听话的哺乳动物细胞原生动物引发的细菌感染

Published 4/02/2013
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Immunology and Infection

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Summary

这种技术提供了一种方法来收集,标准化和量化,自然原虫的宿主细胞培养的哺乳动物细胞感染前细胞内生长的细菌病原体。此方法可以被修改,以适应各种各样的起动阶段,以及靶细胞类型的宿主细胞。

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Drennan, S. L., Lama, A., Doron, B., Cambronne, E. D. Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria. J. Vis. Exp. (74), e50300, doi:10.3791/50300 (2013).

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Abstract

许多细胞内的细菌病原体使用淡水原生动物作为一种天然水库增殖的环境中。退伍军人肺炎的病原体,获得了嗜肺军团菌 ,当第一次收获之前感染的哺乳动物巨噬细胞的原生动物细胞在体外培养的细菌的致病性优势。这表明可能无法正确地在体外表达,重要的毒力因子。我们已经开发出一种易于处理系统吸L.肺通过其自然的原生主机棘阿米巴castellanii之前哺乳动物细胞的感染。任何毒力因子的贡献可以被检查原生动物吸后,通过比较的突变株的细胞内生长的野生型细菌。表达GFP的野生型和突变型L。杆菌菌株用于感染原生动物的单分子膜在一个起动步骤,并允许达到的细胞内生长的后期。荧光的细菌从这些受感染的细胞,然后收获归一分光光度法产生相当数量的细菌到哺乳动物的巨噬细胞的继发感染。对于定量分析进行监测,活菌感染后,用荧光显微镜,流式细胞术,通过菌落镀敷。这种技术强调和依赖于宿主细胞相关的基因表达,通过模仿的环境,会遇到一个自然的收购路线的贡献。这种方法可以被修改,以适应使用媒介主机的任何细菌,作为一个装置,用于获得的致病优势。

Introduction

大量的细菌病原体已经适应了广义的策略,利用宿主细胞,在细胞内生存和复制。在许多情况下,致病机制原生动物和后生动物的细胞之间的相似。然而,这两个微环境是非常不同的,并可能导致在毒力因子的差异表达1-4。退伍军人症细菌嗜肺军团菌广泛存在与世界各地的淡水环境5。更重要的是,L.原生动物细胞培养在感染的人类单核细胞中获得的致病优势之前,表明全局基因表达谱的退出原生动物细胞的细菌在体外培育生物体6-8比是不同的。在自然界中,淡水变形虫快速扩增细菌入侵提供营养丰富的局限。人类收购L. pneumophILA是最常见的吸入受污染的水含有细菌的水滴,。这很可能是这些水滴港口原生动物细胞相关的细菌,原生动物细胞更耐常规水处理的做法9,10。感染的肺泡巨噬细胞原生动物宿主细胞11-13中的细菌的细胞内的生命周期几乎相同的方式进行。

为了生存,并在真核细胞中复制,L.肺使用一个专门的IVB型分泌系统,称为点/ ICM提供近300'效应蛋白进入宿主细胞的细胞质中14-16。这些效应蛋白统称颠覆细胞过程中,为了产生一个复制许可为细菌的隔室17,18的功能。在任意的26个基因,包括在细胞内的多个缺陷的菌株的Dot / Icm的转运结果删除iplication 19日至23日 。从历史上看,删除的个体效应编码基因很少株弱毒细胞内生长。这种现象被归结为几种假说的效应,包括冗余的功能和同源的副本。

有些毒力因子只表示的上下文中的宿主细胞相关的细胞内生长24。我们合理化,如果一个特定的效应,只表示的上下文中的原虫感染,然后的效应的贡献可能不能的野生型菌株相比,当两个进行体外培养。嗜肺军团菌的复制转换透射阶段进入稳定期文化25。相开关型过程中遇到的细胞内生长的养分消耗,,通过组装鞭毛活力26的例子。由于L.肺是INVA西伯和原生动物细胞致命的收获时,我们寻求发展的分析,更忠实地代表了致病状态,当它遇到的细菌宿主巨噬细胞。

为此,我们开发了一种多用途的的原生动物吸试验,可以适应任何合适的宿主同时为第一(涂刷细胞)和第二阶段(靶细胞)感染。通过使用稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细菌感染的过程中易于处理。原生动物棘阿米巴castellanii感染模型如下的字段27中广泛使用的一种方法。对于吸步骤,L.杆菌菌株在体外培养,以在液体介质中的固定相,以产生标记为“透射”细菌( 图1A)。接下来,细菌感染单层A. castellanii 18小时来实现的细胞内的生命周期的后期阶段。大液泡包含ING细菌可以被可视化,在该时间点,使用荧光显微镜( 图1A)。原生动物细胞,然后裂解,从裂解物中回收的细菌测定使用荧光板读数器在512 nm的发射。荧光光密度与多重性感染(MOI)感染的靶细胞( 图1,*的相关性曲线)来计算。入侵后(T 18)入侵(T 0),18小时后,靶细胞的荧光定量,代表细胞内的细菌。可以监视荧光显微镜和流式细胞仪,活菌数可通过殖民地电镀测量。吸分析总是伴随着感染与野生型L.肺的Dot / Icm的IV型分泌系统(ΔDOTA)( 图1A)中的缺陷的菌株。重要的是提供内部控制之间的直接比较野生型aND任何等位基因突变株在感染过程中使用。在起动阶段期间的无毒ΔDOTA应变列入设置观察衰减等基因突变株, 在体外培养生长的表型相关的一个阈值。

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Protocol

1。引发阶段感染嗜肺军团菌文化制备

  1. 将所有L.肺用质粒pAM239在测定中使用的菌株,编码的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的绿色荧光蛋白(GFP)28。条纹到铁和半胱氨酸的细菌菌株补充缓冲木炭酵母提取物琼脂(实业家)含有6.25微克/毫升氯霉素(CM)(用于质粒维护),并孵育72 N-(2 -乙酰氨基)-2 -氨基乙磺酸(ACES)小时,在37°C。
  2. 转移的种菌的菌株成补充ACES缓冲与6.25微克/毫升CM和1mM IPTG的酵母提取物肉汤(AYE),培养在37℃下固定相(O / N)在轨道摇床
  3. 确认在体外培养物中,使用荧光显微镜的GFP表达。盖下培养10微升转移到载玻片上单和图像,使用60X与GFP激发/发射立方体(AMG EVOS佛罗里达州)的目标。
  4. 稀释100微升等分每个体外培养至1:10使用无菌H 2 O。用1mM IPTG和6.25微克/毫升厘米和水作空白用100μlAYE的媒体。以OD600值测量的稀释液用分光光度计(Bio-Rad公司智能规格加)。必要计算其体积,以MOI = 20感染的以及为每个在体外培养中:V = [(阿米巴种子)×MOI] / [OD 600×(稀释倍数)×(常数)] = [(1×10 6个 )×(20)] / [OD 600×(10)×(1×10 6)] = 2/OD 600。浓度的细菌被确定为OD 600 = 1.0 = 1×10 9 CFU /毫升。

2。感染棘阿米巴castellanii的引发阶段

  1. 维护和ATCC 712 PYG培养基中的变形虫在175厘米2瓶中,在室温下培养。
  2. 更换介质变形虫尽头Tures的前24小时开始的细菌液体培养。就在同一天液细菌培养,收集和使用血球计数仪,光镜下细胞计数。
  3. 变形虫用新鲜培养基稀释至终浓度为1×10 6细胞/ ml。种子的12孔细胞培养板中,用1​​毫升等分的阿米巴使用一个repeat移液器并孵育在RT下的O / N。
  4. 孵育后,洗3倍与1毫升无菌PBS中,使用了10毫升血清移液管和一个手动移液管辅助的12孔细胞培养板的孔中。
  5. 抽吸的PBS后,加1ml的感染介质(ATCC 712 PYG媒体减去葡萄糖,蛋白胨,酵母提取物),用1mM IPTG和6.25微克/毫升cm到每个孔中。在RT下孵育板1小时。
  6. MOI = 20感染井。离心板400×g离心5分钟(Eppendorf公司5810R)和漂浮在37℃水浴5分钟。转移板在37℃,5%CO 2的培养箱中培养18小时。
  7. 使用活细胞成像在荧光显微镜下的细菌宿主细胞裂解和收获之前确认的感染。

3。播种THP-1细胞为靶细胞阶段感染

  1. (这个过程开始前24小时,液细菌培养)。 75 cm 2的培养瓶中近会合在与10%热灭活的小牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养THP-1细胞。
  2. 使用血细胞计数器计数悬浮细胞,含10%FBS和100 ng / ml的佛波醇-12 -肉豆蔻酸酯-13 -乙酸酯(PMA)的浓度为1×10 6细胞/ ml THP-1细胞在RPMI 1640培养基稀释,并在1毫升的等分试样在12孔细胞培养板的板。孵育48小时的板在37℃下,5%CO 2。

4。目标细胞阶段感染,细菌感染的起动阶段后处理

  1. 吸取媒体的引物变形虫。
  2. 裂解一moebae使用500μl的冰冷,无菌超滤(UF)H 2 O和孵育在室温下10分钟。
  3. 普尔的裂解物,根据应变类型和采取的E 512 nm的测量为每个池的溶胞产物用荧光板读数器(Molecular Devices公司酶标仪双子座EM)。
  4. 计算OD 600项测试的汇集裂解calcOD 600 = 0.0008(E 512 -裂解背景)+ 0.0019。预先确定的公式,通过图形的直接比较的OD 600和E 512 nm的测量稀释的L.肺野生型表达绿色荧光蛋白, 在体外培养固定相( 图1)。裂解物的未感染的变形虫,受到相同的实验条件下,受感染的变形虫,作为空白,并提供了一个修正值( 例如,溶胞产物的背景),将其纳入方程。所需的体积吨ò感染在阱的MOI = 20时为每个溶解物游泳池计算:V = [(THP-1种子)所述MOI] / [calcOD 600×(常数)] = [(1×10 6)×(20)] ,/ [calcOD 600×(1×10 6)] = 20 / calcOD 600。
  5. 在THP-1细胞的3倍,用PBS洗净,向每孔加入1毫升的新鲜RPMI 1640培养基(10%FBS)。孵育THP-1细胞,在37℃下1小时,5%CO 2。
  6. 感染的THP-1细胞,在所计算出的MOI使用汇集的溶胞产物。允许一组井保持感染,作为流式细胞分析的阴性对照。应在不到30分钟内完成处理的起动阶段。裂解液置于冰上,感染前,以限制任何细菌基因表达的变化。
  7. 离心板,浮动,以提高温度和孵化,在起动阶段。
  8. 感染后一小时,取出媒体的愿望和3次PBS删除胞外细菌,洗井。
  9. 加入1毫升频率sh的RPMI 1640培养液(10%FBS),井和返回板的培养箱。后立即更换媒体的时间作为时间零点(T 0)。孵育14-16小时的THP-1细胞在37℃下,5%CO 2。

5。实验分析

5.1活细胞成像

图像受感染的井用荧光显微镜(AMG EVOS佛罗里达州)10X或20X放大倍数( 图1A-D)。这些图像可以被定量或定性的比较,以确定在起动阶段和靶细胞阶段感染感染水平。

5.2流式细胞仪

  1. 可以比较流式细胞仪(BD FACS刀魂)的发射峰不同的感染。 Trypsinize受感染的THP-1细胞,并从孔中通过在PBS中混合,用移液管轻轻地清洗。
  2. 游泳池的应变类型的细胞15毫升Falcon管和球团在1800 XG 2分钟在台式离心机。
  3. 暂停颗粒在1毫升PBS,并转移到1.5 ml离心管中。
  4. 为1800 X G(Eppendorf公司5424)和离心悬浮液,重新悬浮于1ml PBS颗粒。如果所得到的悬浮液高度浑浊(≥1.0的OD 600),他们必须额外PBS(1:3)稀释,在流式细胞仪中的线,以防止堵塞。
  5. 使用无菌过滤PBS平衡的流式细胞仪和洗涤步骤之间的样品进样。绘制的正向/侧向散射未受感染的靶细胞的靶细胞感染样品注射之前。
  6. 收集20000事件总数为每个条件使用488 nm激光激发和FL1通道。
  7. 栅极捕获后的细胞群,以排除未感染的细胞和情节在直方图中的荧光强度(FlowJo)( 图1E)。

5.3 CFU电镀

  1. 检查的效率of感染CFU电镀流式细胞收获细胞。准备样品的系列稀释液在超过滤的H 2 O在10 -1,10 -2,10 -3。
  2. 板20μl的每个稀释到1/3的实业家板与6.25微克/毫升CM。
  3. 板在37℃下孵育72小时。
  4. 用牙签和细胞计数器计数的殖民地。

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Representative Results

为整个感染过程的一个典型的结果是在图1中概述。活细胞的荧光显微照片描绘单层A.castellanii感染野生型L。肺在起动阶段,在图1A中所示。一个成功的措施的起动步骤会导致人口的约90%的宿主细胞中含有大量空泡人口与绿色荧光蛋白标记的细菌在此MOI。在感染后18小时,A. castellanii细胞,细菌负荷达到最大,但裂解的人口是最少的。在光学显微镜下,一个成功的圆润,分离,吸感染,就会发现变形虫。庆大霉素[25微克/毫升],可以添加到培养基中的30分钟至1小时后感染消除的贡献的胞外细菌。该ΔDOTA突变株,它不能支持点/ Icm的介导的效应的易位,不应该生长在“A. castellanii,”虽然在体外培养应荧光以及作为野生型菌株,最小荧光应检测该菌株在感染后18小时。变形虫会出现平坦和单层应该是完好的。

总裂解窝藏L.肺和宿主细胞碎片立即进行分光光度分析,以计算样品中的细菌浓度。 MOI的相关曲线( 图1)可以计算出使用。靶细胞必须做好准备,感染等,引物的细菌裂解后,用不到30分钟,以保持完整的基因表达图谱。一旦感染靶细胞的培养14-18小时才处理。荧光显微镜在图1B显示的致病原生动物野生型引物L.收购的优势肺军团菌的感染靶细胞阶段A. Çastellanii时相比, 体外培养感染前被限制相同的应变。靶细胞的阶段感染是不太可靠的,比起动阶段,由于洗涤步骤1-2小时后感染(靶细胞而定)列入。这种介质的更换步骤删除非侵入性细菌,在随后的应用程序同步的感染和降低背景荧光。 图1C-D演示了一个典型的野生型L.荧光显微镜两阶段感染的情况下,细菌通过感染A.做好准备castellanii从溶解原生动物细胞,收获的,量化的使用的相关曲线,并用于感染的THP-1巨噬细胞14小时。

显微镜后,将细胞用胰蛋白酶消化流式细胞(BD FACS刀魂)。未受感染的细胞被用于校准用于正向和侧向散射光的机器。每一株的感染是过程用20,000条事件记录。 FlowJo 7.6.1软件是用来分析的原始数据。通常情况下,第一个绘制荧光(488 nm激发)对侧向散射光,以确定未受感染的细胞群的背景荧光。图门控排除人口和重新绘制的直方图总计数与荧光强度。因为每个细菌细胞代表的单元的信号强度的荧光,给出了一个表示每个感染细胞的空泡载荷。 图1E中示出的野生型感染的典型的图。总体而言,由流式细胞仪检测感染的细胞的相对数量是低于预期的比较时,用显微镜数据。活细胞流式细胞仪是不够敏感,但是检测应变差异。

通过生成用于流式细胞仪和随后的电镀的系列稀释液制备的细胞总CFU的样品中进行的量化在实业家媒体。 72小时后,在37℃,单个菌落应该是明显的,和稀疏足够用于计数。

图1
图1。原生动物吸和靶细胞阶段嗜肺军团菌感染。 A.野生型或IV型分泌缺陷(ΔDOTA)L。杆菌菌株被诱导表达的GFP通过在体外培养(小帧),并用于感染A. castellanii单层18小时,MOI = 20。荧光显微镜的感染与每个L.杆菌菌株示(大的帧)作为合并的相衬和E用20X物镜上的荧光显微镜(AMG EVOS佛罗里达州),512 nm荧光图像。绿色新月代表细胞内vacuolesharboriNG L.肺 。B. GFP荧光显微镜,18小时感染靶细胞阶段A. castellanii与野生型L。肺收获的的原生动物吸阶段感染(上图),或在体外培养的(底部),其中MOI = 10,为每一个从相关曲线(蓝色)所示的方程来计算。曲线产生使用串行稀释的野生型L。肺表达绿色荧光蛋白在体外培养18小时。C.荧光显微镜的起动阶段感染A. castellanii与野生型L。肺 (A)。D.荧光显微镜照片了14小时的靶细胞阶段感染的PMA分化的THP-1巨噬细胞与野生型L。肺收获从原生动物吸阶段感染中,在(C)。使用相应的公式推导计算MOI = 20关系曲线如图(蓝色*)。所示的帧是一个合并的相衬和E512纳米荧光图像(A)。E.直方图情节流式细胞仪数据比较未受感染的THP-1的巨噬细胞(红色)和感染的细胞与原生动物浸过水的野生型L。肺 (绿色)。比例尺= 100微米。 点击这里查看大图。

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Discussion

细菌基因表达被严密控制的生命周期的进展和响应周围的微环境中的信号通过一个组合。液泡的病原体,如L.肺应对多种宿主细胞衍生的线索条块中的吞噬体时。由于在宿主细胞中的营养耗竭集体结果,细菌随后的宿主细胞,25表示成功传播所需的因素进行补偿。L。肺适于有效地寄生原生动物细胞各种各样的,因此窝藏效应蛋白的一个广泛的目录来驱动此过程。这些效应蛋白易位到宿主细胞质直接在感染过程中,由点/ Icm的类型IVb族分泌系统16。效应蛋白转运是必需的,完全废除,结果在一个有缺陷的转运在任何宿主细胞类型的细胞内生长的突变。古玩自动化个人在特定效应蛋白缺失很少导致细胞内生长衰减。近300个效应蛋白,近10%的蛋白质编码基因已被确认为点/ ICM基板14,15。出现了几种假说解释缺乏可观察的表型效应缺失,包括存在的同源拷贝或横向收购的同源酶产生的寄主范围广,L.肺

由于L.肺获得的致病性上的优势,,预培养在原生动物细胞( 图1A-B),我们的理由是, 在体外培养的细菌不会显示相同的基因的表达谱明显,在细菌退出原生动物主机。因此,只可被诱导表达的特定的效应蛋白的上下文中的原生动物细胞中的细胞内生长。如果一个特定的电子诱导效应是不在一个传统的感染情况下, 在体外培养 XPRESSION删除的效应的贡献,比不能被有效评估。感染或传播的建立重要的毒力因子的表型,将仅可检测到在长时间允许细胞至细胞传播的感染。因此,我们寻求开发一种检测顺序的感染的上下文中,可以测量潜在的毒力因子的贡献。在的情况下,自然L.肺收购,它是一个人的主人可能会遇到的细菌,原生动物感染的细胞已进入角色,原生动物可以更耐传统的市政污水处理做法10。

为了优化的部分纯化的足够数量的浸过水的细菌中,我们首先建立了视觉上易于处理的应变L.肺用IPTG诱导型绿色荧光蛋白基因 ü唱的GFP基因的质粒传播的副本。我们还产生一个单拷贝的染色体插入IPTG诱导GFP融合的野生型的基因组上。虽然这两个菌株的荧光在体外和在感染过程中,产生的高拷贝数的质粒传播的gfp在测定中的下游应用的足够的信号。我们建立了用肉汤培养L.肺在MOI = 20就足够了严重感染A. castellanii单层。温育18小时的,被确定为最优的可视化不到达宿主细胞溶解( 图1A)的一个阶段的情况下的大荧光空泡。不遵守原生动物单层细胞培养塑料,洗涤步骤,因此容易受到影响。 12孔细胞培养板生产最稳定的单分子膜相比,与其他船只(6或24孔,10厘米盘)。由于L.不能生长在感染液在日Ë吸步骤,我们选择了放弃任何清洗的步骤,以去除细胞外的细菌。这极大地提高了在单层感染变形虫的收率。庆大霉素也经常被用来杀死细胞外的细菌。我们发现原生动物的毒性效应浓度超过25微克/毫升,在18小时,从起动阶段感染细菌总数没有发现任何差异。裂解的原生动物细胞单层被执行与冰冷的超过滤的H 2 O,一种溶剂,渗透损害宿主细胞而不伤害L.肺 。如果适于使用的病原体,并不稳定的H 2 O,0.1%的Triton X-100的PBS可以具有相似的结果,用于裂解阿米巴。

为了直接比较应变应变在随后的靶细胞感染的差异,一个方程产生细菌在600nm处的光密度值关联的GFP荧光发射在512 nm(FIGURE 1 *)。我们选择使用荧光发射作为一个装置,用于量化由于OD 600测量从真核细胞的细胞裂解物中的宿主细胞碎片的大的贡献。如此高的背景下观察到的排放可以忽略不计值,在512 nm从相同的裂解对比。值OD 600 = 1.0 = 1×10 9 CFU /毫升,预定为L.菌 ,细菌浓度的计算允许在宽范围内的荧光值。许多有机体已建立CFU值OD 600 = 1.0,这样就可以让应用此技术通过产生基于荧光发射的相关曲线的任何其他病原体。我们选择原生动物细胞的裂解过程中避免了细菌的纯化步骤,以1)的产率最大化浸过水的细菌可用于靶细胞感染,和2)收获和随后的感染之间的时间最小化,维护全球基因表达式patterns。

在体外培养的野生型L.肺在1 mM IPTG诱导表达GFP 18小时。此培养物的系列稀释液被用于分光光度法测量。使用的方程,靶细胞感染进行常规变量MOI的,一致的输出。的MOI 10产生的大约1/2总相比接收MOI为20( 图1A-B)感染时,感染的细胞的数目。我们已经测试了三个目标A.细胞宿主与分析; castellanii,鼠J774巨噬细胞和人类PMA分化的THP-1巨噬细胞。在每个实例中,将所得的感染是从来没有在同一MOI( 图1C-D)作为涂刷感染那样健壮。我们确定,一个额外的洗涤步骤在目标细胞阶段感染,进行两个同步的靶细胞的感染和减少胞外细菌,是分别为这个观察onsible。不过,至关重要的是,该实验是内部控制起动和靶细胞阶段感染与野生型菌株。在吸步骤恢复的细菌数量而限制继发性感染,因此应该使用每个实验只有一个单一的靶细胞类型。

定量的靶细胞感染,在该测定中使用以下三种方法来实现。荧光显微镜用20倍的目标。图片空泡窝藏L.肺人工计为每个应变测试的几个领域。流式细胞仪分析的差异在总细胞感染,以及作为一个近似空泡负载提供了一种敏感的措施,其中较高的荧光信号与GFP信号的贡献,从越来越多的L。肺细胞。连续稀释电镀总数的量化值CFU每卷流式细胞仪收集细胞样品。总的来说,这些方法允许在一个连续的感染情况完全听话的,可量化的结果。

的起动加油测定是相当灵活的,适合于适应使用淡水原生动物作为环境中间29,3任何细菌病原体。靶细胞的选择,可满足特定病原体的感染途径,以适应自然。更重要的是,一个连续的感染模型可以被用来检查没有出现在一个传统的的感染模型使用在体外培养的细菌的生长表型的突变菌株。假定的毒力因子在体外培养的细菌转录谱,可以发现在配置文件中表达的差异,在受感染的中间宿主。这可能会打开一个新行调查的未知蛋白的功能和所作出的贡献自然感染途径。

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的金融利益。

Acknowledgements

我们感谢克雷格·罗伊博士和博士达里奥·赞博尼提供的模板原生动物细胞感染。我们感谢贾格迪普Obhrai博士,博士乔治安娜·珀迪,弗雷德·赫夫龙博士和托德·威斯纳设备和试剂;露露罗纳博士的手稿严格审查。流式细胞术在OHSU的流式细胞仪共享资源设施。这项工作是支持的,由俄勒冈州医学研究基金会和美国国立卫生研究院授予R21 AI088275(EDC)的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 antibiotic
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
ACES Sigma A9758-1KG media component
ATCC medium: 712 PYG ATCC growth media for protozoans
1X PBS Fisher Scientific SH30256FS phosphate buffered saline
activated charcoal Fisher Scientific C272-212 media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 media component
peptone BD Diagnostics 211677 media component
agar Fisher Scientific BP1423-2 media component
L-cysteine, 99%+ Acros organics 173601000 media supplement
Ferric nitrate nonahydrate Fisher Scientific I110-100 media supplement
Equipment
EVOS fl AMG EVOS fl fluorescence microscope
Smart Spec Plus Bio-Rad 170-2525 spectrophotometer
5810 R centrifuge Eppendorf 22627023 bench top centrifuge
Repeater plus Eppendorf 22230201 repeating pipette
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices microplate reader
Softmax Pro 5.3 Molecular Devices 0200-310 microplate reader software
5424 microfuge Eppendorf 22620401 table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II Scienceware 379111010 pipette aid
FACS Calibur BD Bioscience flow cytometer
FlowJo 7.6.1 FlowJo license flow cytometery software
15 ml tube BD Falcon 352096 polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube Neptune 3745.X microcentrifuge tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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