La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Neuroscience

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Summary

Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.

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Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

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Abstract

Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l'homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l'une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d'induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L'utilisation d'un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l'ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l'homme pour les chercheurs d'étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l'homme détient la clé de l'application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l'induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l'axe rostro-caudal, et la différenciation des types de neurones post-mitotiques des progéniteurs régionaux 4,5. A partir de 2001, plusieurs systèmes ont été mis en place pour générer des lignées de CSEh neurones, qui ont fourni une plate-forme pour la génération suivante de sous-types neuronaux 6,7. Basé sur les principes de développement, les types de neurones plusieurs comme la colonne vertébrale neurones moteurs 8-12, mésencéphale dopneurones aminergiques 13-15, les cellules rétiniennes neuronales 16,17 ont été efficacement spécifié dans les CSP de l'homme. Cela a été fait en appliquant morphogènes essentiels qui sont importants pour la spécification de ces types de neurones au cours du développement in vivo. D'autres protocoles ont également été élaborées pour promouvoir la différenciation des CSEh dans les neurones en utilisant soit des facteurs supplémentaires tels que les 18-20 petites molécules ou par co-culture avec d'autres types cellulaires pour aider à promouvoir la différenciation 21.

Le néocortex humain est très développé et contient de nombreux types cellulaires, y compris les neurones glutamatergiques qui jouent un rôle important dans l'apprentissage, la mémoire et la fonction cognitive 22,23. La première étape pour générer des neurones glutamatergiques dans la culture est de spécifier des cellules progénitrices télencéphaliques. Groupe de Yoshiki Sasai le premier signalé la différenciation dirigée des précurseurs télencéphaliques de la souris CES (mESCs) en utilisant une suspensio sans sérumn culture en présence de DKK1 (qui inhibe la signalisation Wnt) ainsi que LeftyA (qui inhibe la signalisation nodal) 24. Par la suite, plusieurs groupes, dont le nôtre ont également signalé la spécification des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme dans le sérum 25-27 milieu exempt. La génération des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme n'exige pas l'utilisation de morphogènes exogènes et l'efficacité dans la production de ces précurseurs est beaucoup plus élevé que celui de mESCs 26,27. Ici, un système chimique définie pour l'induction neurale qui a été bien établi par le groupe de Zhang 7 a été décrite. Sans l'ajout de facteurs exogènes caudalizing, ce protocole génère efficacement les précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme 27. Ces progéniteurs peuvent alors se différencier en progéniteurs dorsales ou ventrales en régulant la signalisation de Wnt et sonic hedgehog (SHH). Les progéniteurs dorsaux peuvent en outre se différencier en neurones glutamatergiques efficiently 27. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la génération de neurones glutamatergiques de l'homme iPSCs 28, qui permet de générer des neurones spécifiques du patient qui peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d'action ainsi que des thérapies potentielles pour un large éventail de maladies . De plus, notre système offre également une plate-forme pour explorer le développement et la spécification des divers types de neurones dans le télencéphale.

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Protocol

1. Génération des agrégats cellules souches pluripotentes humaines (D1 à D4)

  1. Cellules souches pluripotentes humaines sont mises en culture sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) alimentateurs en présence d'un milieu additionné de CSEh facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, 4 ng / ml). Après 5-7 jours de culture, lorsque les colonies sont grandes, mais encore indifférencié, ils sont prêts pour la prochaine étape.
  2. La solution enzymatique doit d'abord être préparé. Dans un tube de 50 ml, dissoudre la dispase (ou collagénase) à un 1 mg / ml dans du milieu DMEM/F12 concentration. Comme ces solutions mélanger meilleur lorsqu'il est réchauffé, placez le tube contenant le milieu et de l'enzyme dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 10-15 minutes, puis le stériliser à l'aide d'un filtre Steriflip.
  3. Aspirer le milieu des cellules, les rincer à l'DMEM/F12, et aspirer ce lui aussi. Ajouter 1 ml de dispase à chaque puits et les placer dans l'incubateur pendant 3-5 min pour CSEh (jusqu'à 10 min pour iPSCs). Regardez les cellules au microscope, quandles bords se recourbent légèrement / regarder un peu plus sombre, les cellules sont prêtes pour l'étape suivante. Il est préférable de vérifier les cellules après 3 minutes et remettez-les en cas de besoin. Lorsque vous utilisez ce protocole pour la première fois, il est préférable de commencer avec une seule plaque de cellules à la fois, il est important d'éliminer les cellules de la dispase aussi rapidement que possible.
  4. Aspirer la dispase à partir des cellules. Doucement (les cellules sont très vulnérables à ce stade et se détache de la plaque relativement facilement) ajouter 1,5 ml de DMEM/F12 dans chaque puits afin de rincer le dispase. Aspirer le DMEM/F12 et ajoutez 1,5 ml de milieu de CSEh à chaque puits.
  5. Pour détacher et briser les cellules, placez la pointe d'une pipette en verre de 10 ml vers le coin en bas à droite d'un puits (toucher les cellules) et déplacez la pipette de haut en bas (verticalement) - l'attiser la hausse devrait se trouver à proximité à la course à la baisse procédure. Une fois de l'autre côté du puits est atteint, répéter à l'horizontale direction.
  6. Une fois que toutes les cellules sont en suspension, les placer dans des tubes de 15 ml et centrifuger les à 200 xg pendant 2 min. Il doit y avoir un culot de cellules au fond du tube. Aspirer hors du milieu au-dessus du culot.
  7. La taille du flacon de culture cellulaire qui devraient être utilisés pour maintenir les agrégats en fonction de la quantité initiale de cellules. Pour 6 puits plaque (1) de CSEh, un non-culture de tissus traités flacon T75 avec 50 ml de milieu de CSEh devraient être utilisés. Transférer les cellules de l'étape 1.6 à la fiole et incuber à 37 ° C.
  8. Afin de se débarrasser des débris cellulaires, le milieu cellulaire et le ballon doit être remplacé environ 12 heures plus tard. Pour ce faire, placer tous les moyens / cellules dans un tube de 50 ml, tourner les cellules vers le bas (200 g pendant 2 min), et aspirer hors l'ancien milieu. Ensuite, ajoutez 50 ml de milieu frais CSEh dans les cellules, et les placer dans un nouveau flacon T75. Les cellules peuvent ensuite être nourris quotidiennement suivant la même procédure (jusqu'à ce jour 5).

  1. Transférer les cellules / moyen d'un tube de 50 ml et centrifuger les cellules pendant 2 min à 200 x g. Ensuite, aspirer le surnageant et transférer les cellules à une nouvelle (non-culture de tissus traités) flacon T75 avec 50 ml de milieu d'induction neurale (NIM).
  2. Une fois que les cellules sont en NIM, la moitié du milieu doit être remplacé tous les deux jours. Les agrégats doivent être suffisamment grande à l'endroit où ils se déposent au fond d'un tube de 50 ml conique sur eux-mêmes après quelques minutes (pas de centrifugation nécessaire). Après 2-3 jours de NIM (D7-D8 total), les cellules doivent être prêts à l'assiette. Laminine ou de sérum foetal bovin (FBS) peut être utilisé pour aider les cellules s'attachent aux plaques.
  3. Le nombre de cultures de tissus traités plaques à 6 puits qui sont nécessaires dépend de la densité des cellules dans chaque agrégat doit être capable de se développer sur la plaque pendant plusieurs jours sans toucher aucun des autres. En moyenne, les cellules d'unFlacon T75 donnera environ 4-6 6 plaques ainsi une valeur de cellules.
    1. Si vous utilisez la laminine, le diluer dans NIM à 10-20 g / ml pour enduire la plaque à 6 puits (~ 0,5 ml / puits). Après le revêtement pendant 2-3 h, agrégats cellulaires plaque sur des plaques 6 puits (~ 20-30 agrégats par puits). Après les agrégats ont été fixées, ajoutez 1,5 ml d'NIM.
    2. Si vous utilisez FBS, préparer un mélange de 90% de FBS NIM et 10% (1,5 ml / puits). Ajouter 1,5 ml de milieu avec les cellules à chaque puits, agiter doucement la plaque avant en arrière pour répartir les agrégats, et de permettre aux cellules de se fixer O / N dans un incubateur. Assurez-vous de changer le support (2 ml / puits de NIM) le lendemain matin pour enlever le FBS.
  4. Après un jour ou deux d'être plaqué, chaque agrégat sera étalée pour former une monocouche. En quelques jours, les centres de la plupart de ces cellules morphologiquement ressembler à des cellules cylindriques (forme allongée). Au cours de cette période, modifier le NIM tous les deux jours. Certaines lignes CFP (spécialement iPSC), peuvent former des cellules cylindriques de manière moins efficace. Dans ce cas, l'ajout de BMP et les inhibiteurs de TGF (Dorsomorphin 29, SB431542 19 à 2 pM) pendant la phase 2 peut être utile.
  5. Autour des jours 14-17, les cellules cylindriques apparaîtront plus compact. Parfois, ces cellules forment des crêtes ou des anneaux de lumière visibles à l'intérieur. Outre la morphologie colonnaire, les cellules à ce stade expriment des marqueurs neuro-épithéliales, comme PAX6 et SOX1 12,26.
  6. Avant l'isolement peut commencer, il faut d'abord examiner les cellules afin de déterminer s'il ya des cellules neuro-épithéliales non-présents. Un marqueur objectif peut être utilisé pour indiquer les colonies non-neuroépithéliales. Ceux-ci peuvent ensuite être éliminées en les grattant avec un embout de pipette.

3. Génération de progéniteurs télencéphaliques (D17-D24)

  1. Les centres des colonies contenant des cellules neuroépithéliales, et doivent être isolés du reste de la colonie. Cela peut être fait en utilisantune micropipette et un embout de pipette stérile de 1 ml filtré. Quand une petite quantité de pression est appliquée sur la partie centrale de la colonie, la soulève généralement hors assez facilement. Soyez prudent de ne pas laisser la partie extérieure de la colonie se détacher ainsi. Si les centres sont d'être têtu et ne se détache pas de leur propre chef, ils peuvent être enlevés en les retranchant l'aide d'une aiguille sous un microscope dans une hotte stérile. Transférez les parties centrales des colonies à un tube de 15 ml et centrifuger à 200 xg pendant 2 min.
  2. Le milieu doit être aspiré hors de la cellule. Deux plaques de dollars de cellules peuvent ensuite être transférées vers une culture de non-tissu traité T25 flacon contenant 10 ml de NIM avec l'ajout de B27 (sans vitamine A, 1:50). Utilisez 5-10 ml de milieu par une plaque de cellules.
  3. Lorsque les cellules sont vus le lendemain, ils devraient avoir une sphère comme l'aspect. Il est nécessaire de transférer ces cellules dans un nouveau flacon (en présence du NIM et B27, 1:50) que ce sont souvent les cellules périphériquesqui se faufiler à l'intérieur et attacher au fond du flacon.
  4. Le neurosphères devrait ensuite être cultivées en suspension pendant une semaine en utilisant NIM complété avec B27 (1:50). Dans le but de promouvoir l'endurance et la prolifération cellulaire, l'AMP cyclique (AMPc, 1 uM) et du facteur de croissance d'insuline (IGF-1, 10 ng / ml) peut être ajoutée dans le milieu au cours de la culture en suspension. À ce stade, les neurosphères contiennent des progéniteurs télencéphaliques (FOXG1 +) et sont prêts à être étalées sur des lamelles de différenciation terminale.

4. Différenciation plus loin dans les neurones télencéphaliques (D25 +)

    1. Préparer les lamelles recouvertes poly-ornithine/laminin (en plaques de 24 puits) pour l'étalement des cellules. Lamelles sont d'abord nettoyées et sont ensuite enrobés avec stratagème-ornithine (à 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, et stocké au congélateur).
      Poly-ornithine revêtement:
      1. Stériliser les lamelles: Placez les lamelles dans unbécher contenant de l'acide nitrique et secouez doucement sous la hotte pendant une heure. Verser l'acide nitrique, rincer plusieurs fois avec de l'eau DI, et de laisser les lamelles sous l'eau courante DI pendant au moins 15 min. Placez les lamelles dans de l'éthanol à 95% et soit agiter pendant 30 min (si vous utilisez immédiatement) ou un magasin dans l'éthanol à température ambiante.
      2. Dans une hotte stérile, verser le contenu du tube de 50 ml contenant des lamelles stérilisés dans le couvercle d'une plaque à 6 puits. En utilisant des pinces stérilisées, ramasser une lamelle à la fois et placé debout dans un seul puits d'une plaque de 24 puits. Répétez sorte que chaque bien a une lamelle.
      3. Après avoir sécher complètement, appuyez sur les plaques jusqu'à ce que des lamelles sont tombés à plat dans chaque puits. Suivant ajouter 100 ul de poly-ornithine (0,1 mg / ml dans des conditions stériles dH 2 O) à chaque lamelle et incuber les plaques O / N à 37 ° C.
      4. Le lendemain, enlever les plaques de l'incubateur et les laisser refroidir à température ambiante. Aspirer poly-ornithine hors de chaque lamelle (à partir de l'arête de til lamelle) veillant à ne pas toucher ou rayer les lamelles dans le processus. Laisser sécher les lamelles pendant environ 30 min avant de les laver.
      5. Ajouter 1 ml stérile dH 2 O dans chaque puits et laisser reposer pendant 10 min, et aspirer hors de l'eau de chaque puits. Répétez cette étape de lavage à deux reprises. Après que les plaques sécher complètement, (congé couvre off dans la hotte) placer les couvercles sur, couvrir de papier d'aluminium, et conserver à -20 ° C.
      1. Pour enrober les lamelles avec la laminine, ajouter 50 ul d'un mélange de milieu de différenciation neuronale et la laminine (concentration finale de 20 pg / ml) à chaque lamelle de poly-ornithine traités en prenant soin d'avoir seulement le liquide de toucher la lamelle lui-même (et non pas renverser off). Les incuber à 37 ° C pendant 1-2 heures avant de préparer les cellules pour la fixation.
  1. Recueillir et centrifuger les neurosphères à 200 xg pendant 2 min dans un tube de 15 ml. Aspirer le surnageant.
  2. <li>
    1. Rincer les cellules avec du DMEM-F12 et centrifuger les cellules à nouveau. Si les neurosphères sont trop grands pour fixer correctement, ils peuvent être dissociées avec Accutase à cette étape.
    2. Si vous utilisez Accutase: Après avoir lavé les cellules avec du DMEM-F12, les neurosphères sont dissociées de petites grappes en ajoutant Accutase (~ 2 ml) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 3 min. Ensuite, ajoutez la même quantité d'inhibiteur de trypsine (~ 2 ml) et centrifuger les cellules à 200 xg pendant 3 min. Les cellules doivent ensuite être remis en suspension dans NDM et brisée à l'aide d'une pipette P200. Les petits groupes peuvent ensuite être étalées sur des lamelles de pré-enduits.
  3. Aspirer la majorité du support et placer les cellules sur un plat 6 cm de Petri dans quelques gouttes de telle sorte que le moyen de les sélectionner devient plus facile. Ajouter environ 4-5 neurosphères à chaque lamelle pré-enduit. Il n'est pas nécessaire d'aspirer au large de la laminine premier.
  4. Laissez le neurosphères joindre pendant au moins 2-4 heures. Une fois qu'ils ont unttached bien, plus moyen (0,5 ml / lamelle) devrait être ajouté. Il devrait être composé de milieu de différenciation neurale complété avec B27 (1:50), l'AMPc (1 uM), et les facteurs neurotrophiques (BDNF, le GDNF, et de l'IGF, le tout à 10 ng / ml). A ce stade, la moitié de la moyenne peut être changé tous les deux jours, et ces cellules peuvent être maintenues pendant plusieurs mois.

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Representative Results

Ici, un protocole de différencier les CSP de l'homme dans télencéphaliques neurones glutamatergiques au travers de plusieurs étapes essentielles: la formation d'agrégats de la CFP, l'induction de cellules neuro-épithéliales, la production de progéniteurs télencéphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones télencéphaliques (Figure 1) a été décrits. Ce système est robuste et efficace dans la production de progéniteurs des neurones glutamatergiques et télencéphaliques. A titre d'exemple (figure 2), sans l'addition de facteurs caudalizing, les CSEh ont été différenciés dans le lignage neuronal 27. À 24 jours après la différenciation, la majorité des précurseurs neuraux étaient positifs pour FOXG1 (un facteur de transcription exprimé par le télencéphale), mais négatif pour HOXB4 (un marqueur de rhombencéphale et les cellules de la moelle épinière) suggérant que les progéniteurs télencéphaliques ont été généré avec succès (figure 2D). Ces progéniteurs télencéphaliques p ossess un phénotype dorsale, comme indiqué par l'expression de Pax6 (un marqueur exprimé par des progéniteurs dorsaux) (figure 2E), mais pas Nkx2.1 (un marqueur de progéniteurs ventraux) (figure 2F). Suite à une différenciation plus poussée, ces progéniteurs télencéphaliques dorsales différenciées en neurones glutamatergiques, qui étaient positifs pour le marqueur glutamatergique TBR1 (environ 80%) 27. Les neurones qui tachaient positif pour TBR1 étaient également positifs pour les marqueurs neuronaux βIII-tubuline (figure 2G) ou associée aux microtubules protéines 2 (MAP2, figure 2H). Ces cellules ont également exprimé transporteur du glutamate vésiculaire 1 (VGLUT1), un marqueur de neurones glutamatergiques matures, suggérant la génération efficace de télencéphaliques neurones glutamatergiques dans la culture (figure 2I).

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Figure 1. Une chronologie schématique du processus de différenciation neuronale.

Figure 2
Figure 2. Images mettant en évidence des cellules au cours de plusieurs étapes critiques de la différenciation neuronale. (A) CES de l'homme ont été cultivées pendant 4 jours. Images de phase montrant la formation d'agrégats ESC (B) et les cellules neuro-épithéliales (C). Au bout de 24 jours après la différenciation des CSEh, la majorité des cellules NE sont FOXG1 + mais HOXB4 - (D). Les progéniteurs télencéphaliques (FOXG1 +) étaient PAX6 + (E), mais Nkx2.1 - (F) après 1 mois de différenciation. Après deux autressemaines (6 semaines au total) de la différenciation des cellules sur les lamelles, la plupart coloré positif pour le marqueur glutamatergique TBR1 (G, H), ainsi que les marqueurs neuronaux βIII-tubuline (G) et MAP2 (H). Après huit semaines de différenciation, les cellules étaient positives pour le marqueur de maturité glutamatergique, VGLUT1 (I). Barres d'échelle: 100 um (A), 50 um (BI). (DI ont été adaptés à partir de notre publication précédente 27 avec permission).

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Discussion

Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s'assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l'homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l'homme n'attache pas très bien après les passages, inhibiteur de ROCK (Y27632) peuvent être ajoutés pour vous aider. Pour ceux qui ont des difficultés avec le maintien de leur pluripotent des cellules, des problèmes potentiels sont la qualité / densité des cellules MEF, ainsi que le sort des KOSR utilisé car il peut y avoir des variations d'un lot à. Bien que les cellules nourricières du MEF ont été utilisés pour maintenir les CSP dans le protocole ci-dessus, cette méthode fonctionne également pour les CSP qui sont cultivées en utilisant des systèmes sans chargeur.

Lorsque les cellules sont brisées pour former les agrégats de la CFP, il est important de limil leur exposition dispase à seulement quelques minutes (les bords se complètent). La durée pendant laquelle il faut attendre avant les bords des CSPi (jusqu'à 10 min) est généralement plus longue que celle des CES (3-5 min). Il est optimal pour ajouter le dispase à une seule plaque de CSP de l'homme à la fois pour s'assurer que les cellules ne sont pas dans l'enzyme pendant trop longtemps, car cela peut nuire ou même tuer les cellules. Après que les cellules sont en phase totale CFP, il est important de garder les cellules à une densité faible. La densité est également très important lorsque les agrégats de la CFP sont plaqués. Ces cellules vont étendre sur la plaque sur les prochains jours et des précautions doivent être prises pour veiller à ce qu'ils ne touchent pas après qu'ils grossissent. Au cours de l'étape de fixation (2,2), il est impératif de s'assurer que les cellules n'ont pas une exposition prolongée à la FBS, car cela pourrait affecter l'expression des gènes. Avant d'isoler les cellules neuro-épithéliales, il est également important de gratter les groupes non-neuronales, afin de donner une plus purPopulation de cellules. Si l'on voulait caractériser ou non leurs cellules vont dans la lignée neuronale, divers facteurs peuvent être considérés comme Pax6 ou Sox1. Pax6 tourne autour de 10 jours au cours de la différenciation neuronale et Sox1 tours par 2 semaines après la différenciation 12,26,30.

Ce protocole est à la pointe de la différenciation neuronale comme il récapitule de nombreuses étapes qui ont lieu pendant le développement du système nerveux humain. Sans l'utilisation de facteurs caudalizing (acide rétinoïque, le FGF basique), les cellules neuro-épithéliales efficacement différencier en progéniteurs télencéphaliques, ce qui coïncide avec les cellules neuroectoderme première acquisition d'un phénotype rostrale cours de développement in vivo 31. Ces progéniteurs télencéphaliques possèdent un phénotype dorsale en raison de signalisation Wnt endogène qui dorsalizes les cellules 27. Ce système génère des progéniteurs dorsales qui peuvent ensuite être différenciées en cellules glutamatergiquess. Bien que ce type de cellule est très importante, elle est loin d'être le seul type cellulaire que ce système est capable de former. Par exemple, l'ajout de SHH a été démontré que les cellules ventralize, leur permettant de se différencier en cellules GABAergiques 27,32. Il a même été démontré que ces CSEh dérivées neurones GABAergiques peuvent être transplantées chez des souris et qu'ils sont en mesure de corriger les défauts de locomotion dus à des lésions cérébrales 32. Parce que le protocole qui est démontré dans cet article passe en revue les points de contrôle par étapes, il offre un outil pour produire un large éventail de cellules dans le système nerveux humain qui est simplement limitée par notre compréhension du développement et de notre imagination.

La capacité à former des neurones humains à partir CSP ouvre un grand nombre de portes à la fois une science de base ainsi que dans une perspective clinique. Sources de tissus post-mortem sont limitées et la qualité peut varier, alors que l'homme différenciation CFP permet aux chercheurs d'obtenir uneoffre illimitée et cohérente des cellules de travailler avec. Avec l'avènement des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) 1,3,33,34 la technologie, il est maintenant possible d'obtenir des CSEh comme les cellules de fibroblastes de patients, y compris ceux atteints de maladies diverses 35-38. Comme l'a montré notre groupe 28 ainsi que beaucoup d'autres, la génération réussie de neurones à partir de iPSC a été et continuera d'être un outil unique et utile pour ceux qui ont longtemps cherché après des modèles humains de la maladie et le développement. En outre, plusieurs groupes ont montré que la CFP dérivés de neurones permet de modéliser certains aspects du processus de 36,37,39-42 la maladie et peut donc être utilisée pour dépister des composés thérapeutiques 43. Ceci est particulièrement encourageant car sans un bon système modèle pour tester des médicaments candidats pour le système nerveux central, seulement 8% d'entre eux ont été montré pour être efficace cliniquement 44. Cependant, cette méthode et d'autres comme elle pourrait contribuer à améliorer considérablement èmeest nombre.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l'anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

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References

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