Immunology and Infection
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使用流细胞测定量化人类诺如病毒样颗粒与准细菌结合
Chapters
Summary April 29th, 2020
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该协议的目标是量化真核病原体人类诺如病毒与细菌的结合。在进行初始病毒-细菌附件测定后，流细胞测定用于检测种群内的病毒结合细菌。
Transcript
病毒-细菌相互作用对于成功的病毒感染和刺激宿主免疫反应非常重要。但目前，实验室无法生产高度浓缩和纯化的人类诺如病毒。这种技术可用于任何与细菌结合的病毒，这些病毒可以是病毒样颗粒，也可以是活病毒。
它使我们能够量化这些病毒和细菌之间的相互作用。直接从冷冻甘油库存中，用单个分离的肠菌群从果菌块中接种五毫升液体介质。一夜之间长出细菌。
第二天，将培养的1.3毫升等分转移到两个独立的1.5毫升离心管中。以10，000 x g离心管5分钟。取出超自然剂，然后每次洗涤使用一毫升无菌 1X PBS 清洗样品两次。
再次以10，000 x g将样品离心5分钟。去除上一液，将颗粒重新在1.3毫升无菌1X PBS中。从 0.5 毫升的洗涤培养开始，连续稀释 1X PBS 中的细菌，从 10 到负 1 到 10 到负 4。
使用分光光度计测量洗涤未稀释培养物的光学密度，以及 600 纳米的四种稀释光度。对之前的每次稀释执行 10 倍的连续稀释（1 倍 PBS）。将每个系列最后三个稀释的 100 微升扩散到加糖板上，以确定每个样品每毫升形成菌落的单位数。
让板在室温下干燥五分钟。倒置盘子，在培养箱中孵育。在准备手稿中描述的试剂、抗体和细菌后，将所有材料组装在 BSL-2 生物安全柜中。
人类诺如病毒的病毒类颗粒被列为 BSL-2 病原体，使用 VLP 执行的所有工作都应在经过认证的生物安全柜中进行。将10微克的人类诺如病毒VLPs添加到每根细菌中，通过移液彻底混合。在37摄氏度下，在37摄氏度下孵育管子一小时，并不断旋转。
孵育后，以10，000xg离心管5分钟。吸气并丢弃上一升，将细菌颗粒重新在PBS的一毫升中。重复洗涤步骤一次后，将管再次以 10，000 X g 离心五分钟。
丢弃上一杯，将VLP细菌颗粒重新在150微升5%阻尼缓冲液中。发生的一个常见错误是交换管子和添加错误的处理。为了防止这种情况，请将所有管在符合正确处理的管内排列，并同时向管中添加一个处理。
对于每个细菌样本，制备50微升稀释的人类诺如病毒GII抗体。使用5%的阻尼缓冲液，稀释抗体一至125的E.cloacae样品。使用相同的稀释比，为每个细菌样品制备50微升稀释等型抗体。
将每个附件测定样品分成350微升等分，将其转移到干净的1.5毫升离心管中。要创建未污染的控件，请从每个细菌样本的第一个等量中添加 50 微升的阻塞缓冲液。对于染色样品，在第二组等分中加入50微升GII抗体稀释剂。
通过将稀释等同型抗体的50微升添加到第三组等同体中，创建等值控制。在冰上和黑暗中孵育所有样品30分钟。然后将所有样品以10，000 X g离心5分钟。
丢弃超钠，将每个样品重新丢弃在 FCSB 的 150 微升中。再次，将所有样品以10，000Xg离心5分钟。同样，丢弃超钠，将样品重新在 FCSB 的 100 微升中重新暂停。
在最后一次离心样品并丢弃超钠后，将样品重新浸入FCSB的150微升中。将每个样品转移到一个管内，包含 400 微升 FCSB，总体积为 550 微升。将样品储存在4摄氏度，直到通过流式细胞分析。
使用流式细胞测量测量了VLP附件。首先，密度图用于清除细胞碎片，然后随后进行点图浇注，以去除细菌双子和细胞团块。代表性直方图显示，与未污染和等型控制相比，仅细菌样品中缺乏PE信号，VLP：细菌样本中PE信号强度发生变化。
经过一个小时的孵育与10微克的VLP，流细胞仪检测到粒子结合到E.colacae和L.gasseri。为了确定该测定的结合定量的极限，在加入细菌之前，会生成一个VLPs的稀释序列。VLP 数量的减少导致与受 VLP 约束的细菌百分比相应减少。
了解病毒：细菌比并保持实验之间的比率一致，对于解释结果非常重要。细菌和病毒突变体可以产生，以专门确定调解这种相互作用的微生物表面结构。该技术允许研究人员回答有关影响诺如病毒-细菌相互作用的环境和条件的问题，包括病毒基因型的变化、细菌生长条件以及细菌表面结构的变化如何改变病毒结合。
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