
  5. Трансфер в ультрацентрифуге труб и центрифуги 2 ч при 110 000 мкг при 4 ° С.
  6. Ресуспендируют осадок в PBS и центрифугировать 1 часа при 100000 х г при 4 ° С.
  7. Ресуспендируют осадок в соответствующем буфере (РНК буфера для лизиса).
  8. Ресуспендируйте в ФБР или RIPA буфер для электронной микроскопии и вестерн-блоттинга соответственно.

2. Очистки РНК с использованием модифицированного Mirvana набора для выделения микроРНК (~ 1 час)

СОВЕТЫ

  • Подготовить область выделения РНК носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), протирая поверхности и пипетки с РНКазы ун-та, и с использованием стерильных фильтров советы и труб.
  • Добавление в колонку ДНКазы стадии обработки удаляет следы ДНК, которые могут присутствовать. В зависимости от источника экзосом, ДНК, как сообщалось, отсутствуют в экзосомы очищают от некоторых источников, включая человека и мыши мачта клеточных линий 8, но хромосомной ДНК были обнаружены в экзосомы очищают от среды культивируемых кардиомиоцитов 18.
  • Мы сократили объем промывочного раствора 1 до 350 мкл (шаг 2.4 ниже), потому что поставщик предоставляет только достаточно промывочный раствор 1 для одного 700 мкл того. Если объем не уменьшается нет достаточного раствор, оставленный для использования всего содержимого комплекта. Остальные шаги были выполнены в соответствии с рекомендациями производителя.
  1. Добавить 1/10 VOЛуме микроРНК гомогената добавка (30 мкл) и инкубировали на льду в течение 10 мин.
  2. Экстрагируют объем кислота фенол: хлороформ равно начальному объему лизата. Центрифуга и восстановить верхней фазы в новую пробирку.
  3. Добавить 1,25 объемами 100%-ного этанола (375 мкл). Vortex. Применить для фильтрации картриджа и центрифуги 15 сек при 10000 х г.
  4. Добавьте половину рекомендованного объема микроРНК промывочный раствор 1 (350 мкл) и центрифуги 15 сек при 10000 х г.
  5. Добавить 10 мкл ДНКазы 1 до 70 мкл буфера RDD (Qiagen) для каждого образца. Добавить 80 мкл на колонку и инкубировали 15 мин при комнатной температуре.
  6. Добавить промывочный раствор 1 (350 мкл) и центрифуги 15 сек при 10000 х г.
  7. Добавить промывочного раствора 2/3 (500 мкл) и центрифуги 15 сек при 10000 х г. Повторить.
  8. Элюировать 40 мкл 95 ° C нуклеазы без H 2 O.
  9. Определить концентрацию РНК и РНК разбавить до 100 нг / мкл.

3. микроРНК профилирования экзосом от BlooD Использование Taqman низкой плотности Array (TLDA) Карты (~ 6,5 ч)

СОВЕТЫ

  • Подготовить область выделения РНК СИЗ, протирая поверхности и пипетки с РНКазы ун-та, и с использованием стерильных фильтров советы и труб.
  • Предварительно усиления (предварительный усилитель) шаг рекомендуется для 1-350 нг РНК (350-1000 нг образцов не требуют предварительного усилителя шагом после синтеза кДНК). Важно определить, является ли предусилитель необходимо для вашего образца, потому что вы должны относиться все образцы на равных условиях. Предварительный усилитель шаг увеличивает стоимость и Ct значения имеют более низкую приемлемым с разрезом (32 вместо 40).
  • Это полезно подготовить кДНК реакцию в полосе труб вместо тарелки в зависимости от количества карт, которые могут быть запущены в течение одного дня. Это сведет к минимуму замораживания-оттаивания образцов кДНК, которые не будут обрабатываться в тот же день.
  • Экзосомы собранных из разных источников имеет Diff #Аренда количества РНК. Этот протокол позволяет максимум 3 мкл РНК-матрицы для синтеза кДНК реакции. В зависимости от источника, количество экзосомальных РНК, которая может быть выделена, может быть ограничено. В то время как типичный ткани даст достаточно РНК, кДНК, что будет принято от 100 нг РНК в 3 мкл, экзосом из человеческой крови или среды для культивирования клеток, часто содержат менее РНК и ДНК должна быть изготовлена ​​из меньше исходного материала. Экзосомы мышь крови содержат более высокие уровни РНК и по крайней мере 100 нг в 3 мкл может быть получена.
  1. Чтобы подготовить кДНК из РНК с использованием очищенной Megaplex бассейны обратной транскриптазы праймеров (бассейн и пул B содержат праймеры для микроРНК в микрофлюидном карты массива А и В), оттепели компонентов реакции на льду.
  2. Этикетка два РНКаз 1,5 мл пробирки для реакции с RT бассейн или бассейн праймеров B праймеров и добавления компонентов в графике порядке. Добавить по крайней мере один дополнительный объем компонентов для 2 или более реакций или сделать мастер-микс в соответствии с рекомендациями тОн поставщика.
RT компонент реакции Компонент Концентрация Объем для 1 выборки (общий V / образец = 4,5 мкл)
Нуклеазы без воды 0,20 мкл
Megaplex RT буфера (10x) 1X 0,80 мкл
дНТФ (100 мМ) 4,4 мМ 0,20 мкл
MgCl 2 (25 мМ) 5 мМ 0,90 мкл
Ингибитора РНКазы (20U/μl) 2 U 0,10 мкл
Megaplex RT Праймеры А или В (10X) 1X 0,80 мкл
MultiScribe обратной транскриптазы 75 U 1,50 мкл
  1. Инверсия трубы 6 раз, и процентаrifuge кратко. Затем пипеткой 4,5 мкл реакции RT смесь в MicroAmp 8-пробирок полосы или 96-луночных MicroAmp оптическая пластина реакции.
  2. Добавить 100 нг РНК и отрегулируйте громкость до 3 мкл DEPC обработанной воды, добавляют 3 мкл общей РНК, перемешать с кончика пипетки, и запечатать трубы или пластины. Спин кратко и инкубировать на льду в течение 5 мин.
  3. Загрузите реакции в машину ПЦР и запустите его при следующих условиях (в соответствии с рекомендациями Applied Biosystems протокола Megaplex бассейны):
Этап Температура Время
Цикл (40x) 16 ° C 2 мин
42 ° C 1 мин
50 ° C 1 сек
Держать 85 ° C 5 мин
Держать 4 ° C
  1. КДНК хранить при -20 ° С (хорошо, по крайней мере одной недели) или продолжать предварительного усилителя шаг, который можно хранить в течение одной недели.
  2. Оттепель предусилитель праймеров для бассейна и пул B на льду и инвертировать перемешать. Swirl Taqman предусилителя Master Mix и держать на льду тоже.
  3. Последуйте за диаграммой добавление по меньшей мере одного дополнительного объема компонентов для 2 или более реакций или сделать мастер-микс в соответствии с рекомендациями поставщика.
Предусилителя компонент реакции Объем образца в течение 1
Нуклеазы без воды 7,5 мкл
Taqman предусилитель Mix Master (2х) 12,5 мкл
Megaplex предусилитель Праймеры А или В (10X) 2,5 мкл
  1. Внесите 2,5 мкл RT произвоКТ в MicroAmp 8-пробирок полосами или 96-луночных MicroAmp оптическая пластина реакции и обойтись 22,5 мкл предусилитель реакционной смеси в каждую лунку.
  2. Печать пластины, инкубировать на льду 5 мин, а затем загрузить образец в машине ПЦР. Запуск при следующих условиях.
Этап Температура Время
Держать 95 ° C 10 мин
Держать 55 ° C 2 мин
Держать 72 ° C 2 мин
Цикл (12x) 95 ° C 15 сек
60 ° C 4 мин
Держать 99,9 ° C 10 мин
Держать 4 ° C
  1. После предусилителя окончания реакции кратко центрифуги трубы или пластины, а затем добавить 75 мкл 0.1X TE рН 8,0 в каждую лунку или трубки.
  2. Печать и смешайте и спина кратко. Хранить разбавленный продукт в течение одной недели при температуре -20 ° С или продолжать загружать пластины.
  3. Смешайте следующие в РНКаз 1,5 мл трубки на льду.
Компонент Объем карты в течение 1
Taqman Universal PCR Master Mix, нет AmpErase UNG (2x) 450 мкл
Разводненная предусилитель продукта 9 мкл
Нуклеазы без воды 441 мкл
  1. Переверните пробирку, чтобы смешивать и центрифуги кратко. Внесите 100 мкл ПЦР смеси в каждом порту массива карты Taqman микроРНК.
  2. Центрифуга карта 2 х 1000 мкг в течение 1 мин. Закройте карту и запустить ее с помощью шаблона, представленного с праймерами в Applied Biosystems ручных и 384 хорошо Taqman Низкая плотность массива параметров. Мы используем Прикладная биосистем 7900HT Быстрая Real-Time PCR System.

4. мРНК Анализ Taqman (~ 1,5 ч)

  1. Для подготовки кПЦР реакции, смешайте компоненты реакции в порядке, в графике. Все образцы будут проанализированы с праймером зондов для представляющего интерес гена, а также 18S рРНК нормализатор гена.
Taqman компонент реакции Объем образца в течение 1
Нуклеазы без воды 7 мкл (корректировки на основе отдельного образца)
Быстрый Taqman Master Mix (2x) 10 мкл
Taqman Primer зондов (20x) 1 мкл
кДНК из 100 нг РНК 2 & му, L (корректировки на основе отдельного образца)
  1. Выполнить 96-луночный планшет использовании функций быстрого 96-а блока в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems 7900HT Быстрая Real-Time PCR System).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После выделения экзосомы с носителя крови или культуры клеток, чистота экзосомы может быть проверена с помощью электронной микроскопии (ЭМ) и вестерн-блоттинга (фиг.1А и 1В). Мы подтвердили нашу экзосома препаратов из различных источников с Е. М. и вестерн-блоттинга с использованием нескольких антител. 1а представлены EM изображения, подтверждающие, что экзосомах целы диаметром ~ 30 -100 нм и содержат CD81 на метки антител. Обычно используется экзосомальных маркеры Hsp70 и tetraspannin семьи гликопротеинов CD63, CD81 и CD9 14. После подтверждения целостности очищенных экзосомах был проведен Вестерн-блот для Hsp70 на фиг.1В и показали, что экзосомы содержать Hsp70 в то время как только среду (отрицательный контроль) нет. Bioanalyzer следа показывает, что экзосомах изолированы от RAW среды для культивирования клеток содержат различные РНК, но не содержат большое количество рибосомной РНК, которые являются характерными для РНК из цельнойячейки (рис. 1в). Рисунок 1D показывает количественной ПЦР анализ мРНК из цельной крови и экзосомы полученные из крови. Мы можем выделить 500 нг экзосомальных РНК из ~ 10 мл крови человека Mirvana использованием набора для выделения микроРНК. Количественной ПЦР результаты указывают на присутствие мРНК, кодирующих ФНО и фактора роста эндотелия сосудов (VEGFA) в очищенных экзосомах а также в цельной крови.

В дополнение к кПЦР для изучения экспрессии генов, общей РНК была также использована для микроРНК профилирования. МикроРНК TLDA карта версии 3.0 содержит праймер зонды для ~ 758 микроРНК в том числе эндогенного контроля РНК U6. С добавлением предварительной стадии амплификации, производитель рекомендует 30 нг РНК для запуска карты TLDA. Это полезно для анализа РНК из экзосомы очищали от сыворотки или крови человека, которые обычно имеют более низкими выходами, чем те, очищают от крови мышей. МикроРНК анализа показано на рисунке 2 проводили с 250 нг РНК из крови мышейэкзосомах и 15-30 нг экзосомальных РНК из человеческой крови или клетки эндотелия аорты человека (HAOEC). Полученные результаты указывают на присутствие 89 микроРНК в экзосомы собраны из крови мышей, 209 микроРНК в человеческой крови экзосомы и 199 микроРНК в экзосом из человеческой среды для культивирования клеток. Репрезентативные данные в течение шести микроРНК показан как дельта Ct значение нормированной на эндогенный U6 РНК для борьбы с грызунами крови (2А), человеческой крови (Фиг.2В) и HAOEC культуры клеток (фиг. 2С). В то время как микроРНК-126 и микроРНК-200c отсутствовавших в экзосомах из крови грызунов или HAOEC СМИ соответственно, остальные четыре микроРНК присутствуют во всех трех образцов в различных количествах. Относительно экзосомах очищают от среды для культивирования клеток, Мир-223 выражается в более высоких уровнях в экзосомах от человека и грызунов образцы крови.

Рисунок 1
Рисунок 1. Трansmission электронной микроскопии (ПЭМ), Вестерн-блот анализа и QRT-PCR мРНК для использования экзосомы очищенный из различных источников. А) ПЭМ изображение крови мышей экзосомы ресуспендировали в 1% глутаральдегида (слева) или RAW клеток, полученных экзосомы ресуспендировали в 4% параформальдегид, меченные 10 золото нм и кролик-анти-CD81 (справа) и наносили на формвара покрытые углеродом сетки для EM . анализа (масштаб = 100 нм) б) анализ западных HSP70 в экзосомах очищают от крови мыши или экзосома среде, свободной от + / -. 24 ч инкубации с RAW 264.7 клетках мышей и ресуспендировали в буфере RIPA C) Bioanalyzer анализ общей РНК очищают от экзосомах полученных из RAW 264.7 культуры клеток D) Всего РНК очищали от цельной крови и экзосомах получены от представителя человеческого контроля был использован для сравнения уровня экспрессии ФНО и VEGFA. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 2
Рисунок 2. Относительная экспрессия микроРНК фракция найти в экзосомы. Пороговый цикл (CT значение) является относительной мерой концентрации отдельных микроРНК в реакции ПЦР и нижней КТ значение указывает на более высокую экспрессию. кПЦР значения для шести обнаруживаемых экзосомальных микроРНК были нормированы на U6 РНК и дельты Ct значения графически для экзосомах из трех источников. Отрицательное значение указывает на более высокую экспрессию в эту цифру. Exosomes от грызунов крови (А) и человеческой крови (В) выражается HSA-микроРНК-223 на более высоком уровне, чем в контрольной, а экзосомы от HAOEC культуры клеток (С) выражается HSA-микроРНК-223 на более низком уровне, чем контрольные. Hsa-MIR-226 отсутствовал экзосомах грызунов крови и HSA-MIR-200c отсутствовал HAOEC экзосомах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе, мы покажем количественное микроРНК и мРНК из экзосомах очищают с помощью дифференциального центрифугирования из крови и питательных сред. Экзосомы имеют различные компоненты в зависимости от их происхождения и участвуют в ряде биологических функций, в том числе иммунного ответа, презентации антигена, внутриклеточные связи и передачи РНК и белков 9,11,12,19,20. В то время как размер и форма является детерминантой экзосома чистоты, число работ, показывающий EM экзосом данные показывают, что эти пузырьки могут варьироваться по размеру и морфологии на основе источника, из которого они выделяются, а также метод, используемый для фиксации и визуализации девять , 15. Принимаются размер экзосомы 30-100 нм составляет в среднем диапазоне, который включает в себя небольшой популяции экзосомы с большим диаметром в зависимости от источника 21,22, одна причина того, что несколько методов используются для проверки экзосомальных чистоты. Секретируемая микроРНК есть много необходимых FeaturES хорошего биомаркеров 23 в дополнение к тому, потенциальные терапевтические цели при различных заболеваниях 2,3,24. Этот способ очистки обеспечивает неинвазивный способ охарактеризовать временные биологические изменения в экзосомальных содержания из различных жидкостях организма в то время как микроРНК профилирования кПЦР содержит всесторонний обзор микроРНК содержание 2. За 4500 белков, мРНК, 1639, 764 и 194 микроРНК липиды, как известно, ассоциируется с экзосомы 25 ( www.exocarta.org ), а в некоторых случаях, изменения уровней этих биомолекул уже было связано с заболеванием. В наших исследованиях, экзосомах очищают от человеческой крови было много микроРНК общего с экзосомах очищают от средств массовой информации из культивируемых клеточных линий человека, но существенные отличия от экзосомальных микроРНК найден в крови мышей. Хотя есть примеры, микроРНК, которые нацелены только одна мРНК, многие микроРНК функционировать частично снизить уровни MULTIPле цели приводит к сильному физиологическую реакцию. Характеризующих как мРНК и микроРНК, которые находятся в экзосомах предоставляет уникальную возможность заглянуть в экзосома-опосредованной передачи информации и роль микроРНК циркулирующих в посредничестве изменения в экспрессии генов. Очистка и характеристика экзосом из различных источников, может быть полезным в идентификации молекулярных подписей, связанных с этими секреторные пузырьки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке за счет средств от Риты Аллен грант Фонда Seena Аджит. Авторы хотели бы поблагодарить Эрика Балога и доктор Soumitra Ghoshroy из Университета Южной Каролины электронной микроскопии Центр инструмента использования, научно-технической помощи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  2. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  3. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
  4. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
  6. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
  7. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
  8. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
  9. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  10. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
  11. Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. (2011).
  12. Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
  13. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
  14. Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
  16. Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
  17. Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
  18. Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
  19. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
  20. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
  21. El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
  22. Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
  23. Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. (2011).
  24. Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
  25. Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).

Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics