Permanent Cerebral kärlocklusion * These authors contributed equally

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en mycket reproducerbar metod för permanent tillslutning av en gnagare större cerebral blodkärl. Denna teknik kan genomföras med mycket lite perifera skador, minsta blodförlust, en hög frekvens av långsiktig överlevnad, och konsekvent infarktvolymen proportion till den humana kliniska populationen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davis, M. F., Lay, C., Frostig, R. D. Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection. J. Vis. Exp. (77), e50418, doi:10.3791/50418 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stroke är en ledande orsak till dödsfall, invaliditet och samhällsekonomiska världsomspännande förlust. Majoriteten av alla slag uppstå ett avbrott i blodflödet (ischemi) 1. Middle cerebral artär (MCA) levererar en stor majoritet av blod till den laterala ytan av hjärnbarken 2, är den vanligaste platsen för mänsklig stroke 3, och ischemi inom dess territorium, kan resultera i omfattande dysfunktion eller död 1,4,5. Överlevande från ischemisk stroke drabbas ofta förlust eller störning av motoriska funktioner, sensoriska underskott, och infarkt. I ett försök att fånga dessa viktiga egenskaper hos stroke, och därigenom utveckla en effektiv behandling, är en stor tonvikt på djurmodeller för ischemi i MCA.

Här presenterar vi en metod för permanent tillsluta en kortikala kärlyta blod. Vi kommer att presentera den här metoden med ett exempel på en relevant kärlocklusion som modellerar den vanligaste typen, plats, och outcome av mänsklig stroke, permanent mellersta cerebral artär ocklusion (pMCAO). I denna modell, utsätter vi kirurgiskt MCA i vuxen råtta och därefter täppa via dubbel ligatur och transektion av fartyget. Detta pMCAO blockerar den proximala kortikala gren av MCA, vilket orsakar ischemi i alla MCA kortikal territorium, en stor del av hjärnbarken. Denna metod för ocklusion kan också användas för att ockludera mer distala delarna av kortikala kärl för att uppnå mer fokal ischemi rikta en mindre region av cortex. De primära nackdelarna med pMCAO är att det kirurgiska ingreppet är något invasiv som en liten kraniotomi krävs för att använda MCA, även om detta resulterar i minimal vävnadsskada. Den främsta fördelen med denna modell är emellertid: platsen för ocklusion är väl definierad, graden av blodflöde minskning är konsekvent, funktionell och neurologisk påverkan sker snabbt, är infarktstorlek konsekvent, och den höga graden av överlevnad möjliggör lång- Termen kronisk bedömning.

Introduction

För att inducera ischemiska förhållanden som effektivt efterliknar human ischemisk stroke, är flera djur stroke modeller ofta används, med varierande volymer av infarkt följd. I photothrombotic modellen, är hjärnan bestrålas genom skallbenet med laserbelysning efter intravenös injektion av en ljuskänslig substans (t.ex. rose-bengal), vilket resulterar i fotokemisk koagulation, blockering av bestrålade fartyg, och ischemi i den omgivande vävnaden 6, 7. Photothrombosis kan resultera i mycket små, isolerade områden i infarkt och används vanligen som ett medel för modellering "mini-stroke", eller "mikro-stroke".

Ju mer allmänt antagits teknik för inducering av ischemisk stroke, särskilt i arteria cerebri media (MCA), är det intraluminala monofilament modell 8, i vilken ett filament är kirurgiskt införas i den yttre halspulsådern och förs fram tills spetsen ockluderar basen av MCA. En primary utmaning intraluminal filament ocklusion är den höga dödligheten (70% när MCA är tilltäppt under 3 timmar, en relevant tidpunkt för stroke forskning) 9. Andra frågor med metoden inkluderade möjligt subaraknoidalblödning, ofullständig ocklusion, och variabel infarktvolymen 10,11. Denna modell resulterar i en omfattande grad av infarkt i både cortex och subcortically 12, och modeller en massiv mänsklig stroke.

Även om både mikro-och massiv stroke modeller är viktiga, mänskliga stroke är vanligtvis någonstans mellan. I stora kliniska studier, stroke infarkt varierar i storlek från 28 till 80 cm 3, som översätts till 4,5-14% av ipsi-ishemic halvklotet 9. I jämförelse, våra råtta pMCAO infarktstorlek varierar mellan ungefär 9-35 mm 3, som utgör 3-12% av den ipsi-ishemic halvklotet. Vår pMCAO modell, alltså liknar mänskliga ischemisk stroke infarkt volymer av andelen hjärnanvolym.

Förutom att modellera strukturella skador av stroke, pMCAO resulterar i funktionella och beteendestörningar som liknar människans villkor. Åtminstone en effektiv modell för stroke resulterar i rörelse underskott kontralaterala till stroke skada 13-15, förlust eller avbrott i motorisk och sensorisk funktion 16,17, förlust eller avbrott i framkallade neuronal aktivitet 16,18, minskningar av cerebralt blodflöde 19, 20, och infarkt 21,22. Följaktligen våra pMCAO modeller en allvarlig ocklusion av MCA resulterar i fysiskt handikapp, förlust av funktion i det sensoriska cortex (och angränsande cortex), störningar av neuronal aktivitet, en kraftig minskning av MCA blodflöde, och infarkt-kännemärke attribut ischemisk stroke 23 -25, därför fungerar som en effektiv modell av mänsklig stroke.

Procedurmässigt innebär pMCAO en liten kraniotomi där vi försiktigt bort skallen och dura frånen 2 x 2 mm "kirurgisk fönster" över den initiala (M1) segment av MCA, precis före den primära bifurkation av MCA in i de främre och bakre kortikala grenar (fig. 1A och 1B). Vi passerar en halv kurva omvänd nål skärande sutur och tråd (6-0 silke) genom pial skiktet i hjärnhinnan, nedan MCA och ovanför kortikala ytan (se tabell av särskilda reagenser och utrustning för de kirurgiska förnödenheter som behövs för att utföra pMCAO ). Vi sedan knyta en dubbel ligatur, dra åt de två knop runt MCA, och transekt kärlet mellan de två knop. Den dubbla ligatur och transektion genom M1 inträffar strax distalt till lenticulostriate förgrening, så att endast de bark grenar av MCA påverkas-sålunda endast kortikal infarkt (ingen subkortikal skada) förekommer 26,27 (figur 2). Även människans stroke innebär ofta subcortical infarkt, modellera detta i gnagare kräver ökad spridningsförmåga (occluding cerebrala kärl före kortikala Branching kräver åtkomst artärer via halspulsådern i halsen och nödvändiggör ytterligare inneslutningar) i teknik och ökad variation i infarktstorlek. Den modell som beskrivs här kan inte göras mer proximalt som tillgång till tidigare grenar av MCA är inte möjlig via en enkel craniotomy. Även om det kan vara kirurgiskt möjligt att inducera en subcortical infarkt via pMCAO skulle ocklusion medför en extremt invasiv förfarande och är därför inte idealiska.

Effektiviteten av ocklusion kan bekräftas via laser Doppler, eller laser speckle avbildning 12,24,25 (figur 3), eller histologiskt obduktioner (Figur 2). Det bör noteras att tidigare forskning har visat att sensorisk stimulering kan spela en viktig roll i utvecklingen och resultatet av infarkt, som ger skydd mot skador vid administrering inom 2 h av pMCAO och orsakar en ökning av stroke skador när de administreras vid 3 h efter pMCAO 24,25,28. Vi har bekräftat att 5 h efter pMCAO, stimulering inte längre har en effekt på resultatet (opublicerade data). Därför bör sensorisk stimulering av ämnen minimeras i 5 timmar efter pMCAO att få infarkt volymer med minimal variabilitet. Följaktligen driver vår grupp "obehandlade kontroller" av denna typ genom att hålla råttor bedövades för 5 h efter pMCAO, i mörker, med minimal sensorisk stimulering, och uttryckligen ingen whisker stimulering.

Det bör vidare noteras att tillfällig variation i MCA struktur, inklusive överdriven förgrening, multipla primära segment, eller frånvaron av kommunicerande artärerna kan uppstå vid en frekvens på 10 till 30% hos manliga vuxna Sprague Dawley 29,30. Om avvikelser i MCA observeras, är det lämpligt att inte använda just det ämnet som tillsats djur med sådana kärlmissbildningar ökar infarkt variabilitet.

Dessutom finns det flera praktiska aspekter av oUR förfarande som gör denna ocklusion metod fördelaktig för stroke utredning. Först får suturer placeras runt artären men inte skärpas i syfte att samla in en baslinje bedömning, följt av post-ischemisk bedömning efter ligatur och transektion. På detta sätt är kirurgisk förberedelse nödvändig för ocklusion effektivt kontrolleras för, inom försökspersoner. Eftersom patienter kan förbli stationär eller inom en stereotaktisk ram under ocklusion, är det möjligt att genomföra experimentell utvärdering av varje ämne före, under, och efter ocklusion utan att flytta föremål eller störa någon experimentell utrustning i bruk 25,28. Dessutom, denna procedur resulterar i en mycket låg dödlighet, även inom äldre gnagare försökspersoner 21-24 månaders ålder (motsvarande en äldre människa) 31, och kan därför användas för att utvärdera stroke behandlingar hos råttor som närmare modellera de vanligaste åldersgrupp av stroke drabbade 25,28. Vessel transection tjänar också flera praktiska syften. Frånvaron av blödning efter transektion bekräftar att fartyget var helt blockerad vid båda ligaturer platserna. Dessutom säkerställer transection ett permanent avbrott i blodflödet. Slutligen garanteras transection att varje blodflödet detekteras i de bortre delarna av det tilltäppta kärlet måste komma från en alternativ källa.

Slutligen, även om vi specifikt beskriva denna ocklusion teknik för MCA i detta manuskript och video, kan samma dubbel ligatur transection teknik tillämpas på alla cerebrala kärl som kan nås via kraniotomi. Vårt laboratorium, till exempel, används pMCAO tillsammans med flera andra fasta inneslutningar av distala MCA grenar för att blockera både primära och säkerheter blodflödet 24 på ett sätt som liknar tekniker avsedda att selektivt framkalla ischemi inom den primära hjärnbarken 32.

Sammanfattningsvis thans metod för permanent ocklusion som tillämpas på MCA modeller nära tre primära aspekter av mänskligt ischemisk stroke: den vanligaste platsen (MCA), typ (ischemi), och graden av skada (infarkt) associerad med den humana kliniska litteraturen av stroke. Dessutom kan denna metod för ocklusion tillämpas på enkla eller multipla ocklusion platser i hela hjärnan, och kan utföras i åldrade individer med en hög frekvens av överlevnad. Med tanke på den dynamiska, permanent, och relativt icke-invasiv karaktär denna ocklusion, representerar denna teknik ytterligare ett verktyg för prekliniska forskare utvärderar nya metoder för skydd mot och behandling av stroke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Komma igång: Krävs kirurgiska instrument

Se Figur 4

  1. Tandläkarborrmaskiner (Kavo Dental Equipment, Modell: UMXL-TM), 2-bitars borr, och 3-bitars borr
  2. Två ~ 30 gauge injektionssprutor
  3. Tandad pincett, böjd spets tillval (kan vara bra men inte nödvändigt)
  4. Två fin spets pincett
  5. avbitare
  6. Suturtråd
  7. Micro sax

2. Skapa Kirurgiska Window

  1. Anestesi: förfarandena överensstämmer med NIH riktlinjer och har godkänts av UC Irvine Animal Care och användning kommittén. Försökspersoner är 295-400 g Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) och följande anestesi bör användas:
    1. Injicera råtta intraperitonealt med en natrium pentobarbital bolus (55 mg / kg kroppsvikt), följt av en intramuskulär injektion av atropin (0,05 mg / kg, kroppsvikt) i hind benet, och administreras 3,0 cc av 5% dextros i vatten subkutant.
    2. Supplement natriumpentobarbital (27,5 mg / kg, kroppsvikt) injektioner efter behov. Administrera en oftalmisk antibiotisk salva till ögonen för att skydda hornhinnor under följande procedurer. Dosera 5% dextros (3 ml) och atropin (0,05 mg / kg, kroppsvikt) var sjätte timme minskar luftvägarna sekret under anestesi. Mät kroppstemperaturen via en rektal sond, och bibehålla kroppstemperaturen vid 37 ° C genom en självreglerande värmefilt.
  2. Lokalisera MCA genom antingen:
    1. Gallring en 2 x 2 mm bildbehandling / visualisering fönster över hjärnbarken med en storlek HP 3 borr tills skallen är nästan genomskinligt och sedan gallring till full insyn med en storlek HP 2 borr. MCA: s läge kan då ses genom fönstret och dess proximala bana används för att approximera platsen för det ursprungliga segmentet. MCA kommer i allmänhet köra diagonalt över dennafönster i en rostralt till stjärtfenan / ventrala till dorsal riktning (t.ex. vänster till höger / botten till toppen när du tittar vänster hjärnhalva ur kirurgens synvinkel). Den kirurgiska fönstret kan sedan skapas ovan där betraktaren uppskattar M1-segmentet (proximal till kortikala förgrening) ska placeras baserat på de distala grenar synliga genom det första fönstret. För att minimera mängden av skallen som avlägsnas i syfte att få tillgång till MCA, bör det bildgivande / visualisera fönster placeras nära, men skild från den kirurgiska fönstret.
      Eller
    2. Ett litet kirurgiskt fönster bör placeras ca 3 mm anterior och 1 mm lateralt foramen ovale eller mandibular nerv, nära bågen talarstol 30,33,34. För att effektivt komma åt stammen av MCA (även känd som M1 segment), är den temporalis muskeln tillfälligt reflekteras bort från skallen ytan. (OBS: När det gäller långsiktiga överlevnad operationer, har vårt labb erfarenhet varit that genom att tillåta temporalis muskeln att förbli fäst vid sin ankar, kommer muskeln åter para till skallen ytan, vilket möjliggör sunda matvanor och effektivt underhåll av kroppsvikten.
  3. Följ MCA till rostrala, ventrala hörnet av avbildning fönstret (om du använder det som referens) för att uppskatta när den ursprungliga kortikala gren lögner.
  4. Skapa en ny tunn-skalle region (vi kallar detta den kirurgiska fönster) något rostralt och ventrala till avbildning fönstret (om du använder detta som en referens) där M1-segmentet (pre-kortikal förgrening) av MCA bör vara. VIKTIGT: Lämna ungefär en 2 mm mellanrum mellan avbildning fönstret (om du använder det som referens) och kirurgiska fönstret.
  5. Leta stammen av MCA (även känd som M1 segment) strax innan kortikala förgrening av artären som visas i figurerna 1A och 1B.
  6. Använda en storlek HP-3 borr, tunna skallen ovanför den beräknade M1 segmentet plats. Närskalle blir något genomskinligt, byta till mer känsliga storlek HP-2 borr och tunna skallen tills det är helt genomskinligt. Bekräfta visuellt som kirurgisk fönster område blir tillräckligt tunn för att visa kärlsystem, och bedöma läget för M1 vid denna punkt och avsluta fönstret så att det finns 2-3 mm på vardera sidan av längden av M1-segmentet (detta ger utrymme för införande och utförsel av suturnålen på vardera sidan av MCA).

Viktigt: Stoppa gallring när tjockleken av skallen är liknande till det av plastfolie. Fartyget kommer att brista när borren bryter igenom skallen och dura. Om skallen är inte tunn nog på den andra sidan kommer att ta bort den för ocklusionen vara svårt och kan leda till skada på cortex eller artär.

  1. Ta en 30 gauge (30 G) injektionsnål och böj toppen av nålen, med tandade pincett.
  2. Använd 30 G nål att punktera skallen vårdfullt ut i ett område som inte är direkt ovanför en artär. Använd denna punktionshålet att tillåta pincett att förstå skallen och ta försiktigt bort den förtunnade området av kirurgiska fönstret.
  3. Ta en ny 30 G behov, böja sin spets som i steg 6, och ta försiktigt bort dura.

OBS: Cutting dura kommer att få den att skala tillbaka och MCA kommer att bli mer framträdande, som en följd av reducerat tryck.

Tre. Ockluderande MCA

  1. Använd avbitare för att trimma en halv kurva omvänd skärande Suturnålar (omgång 3/8, 16 mm Suturnålar) ner till ca 3-5 mm.
  2. Trä trimmade suturnålen som visas på bilden i figur 4E. VIKTIGT: Det är viktigt att nålen är gängad så båda ändarna av suturen tråden är av likvärdig längd. Detta gör det möjligt att dra av båda trådändarna i M1 samtidigt, kan nålen sedan skäras fri lämnar två längder av tråd för att knyta två knutar runt MCA.
  3. Använd tandade pincett slip suturnålen enligt M1. Sätt med ca 0,5-1 mm avstånd från MCA, vistas så grunt som möjligt för att minimera skador på cortex men undvika alltför stor påfrestning på MCA också.
  4. När suturen nålen kommer ut på andra sidan så att den är under MCA, använd en fin spets pincett (såsom visas nedan) för att dra spetsen på suturnålen från den motsatta sidan och samtidigt fortsätta att mata eller skjuta den andra änden av suturen nål med tandad spets pincett.
  5. När suturnålen helt gått enligt MCA och dragits ut, fortsätt att dra på suturnålen eller tråd tills längden på gängan är lika på båda sidor av MCA. Genom att trycka ner på tråden när det matas genom att minimera belastningen på MCA kan vara till hjälp för att förhindra brott som tråden passerar under artären.
  6. Klipp av tråden nära suturnålen.
  7. Använd båda fina poäng pincett för att reda ut de två resulterande suturtrådens så att det finns två oberoende trådar uppträdda enligt MCA som inte vidrör. Helst trådarna kommer att vara ca 1 mm från varandra när de passerar under MCA.
  8. Använd båda fina poäng pincett för att knyta två separata knop (två ligaturer) med gängorna runt MCA försöker hävda att ~ 1 mm utrymme mellan knutarna för att ge utrymme för transektion.

OBS: Om en intern bluff kontroll önskas, förbereda ocklusion lämnar ocklusion knop lösa så att de inte tygla MCA alls och samla in data innan åtdragning av knutar och skära fartyget. Trimma tråden för att förhindra att det fastnar på något innan ocklusion men lämna tillräckligt med tråd för att möjliggöra åtdragning av knutar senare. På så sätt kan varje baslinje avbildning eller datainsamlingen utföras med alla av samma kirurgiskt ingrepp som ocklusion och knutarna åtdragna vid lämplig tidpunkt med lite fördröjning.

  1. När knutarna har varasv dras åt, använda mikro sax för att transekt M1 mellan de två knop.
  2. När det gäller långsiktiga överlevnad studier:
    1. Sutur snittas hårbotten luckan på plats igen med steril kirurgisk tråd eller säkra vävnaden med steril sårklämmor.
    2. Administrera antibiotika lokalt till sårområdet (såsom bacitracin salva) och systemiskt genom profylaktisk injektion av ampicillin (150 mg / kg IM).
    3. Medan ämnet är fortfarande bedövas administrera ett ögonläkemedel antibiotisk salva till ögonen.
    4. Administrera kompletterande atropin (0,05 mg / kg IM) för att minska andningssekret under anestesi.
    5. Injicera flunixinmeglumin (1,1 mg / kg) subkutant vid avslutningen av operationen och igen följande morgon (~ 12 h senare) för smärtkontroll.
    6. Placera djuret på ett torrt, varmt, lutande yta så att djuren näsan är ovanför svansen på lutning (detta underlättar andningen tills djuret är vaken). </ Li>
    7. Övervaka djuret tills den är vaken och flyttas på ett säkert på egen hand.
    8. När djuret är tillbaka i terrariet,, djurets aktivitet bör utseende, läte, och utfodring och dricka beteende övervakas dagligen.

4. Avlivning

  1. Vid slutet av varje experiment, bör råttorna avlivas med natrium pentobarbital (2-3 ml, intraperitonealt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrik ocklusion av ett fartyg kan bekräftas med hjälp av laser speckle avbildning (LSI) bland andra avbilda blodflöde tekniker. Blodflödet i de stora kortikala grenar av MCA skulle sjunka till ~ 25% av utgångsvärdet eller mindre efter ocklusion beroende på bullernivån i inspelningen systemet och känslighet av tekniken. Se figur 3 för en representativ LSI bild av ett segment av en kortikal gren av MCA före och efter MCA ocklusion. När den beskrivna ocklusion teknik används till MCA vid M1 segmentet, blockerar alla kortikala MCA grenar, och sensorisk stimulering förhindras för ~ 5 h efter ocklusion, är resultatet en kortikal infarkt av 28,4 ± 2,4 mm 3 (för en representativ koronalt skiva en 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumklorid [TTC] färgade hjärnan med den beskrivna skadan, se figur 2, blek ofärgade området motsvarar infarkt) 25.


Figur 1. Gula pilar indikerar ungefärliga platsen för pMCAO på M1-segmentet. Denna ocklusion exempel innebär occluding MCA precis distalt om lenticulostriate förgrening, före alla kortikala förgrening, alltså skära av blodtillförseln till kortikala grenar bara. (A) Diagram över MCA på laterala kortikala ytan. (B) Coronal syn på ungefärliga MCA kortikala och subcortical filialkontor. Observera att ocklusion av MCA proximalt lenticulostriate förgrening kommer att resultera i kortikala och subkortikal infarkt, även om tillgången till denna region kräver en relativt invasivt kirurgiskt ingrepp. Klicka här för att visa en större bild .


Figur 2. Single representant koronal skiva från en råtta hjärna visar infarkt följer pMCAO (med omsorg för att minimera skyddande sensorisk stimulering för 5 tim efter ocklusion). 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumklorid (TTC) lösning fläckar frisk vävnad rödaktig och lämnar områden med celldöd eller infarkt (anges med pilen) blek. Observera att på grund av placeringen av ocklusion (före alla MCA kortikala grenar men distalt subcortical grenar) endast kortikal infarkt observeras, och mycket myelinerade regioner av hjärnan tar inte upp TTC-lösning och kommer därför att förbli vit i färgen, trots är strukturellt intakta.

Figur 3
Figur 3. Bild visar flödet i en del av en enda kortikala gren av MCA före och enfter pMCAO avbildas som använder laser speckle avbildning (LSI). Varmare färger indikerar starkare flöde. Den beskrivna MCA grenen syns tydligt genomkorsar baslinjen bilden (vänster) från nedre vänstra till övre högra hörn och försvinner efter pMCAO. Obs: ibland några minimala tecken på flödet kvar i en viss gren, men efter pMCAO nivåer bör sjunka till 20% eller mindre av baslinjen flöde för att bekräfta ocklusion framgång.

Figur 4
. Figur 4 Kirurgiska verktyg som krävs för pMCAO (A) Extra Fine Graefe Tång -.... 0,5 mm Tips svag kurva (B) Keramiska Coated Dumont # 5 pincett (C) Extra Fine Bonn sax, rak (D) Omgång 3/8 (16 mm) suturnålar (E) OBS. suturnålar kan vara shortened via avbitare enligt användarens önskemål. Efter förkortning med avbitare, bör suturnålar steriliseras. (F) 6-0 Flätad silkessutur. (G) 30 gauge kanyl, ½ längd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll har utvecklats i syfte att inducera ischemi inom gnagare cortex, och att göra det med minimal perifer påverkan på försökspersoner. Den dubbla ocklusion och transection metod möjliggör visuell bekräftelse på att fartyget permanent har tilltäppt, och kan utföras utan överdriven invasion eller vävnadsskada, och med en hög överlevnad. Denna ocklusion protokoll kan tillämpas på alla kortikala kärl som kan nås via kraniotomi för att inducera ischemi inom ett specifikt kortikal domän. Vidare kan sådana occlusions utföras medan ett djur befinner sig i en stereotaktisk apparat möjliggör samtidig användning av olika prövningsläkemedel tekniker, såsom funktionell avbildning eller elektrofysiologiska inspelning. Detta gör denna ocklusion tekniken tillämpas på ett brett spektrum av experimentell design, även inom-ämne utredning. Exempelvis kan bedömningen göras vid baseline med suturer på plats runt Artery (men innan säkra suturer och transecting), under ischemisk debut, och helst efter ocklusion tidpunkt krävs.

Framgångsrikt genomförande av denna ocklusion är knuten två viktiga steg. Först korrekt visualisering av målkärlet är kritisk för inducerande ischemi. Ocklusion på ett ställe nära till eller distalt till den önskade platsen (i vårt typiskt fall, alldeles proximalt till den primära främre / bakre kortikala bifurkation av MCA) kan resultera i en stor grad av infarktvolymen variabiliteten ska så försiktighet iakttas för att bekräfta lämplig plats för ocklusion och transektion. Andra, passerar suturnålen runt målet artären kräver noggrann och exakt teknik. Med nödvändighet kommer den suturen passera genom det mest ytliga lagret av cortex omedelbart under artären. Försiktighet bör vidtas för att undvika att dyka för djupt i den kortikala ytan, eftersom detta kan resultera i kärlet spricker, blödning, eller skador på hjärnan på occlusion webbplats. Även om många typer av ocklusion blodkärl kirurgiska verktyg finns tillgängliga, har vårt labb haft mest framgång med halva nålar kurva suturer och stympade enligt försöksledaren önskemål. Används tillsammans med ultra-fin pincett, kan detta verktyg för användaren att passera suturtråd nedanför en artär och ovanför kortikala ytan med endast minimal vävnadsskada.

Efter ett framgångsrikt slutförande av en ocklusion, är infarkt begränsad till cortex ensam (figur 2). I samband med användning av denna ocklusion metod att modellera MCA stroke, kan detta ha viktiga konsekvenser för forskare med tanke på att många MCA strokepatienter upprätthålla infarkt inom både cortex och basala ganglierna. Däremot gynnar vårt laboratorium denna ocklusion metod som tillämpas för MCA över tekniker såsom intraluminal sutur med tanke på de senaste resultaten som nedsatt tuggmotstånd, svälja funktion och försämrad motorprestanda förekommer i 47% av alla patienter som genomgår intralumiNAL sutur 35, nedsatt cerebral perfusion och minskad spontan motorisk aktivitet till följd av minskad mat och vatten upptag bidrar också till sämre neurologisk återhämtning i råttor efter intraluminal sutur 36-40. Trueman et al. 2011 har också rapporterat onormalt ätande, nedsatt dricka beteende, och sensorimotor funktionshinder (som kvantifieras av limborttagning uppgiften) följer denna procedur 11. Kritiskt, observerade vi samma beteendestörningar i sham intraluminala sutur djur 11. Som ett resultat, kan intraluminal sutur lägga allvarliga felkällor till preklinisk stroke studie-varav många är direkt hänförliga till det kirurgiska ingreppet och inte till cerebral ischemisk stroke.

Det är omöjligt att modellera den variabla etiologi och patologi av human ischemisk stroke - i själva verket en så hög grad av variabilitet skulle vara icke önskvärt i en experimentell modell. Stroke forskning på djur bör instead fokusera på att producera ett resultat mer analogt med human stroke skador och underskott samtidigt som man försöker modellen etiologi som bästa möjliga. Vi föreslår att den minsta invasive art, ocklusion av MCA resulterar i ischemi, infarkt volym som är jämförbar med human MCA ischemi, och förmågan att omsätta flera prövningsläkemedel tekniker tillsammans pMCAO kan göra denna metod ett attraktivt alternativ för vissa prekliniska stroke utredare. Dessutom ger ocklusion metoden modelleras här av pMCAO ett alternativ, minimalt invasiva, effektiva medel för att täppa någon yta kortikala kärl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna vid denna tid.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av American Heart Association predoctoral Fellowship 788.808-41.910, NIH-NINDS NS-066001 och NS-055.832, och Centrum för hörsel forskning NIH utbildningsstipendium 1T32DC010775-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1) Fine Science Tools 11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) Fine Science Tools 11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) Fine Science Tools 14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles Fine Science Tools 12050-02
6-0 Braided Silk Suture Fine Science Tools NC9071061
Harvard Apparatus
No.:510461
30 gauge needle, ½" length Fine Science Tools NC9867376

No.:ZT-5-030-5-L/COL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caplan, L. R. Caplan's Stroke, A Clinical Approach. 4th edn, Saunder's & Elsevier. (2009).
  2. Blumenfeld, H. Neuroanatomy Through Clinical Cases. Sinauer Associates. (2002).
  3. Roger, V. L., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. (2011).
  4. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
  5. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
  6. Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 2. Acute and subacute alterations in local glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab. 6, 195-202 (1986).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
  8. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  10. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
  11. Trueman, R., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Transl. Stroke Res. 2, (2011).
  12. Dirnagl, U. Neuromethods. Waiz, W. olfgang Spring Science & Business Media. New York. (2010).
  13. Cirstea, M. C., Levin, M. F. Compensatory strategies for reaching in stroke. Brain. 123, (Pt. 5), 940-953 (2000).
  14. Nakayama, H., Jorgensen, H. S., Raaschou, H. O., Olsen, T. S. The influence of age on stroke outcome. The Copenhagen Stroke Study. Stroke. 25, 808-813 (1994).
  15. Nudo, R. J., Plautz, E. J., Frost, S. B. Role of adaptive plasticity in recovery of function after damage to motor cortex. Muscle Nerve. 24, 1000-1019 (2001).
  16. Chiganos, T. C., Jensen, W., Rousche, P. J. Electrophysiological response dynamics during focal cortical infarction. J. Neural Eng. 3, 15-22 (2006).
  17. Traversa, R., Cicinelli, P., Bassi, A., Rossini, P. M., Bernardi, G. Mapping of motor cortical reorganization after stroke. A brain stimulation study with focal magnetic pulses. Stroke. 28, 110-117 (1997).
  18. Weber, R., et al. Early prediction of functional recovery after experimental stroke: functional magnetic resonance imaging, electrophysiology, and behavioral testing in rats. J. Neurosci. 28, 1022-1029 (2008).
  19. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J. Cereb. Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
  20. Wintermark, M., et al. Comparison of admission perfusion computed tomography and qualitative diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in acute stroke patients. Stroke. 33, 2025-2031 (2002).
  21. Crafton, K. R., Mark, A. N., Cramer, S. C. Improved understanding of cortical injury by incorporating measures of functional anatomy. Brain. 126, 1650-1659 (2003).
  22. Nudo, R. J., Eisner-Janowicz, I. Ch. 12. Reprogramming the Cerebral Cortex. Lomber, S. tephen, Eggermont, J. os Oxford Scholarship Online. (2006).
  23. Davis, M. F., Lay, C. C., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Amount but not pattern of protective sensory stimulation alters recovery after permanent middle cerebral artery occlusion. Stroke. 42, 792-798 (2011).
  24. Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation completely protects the adult rodent cortex from ischemic stroke. PLoS One. 5, e11270 (2010).
  25. Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation reestablishes cortical function during the acute phase of ischemia. J. Neurosci. 31, 11495-11504 (2011).
  26. Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13, 855-859 (1982).
  27. Risedal, A., Zeng, J., Johansson, B. B. Early training may exacerbate brain damage after focal brain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 997-1003 (1999).
  28. Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation protects the aged rodent from cortical ischemic stroke following permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of the American Heart Association Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. (2012).
  29. Niiro, M., Simon, R. P., Kadota, K., Asakura, T. Proximal branching patterns of middle cerebral artery (MCA) in rats and their influence on the infarct size produced by MCA occlusion. J. Neurosci Methods. 64, 19-23 (1996).
  30. Wang-Fischer, Y. Manual of Stroke Models in Rats. CRC Press. 17-30 (2009).
  31. Quinn, R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years? Nutrition. 21, 775-777 (2005).
  32. Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Ministrokes in rat barrel cortex. Stroke. 26, 1459-1462 (1995).
  33. Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
  34. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  35. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34, 2252-2257 (2003).
  36. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
  37. Kuge, Y., Minematsu, K., Yamaguchi, T., Miyake, Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26, 1655-1657 (1995).
  38. Laing, R. J., Jakubowski, J., Laing, R. W. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 24, 294-297 (1993).
  39. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  40. Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics