Immunology and Infection
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将葛兰阴性细菌的细胞包络分离到内膜和外膜分数，对阿辛托巴基的培养素进行技术调整
Chapters
Summary April 10th, 2020
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革兰氏阴性细菌产生两个空间隔离膜。外膜由围皮层和气膜层从内膜分割。分离这些微生物的双层的能力对于了解它们的生理和发病机制至关重要。
Transcript
研究微生物如何调节单个双层的化学成分，将告知我们对抗生素杀灭、抗微生物药物耐药性和疾病发病机制的了解。此技术将克阴性细菌的细胞包络分割成两个定义的分数，而无需使用洗涤剂。因此，脂质、蛋白质和糖可以在半原生的环境中进行评估。
有些步骤取决于时间，需要重点和协调。最初，使用一个或两个示例。当一个人的舒适度升高时，可以添加更多的样品。
一次处理样本不应超过六个。这是一个多天的过程，视觉检查点有助于评估有效性和错误。在执行此操作之前，有时执行最后步骤。
将冷冻甘油库存中的细菌从新鲜阿加子板上划到新鲜阿加子板上。一旦菌落发展，将盘子储存在摄氏四度。使用单个菌落接种充满肉汤培养的五毫升管，并根据需要在一夜之间培养细菌。
背部稀释隔夜细菌培养成一升首选的肉汤培养基，并孵育烧瓶。达到所需的光学密度后，从培养箱中取出烧瓶并将其放在冰上。以600纳米测量培养的光学密度，并计算相当于11个细菌群落形成单位的6至8倍的培养量。
将这种培养量添加到离心管中，确保剩余的培养物在冰上停留，直到使用。以固定角度离心10分钟，在7000至10000倍的G和4摄氏度的高速离心机中对细菌进行离心。小心地将上一液丢弃。
将每个细胞颗粒重新悬浮在12.5毫升缓冲液中，在细胞悬浮液中加入磁搅拌棒。在每个细胞再吸收中加入180微升，每毫升10毫克。通过离心收集解酶EDTA处理细菌后，迅速将蛋白酶抑制剂、氯化镁和核酸酶加入细菌体内，并迅速将细胞重新悬浮在缓冲液B.Stir中两分钟，将悬浮液留在冰上。
接下来，向每个细胞重新悬浮添加12.5毫升1.5毫升EDTA溶液，并在冰上继续搅拌7分钟。将悬浮液放入 15 毫升锥形管中。在摄氏4度下将悬浮液在9000至11000次G下离心10分钟。
将超自然剂丢弃到生物危害废物容器中，并保留在冰上颗粒。在每个细胞颗粒中加入25毫升的缓冲B。然后，加入55微升的一个摩尔氯化镁，一微升的rnase/dnase/核酸酶试剂和一微升蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
将颗粒重新放入混合物中。大力移液器和涡流，直到溶液看起来同质。将悬浮液存放在冰上。
将样品倒入均质器样品缸中，使细胞为 20，000 PSI。为避免病原体气溶胶化，在缓冲液B中对加压装置进行调节，并在添加细菌悬浮液前调整压力水平。接合压力电池，并暗指10毫升缓冲B作为预防措施。
在冰上收集50毫升圆锥管中的细胞解酸，同时将样品留在冰上。要实现完全的解解，请重复此过程三到五次。为了将剩余的、完好无损的细胞材料进行颗粒化，将 6、169 倍 G 和 4 摄氏度的磨液细菌样品离心 10 分钟。
将现在含有均质膜的超自然剂分发到聚碳酸酯瓶中，进行超离心。超离心细胞在184，500倍G和4摄氏度下离水至少一小时。丢弃超自然剂，将膜颗粒保留在冰上。
使用玻璃，Dounce 均质器，将膜颗粒重新在低密度等质蔗糖梯度溶液的一毫升中重新暂停。然后，使用玻璃，巴斯德移液器将样品均质转移到1.5毫升微离心管，并放在冰上。要准备蔗糖梯度，请将聚丙烯或超透明开顶管保持稍微倾斜的位置。
慢慢加入两毫升的高密度蔗糖溶液。然后加入四毫升的低密度蔗糖溶液。准备密度梯度时，缓慢添加蔗糖溶液，以避免混合层。
蔗糖层应稍微可见，并且通常被定义。接下来，加入以前在一毫升低密度、等糖溶液中重新暂停的总膜分数。最后，通过加入大约六毫升的低密度，等值的蔗糖梯度溶液来填充管的其余部分。
在288，000倍的G和4摄氏度的左右温度下，使用摆动桶转子对样品进行16至23小时的超离心。从该点切下 P1000 移液器尖端约 5 毫升。离心完成后，使用移液器从管子上去除上棕色层。
将含有内膜分数的这层转移到聚碳酸酯瓶中，进行超离心。在53%蔗糖和73%蔗糖之间的界面上方留下大约两毫升的蔗糖溶液，以确保下部、白色外膜部分不会交叉污染内膜分数。再次使用 P1000 移液器尖端，端端拆下外膜层并将其转移到聚碳酸酯瓶中。
用隔离膜储存缓冲液填充聚碳酸酯瓶的剩余空隙，通过反转或管道混合。将样品保留在冰上。为了收集膜，超离心聚碳酸酯瓶在184，500倍G和4摄氏度一个小时。
最后，丢弃超钠，添加 500 到 1000 微升的存储缓冲液。通过 Dounce 均质重新暂停膜。在两毫升微离心管中收集样品。
总膜颗粒被刮掉，Dounce均匀化，在蔗糖密度梯度上超离心，以分离内膜和外膜。蔗糖密度梯度为20%53%73%足以分割一些细菌菌株。但不是为分区 A. baumannii， 这是成功地分区使用 20%45%73% 梯度。
为了评估分离的效率，对膜样品进行了NADH脱氢酶测试，这是一种位于细菌内膜中的酶。340纳米的光学密度下降表明酶的存在。对来自野生型S.typhimurium、大肠杆菌K12 DH5a和galE突变S.typhimurium的50微克内膜和外膜分数样本测量了光学密度。
在测定A.baumannii膜分数的纯度时，蛋白质的浓度更高，因为使用50微克的初步测定表明，A.baumannii的NADH脱氢酶的相对水平低于其他细菌菌株。为了评估内膜分数与外膜分数的交叉污染，提取并可视化LPS和 LOS。提取物被加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并沾染了Pro-Q翡翠300。
阿辛托菌鲍曼尼是头等大事，耐多药，人类病原体。该协议应有助于研究人员了解利皮利戈糖、磷脂和脂蛋白在这种独特而重要的病原体的抗药性和毒性机制中的作用。此方法非常适合下游分析磷脂、糖脂碳水化合物、蛋白质和小分子，这些分子通常存在于克阴性细菌的双膜中。
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