La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

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Biology

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Summary

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

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Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

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Abstract

Para estudiar la interacción lípido-proteína en una manera reduccionista, es necesario incorporar las proteínas de membrana en membranas de composición de lípidos bien definido. Estamos estudiando los efectos de compuerta lípido-dependientes de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo (Kv), y se han elaborado procedimientos detallados para reconstituir los canales en diferentes sistemas de membranas. Nuestros procedimientos de reconstitución toman consideración de tanto la fusión inducida por detergente de las vesículas y la fusión de proteína / detergente con las micelas lípido / detergente micelas mixtas, así como la importancia de alcanzar un equilibrio de distribución de los lípidos entre la proteína / detergente / lípido y el detergente / lípidos micelas mixtas. Nuestros datos sugieren que la inserción de los canales en las vesículas lipídicas es relativamente aleatoria en orientaciones, y la eficacia de reconstitución es tan alta que no hay agregados de proteínas detectables se observaron en experimentos de fraccionamiento. Hemos utilizado el reconstituird canales para determinar los estados conformacionales de los canales en diferentes lípidos, registrar las actividades eléctricas de un pequeño número de canales incorporados en bicapas lipídicas planas, pantalla para ligandos específicos de conformación de una biblioteca de fagos, y apoyar el crecimiento de cristales 2D de los canales en las membranas. Los procedimientos de reconstitución descritos aquí se pueden adaptar para el estudio de otras proteínas de membrana en bicapas lipídicas, especialmente para la investigación de los efectos sobre los lípidos en los canales iónicos dependientes de voltaje eucariotas.

Introduction

Células materiales de intercambio e información con su entorno a través de las funciones de las proteínas de membrana específicos 1. Las proteínas de membrana en membranas celulares funcionan como bombas, canales, receptores, enzimas intramembrane, enlazadores y simpatizantes estructurales a través de membranas. Las mutaciones que afectan a las proteínas de la membrana se han relacionado con muchas enfermedades humanas. De hecho, muchas proteínas de membrana han sido los principales objetivos de drogas porque son importantes y de fácil acceso en las membranas celulares. Por lo tanto, es muy importante para comprender la estructura y la función de varias proteínas de membrana en membranas, y que sea posible diseñar nuevos métodos para aliviar los efectos perjudiciales de las proteínas mutantes en las enfermedades humanas.

Los lípidos rodean todas las proteínas de membrana integradas en bicapas 2, 3. En las membranas eucariotas, son conocidos los diversos tipos diferentes de lípidos a ser organizado en microdominios 4, 5.Muchas proteínas de la membrana se muestran para ser distribuidos entre estos microdominios, así como la fase fluida voluminosos de las membranas 3, 6. El mecanismo subyacente a la organización de los microdominios y la entrega de proteínas de membrana en ellos y la importancia fisiológica de dichas distribuciones son claramente importantes, pero siguen siendo poco conocidos. Una importante dificultad técnica en el estudio de los efectos sobre los lípidos de las proteínas de membrana es la reconstitución fiable purificada bioquímicamente las proteínas de membrana en las membranas de la composición lipídica bien controlados por lo que casi todas las proteínas reconstituidos son funcionales 7. En los últimos años, hemos desarrollado métodos para reconstituir el canal de potasio dependiente de voltaje prototipo de A. pernix (KvAP) en varios sistemas de membrana para estudios estructurales y funcionales 8-10. Los datos de otros y juntos mostraron que los lípidos son probablemente un factor determinante en los cambios conformacionales de la detección de voltajedominios de un canal de iones y de voltaje pueden dar forma a las estructuras de algunos de estos canales 11. En el siguiente, vamos a proporcionar una descripción detallada de los métodos y ofreceremos consejos técnicos críticos que probablemente aseguren el éxito de la reproducción de los resultados, así como la extensión de los métodos para los estudios de otras proteínas de membrana.

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Protocol

1. Expresión y purificación de KvAP canal (Figura 1)

  1. Trabajo De Preparación - Día 0
    1. Enjuagar los matraces de vidrio para el cultivo bacteriano con agua desionizada (diH 2 O) y H2O MilliQ (MQH 2 O) para eliminar trazas de detergente de lavado de vajillas en general.
    2. Autoclave 1.000 ml de medio LB en 2.8 L Erlenmeyer (un total de dos litros de la cultura como un ejemplo aquí). Se encontró baja dureza del agua a ser importante para el éxito del cultivo de las bacterias transformadas.
    3. Autoclave de 100 ml de medio LB en matraces de 500 ml
    4. Transformar 60 l de células competentes XL1-Blue con 200 ng del plásmido pQE60 que contiene el gen de la KvAP con un sitio de corte de la trombina y de una etiqueta His 6 en su extremo C-terminal, la placa de las bacterias en dos placas de LB-agar que contenían 100 g / ml de ampicilina, y se incuba ellos para 14-16 horas en un 37 ° C incubadora.
  2. Expresión de KvAP - Día 1
    1. Compruebe la aplicaciónearance de las colonias bacterianas de las placas después de la incubación durante toda la noche. Las colonias eran generalmente solamente cerca de 0,2 a 0,5 mm de diámetro, y había un montón de ellos. No queremos que las placas que albergan grandes colonias rodeadas de una gran cantidad de colonias satélites.
    2. Añadir 5,0 ml de medio LB a cada placa LB-agar se incubaron durante la noche y desechos fuera de las colonias. Transferir la suspensión de bacterias en 100 ml de medio LB en autoclave en un matraz de 500 ml. Añadir ampicilina a una concentración final de 100 mg / ml, se incuba la pequeña cultura durante ~ 1 hora a 37 ° C o hasta DO600 alcanza 0,60.
    3. Mientras tanto, el lugar dos matraces con 1,0 l de medio en un 37 ° C incubadora de agitación para calentar el medio, y se preparan 20 ml de BaCl2 (1,0 M; 10 mM de concentración final en cada cultivo L 1,0), 2,0 ml de 0,4 M IPTG (isopropil-tio-β-galactósido), y 2,0 ml de 100 mg / ml de caldo de ampicilina en agua.
    4. Una vez que la pequeña cultura está listo, añadir 10 ml de BaCl2, 1,0 ml de ampiciStock LLIN, y 50 ml de pequeña cultura de la etapa 1.2.2 a los medios LB precalentado. OD600 debe estar alrededor de 0,05. Mira para la precipitación es posible debido a la alta dureza del agua y los contra-iones en los medios LB. Ba 2 + se sabe que se une al dominio de poro del canal de potasio y los bloques de la corriente iónica, y por lo tanto disminuye la toxicidad de la expresión de alto nivel de los canales a las bacterias.
    5. Tome DO600 cada hora hasta que llega a 0,70, y cada quince minutos hasta que llega a 0,8 a 0,9. En nuestro set-up, por lo general toma ~ 5 horas para llegar a 0,8.
    6. Añadir 0,40 mM de IPTG para iniciar la expresión inducida de la proteína de canal, y se incuba el cultivo durante otra 4,0 horas a 37 ° C con 225 rpm agitando.
    7. Bacterias de la cosecha en botellas de centrífuga 1,0-litros por girando a 4000 x g, 4,0 ° C durante 15 min. Decantar el sobrenadante en lo posible en un vaso de residuos, añadir 10 ml de 1,0 M tampón fosfato de Na para precipitar todas Ba 2 +, y luego añadir unpequeño volumen de cloro para matar las bacterias. Mantenga las bacterias cosechadas en las botellas de centrífuga enterrados en el hielo en un 4,0 ° C ambiente frío durante la noche.
  3. La purificación de la proteína KvAP (Día 2 y 3; Figura 1B)
    1. Resuspender el sedimento bacterias en 15 ml de tampón de lisis por IMAC 1,0 L cultura. Añadir ~ 1,0 U de DNasa I, y tres inhibidores de la proteasa de leupeptina, aprotinina y pepstatina A a 1,0 g / ml. El volumen total de cultivo de dos litros fue de ~ 35 ml.
    2. Sonicar las bacterias resuspendidas en un vaso de metal enterrado en hielo durante 10 min total de controles sobre el tiempo. El sonicador de microsonda se encuentra en un 5 seg ENCENDIDO / APAGADO 10 segundos con un ciclo de potencia de salida de 40% en una habitación fría ° C 4.0. El ajuste de la potencia de salida se determinó empíricamente de manera que la mayor parte de las bacterias se lisaron sin mucho calentamiento en la solución.
    3. Añadir 0,50 g de n-decil-β-D-Maltósido (DM; Sol-Grado de Anatrace) en polvo seco para el lisado celular tratado con ultrasonidos y se incuba la mezcla durante 30,5 horas a temperatura ambiente (RT) con agitación constante horizontal (~ 100 rpm) con el fin de extraer las proteínas del canal tanto como sea posible. Es importante asegurarse de que el detergente en polvo se haya disuelto completamente en un período de 30-50 min.
    4. Después de la extracción con detergente, eliminar los restos celulares a partir del lisado por centrifugación a 20.000 xg durante 30 min a TA. A la espera de la centrifugación a fin, preparar una columna de LC-Su etiqueta basada (cromatografía líquida de baja presión) como se detalla en el Cuadro 1.
    5. Cargar el sobrenadante de la etapa 1.3.4 en la IMAC preenvasados ​​(i mmobilized m etal ion de un c hromatography ffinity) columna a una velocidad de flujo de 1-2 ml / min que es impulsado por una bomba peristáltica. Alternativamente, la proteína extraída marcada con His se puede incubar con la resina de IMAC para la unión discontinua.
    6. Lavar la resina IMAC mediante la ejecución de 5 volúmenes de lecho de tampón de lavado de IMAC, y 10 volúmenes de lecho de piel de ante de lavado de IMACer más 20 mM imidazol. Un monitor de UV en línea se utiliza para asegurarse de que el lavado sea limpio.
    7. Se eluye la proteína KvAP mediante la aplicación de tampón de elución IMAC contiene 300 mM imidazol. La mayor parte de la KvAP unida se eluye en 6 ml de tampón de elución a través de la columna. Añadir trombina (1,0 U por 2.3 mg de proteína) en las fracciones de elución combinados e incubar la proteína durante la noche en el banco para escindir la His 6.
    8. El día siguiente, concentrar la solución de proteína digerida con trombina en un Centricon (MWCO = 30K) hasta 600 l de FPLC de exclusión por tamaño (cromatografía líquida rápida de proteínas). Durante la centrifugación, mezclar la muestra cada cinco minutos para reducir al mínimo la agregación de proteínas. Como se concentra la proteína, la concentración local en el filtro de membrana se hace más alta, y a veces son claras precipitados blancos que de otro modo podría obstruir el filtro de membrana. Asimismo, la alta concentración de proteínas (~ 5-10 mg / ml) en la parte inferior del concentrador conduce a una cejaColor nish y mezcla realmente ayuda a minimizar la pérdida de muestra.
    9. Ejecutar la KvAP concentrada a través de una columna Superdex 200 que es pre-equilibrada con tampón de equilibrado FPLC. Típicamente, el pico de la canal KvAP tetramérica en DM eluye con un volumen de retención de 12,3 ml. Hay una pequeña parte de cola en alrededor de 13,6 ml, que tiene una pequeña cantidad de KvAP monomérica. El vacío de la columna se utilizó está en 7,0 ml, y por lo general la muestra da lugar a un pequeño pico en el vacío, que contiene muy poca proteína KvAP. El imidazol se produce al final de la elución (~ 24 ml). Reunir las fracciones que contienen tetrámeros KvAP juntos y concentrar la solución de proteína de hasta 0,5 ml. Determinar la concentración de la muestra usando un coeficiente de extinción estimado (~ 1,2 E-5.0 M -1 cm -1, que se calculó basándose en el número de residuos aromáticos) de KvAP a 280 nm [ref 12; URL: http:// web.expasyorg / ProtParam /].
      A temperatura ambiente, la KvAP purificada en DM es estable durante al menos una semana sin pérdida sustancial de proteína. A 4 ° C, que podría durar incluso más tiempo. Nunca congele la proteína en los detergentes. Se recomienda almacenar la proteína en la DM a 4 ° C, y la proteína en β-OG a temperatura ambiente. Pero normalmente no esperamos, y procede a la etapa de reconstitución inmediatamente después de las proteínas están listos.
    10. Ensayo de las muestras en un 12% la reducción de gel de SDS-PAGE.
      Las muestras de cada paso descrito anteriormente se prepararon mezclando los 20 microlitros de las muestras con el tampón de muestra de SDS 5x (Tabla 3 para las memorias intermedias) suplementado con 1,0% β-ME. Las muestras no se hierven. Después de geles estaban listos, las muestras habían sido por lo general en el SDS-tampón durante más de 10 min a temperatura ambiente. Después de que el gel se ha ejecutado y se tiñeron con azul de Coomassie, el KvAP de tipo salvaje apareció como una única banda en torno a 26 kDa (Figura 1B

2. Ion Reconstitución Canal

2.1. La preparación de liposomas y la fusión inducida por detergente de vesículas

Antes de la preparación de lípidos, lavar un vaso desechable de 14 ml tubo de ensayo, un tubo de vidrio con tapa de rosca, y una jeringa de vidrio de 250 l con cloroformo. Derrama ~ 10 ml de cloroformo en el tubo de ensayo.

  1. Preparación de palmitoil-oleoil-fosfatidil-etanolamina (PAPA) y liposomas palmitoil-oleoil-fosfatidil-glicerol (POPG).
    1. Transferir 3,75 mg de PAPA y 1,25 mg de POPG (PAPA: POPG = proporción en peso 03:01) en cloroformo en el tubo de vidrio con tapón de rosca de pre-limpiado y secar los lípidos bajo una corriente continua de gas argón. Cuando no hay cloroformo visible se deja, secar el lípido adicionalmente a vacío ambiente durante una hora.
    2. Añadir 440 l de bajo contenido de sal-tampón (10 mM HEPES, pH 7,4) O agua en el lípido seco y agitar el tubo para hidratar los lípidos. La suspensión de lípidos se ve blanquecina y turbia.
    3. Someter a ultrasonidos la suspensión de lípido en un sonicador de baño de hielo-frío hasta que la solución se vuelve translúcido vesícula (OD410 <0,2).
      Típicamente, para la solución 10 mg / ml de PAPA / POPG en agua o tampón de baja salinidad, hemos operado el aparato de ultrasonidos con 30 seg 30 seg ON y OFF (en hielo) para un total de 15-20 min. Debido al calor generado durante la sonicación, es aconsejable añadir 1,0 mM de DTT en la solución de lípidos con el fin de minimizar la oxidación de los lípidos, y para enfriar el baño de agua del baño de ultrasonidos a 10 ° C o por debajo. El OD410 final es lípido-dependiente. Para ciertos lípidos, puede ser muy difícil llegar tan baja OD. Si eso ocurre, solemos utilizar detergentes para solubilizar completamente los lípidos y permitir-incubación para llegar a una buena distribución de los lípidos en torno a las micelas que contienen proteínas (véase a continuación).
      Un baño de ultrasonido de alta capacidad es importante en order para llegar a OD410 <0,2. Hemos estado utilizando un sistema hecho por el Laboratorio de Materiales Co., Inc (modelo # G112SPIG, Hicksville, NY). La clave para la sonicación adecuada de las vesículas es para asegurarse de que el centro de resonancia en el medio del tubo tiene una fuerte vibración. La vibración varía con el volumen de agua y por lo tanto se puede ajustar. También se encontró empíricamente que el aumento de la viscosidad del agua mediante la adición de una pequeña cantidad de glicerol puede aumentar la eficacia de la sonicación.
      Alternativamente hemos encontrado que el uso de un aparato de ultrasonidos microsonda en contacto con la suspensión de lípidos en un tubo de plástico o de metal puede producir los mismos resultados. La microsonda necesita ser limpiado y que la punta se sumerja en la solución de lípidos. Debido a que las partículas lipídicas se rompen en pequeños pedazos en la superficie de la microsonda, es muy importante mantener la muestra se enfrió, y tienen algunos agentes reductores alrededor para evitar la oxidación de los lípidos insaturados.
      Bajo crioelectrónica microscopy, la mayoría de las vesículas unilaminares sonicadas son 30-50 nm de diámetro (datos no mostrados). La curvatura de los pequeños SUV es tan alta que una pequeña perturbación es suficiente para inducir la vibrante fusión de estas vesículas en los más grandes que son 80-200 nm de diámetro (ver la siguiente).
    4. Añadir 50 l de 3,0 M de KCl y 10 l de 0,50 M DM a la mezcla de manera que la suspensión de lípido final tiene 300 mM de KCl y 10 mM de DM. Incubar la solución con rotación horizontal durante 2 horas a TA para formar lípido / detergente micelas mixtas. Después de la incubación, la suspensión debe ser un poco turbia bits (Figura 2A), que es debido a la fusión inducida por detergente de las pequeñas vesículas unilamelares.
    5. Cuando la proteína se concentra a más de 2,0 mg / ml, añadir 0,50 mg de proteína KvAP, 50 l de 3,0 M de KCl, 16 l de 0,50 M de stock DM en agua, y 10 mM de HEPES, pH 7,4 a la mezcla de lípido / detergente a hacer 1 ml de volumen final. El final de lípidos: peso de proteínas es 10:01y la concentración final de la DM es 18 mM (Figura 2A). Incubar la mezcla de proteína / lípido / detergente en el tubo de vidrio con rotación horizontal para otras 2 h.
      La selección de la concentración de detergente es guiado por la fusión de vesículas detergente inducida y la solubilización de vesículas 13. Cuando las vesículas se forman por la fuerte sonicación, su diámetro promedio está en el intervalo de 30-50 nm bajo EM. Estas vesículas tienen muy baja dispersión a 410 nm. A bajas concentraciones, los detergentes se insertan primero en las vesículas, desestabilizar las vesículas, e inducir la fusión de vesículas detergente-saturados (OD410 sube; véase la Figura 2A). La fusión de vesículas conduce al aumento de los OD410 nm. Para 10 mg / ml PAPA / POPG vesículas, las OD410 picos en torno a 15 mM DM. Cuando se introducen más detergentes, las vesículas se empiezan a romper en pedazos y los lípidos quedan dividido en detergente / lípidos micelas mixtas. Este último proceso está acompañado por eldisminuir de OD410 a un nivel bajo final (<0,1).
      A causa de los eventos de fusión de activos en la fase de aumento de la densidad óptica debido a la fusión inducida por detergente de pequeñas vesículas, es muy probable que las proteínas / detergente micelas se fusionan activamente con las vesículas lipídicas detergente-saturados. Esa es la razón detrás de la selección de 18 mM DM en el momento de la preparación de la proteína / lípido / mezcla de detergente. Si el detergente concentrado se convierte en más de 4 pliegues, la cantidad de las necesidades de DM que se ajusta de modo que la concentración final es todavía alrededor de 18-20 mM. Cuando el rendimiento de proteína es muy bajo, es difícil evaluar la cantidad de detergentes concentrados están en la muestra, nos mezclamos en lugar de la proteína con lípidos totalmente solubilizados, y utilizamos la mezcla totalmente equilibrada para la reconstitución. En nuestras manos, si no hay suficiente tiempo se dejó llegar a una buena distribución de equilibrio de los lípidos entre la proteína que contiene micelas y libres de proteínas, la reconstituteficiencia ion se redujo significativamente. Por lo general, a prueba la eficacia de reconstitución de dos experimentos: 1) examinar la co-migración de la proteína con la fracción de vesículas en una ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa; 2) extraer las proteínas de las vesículas reconstituidas, y se fraccionan en un gel- columna de filtración para encontrar la cantidad de proteína (KvAP en nuestro caso) sigue siendo tetrameric. El tiempo mínimo de incubación de las proteínas / lípidos / detergentes es un par de horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados.
      Para obtener una nueva proteína de membrana que es estable en un detergente diferente, el primer paso es encontrar la propiedad solubilización de los lípidos por un detergente tal, similar a lo que se mostró en la Figura 2A. A continuación, es aconsejable comenzar con los extractos de PC, tales como la E. coli polar PC extracto, extracto de la semilla de soja PC etc, de modo que si la proteína específica necesita ciertos fosfolípidos para su función, puede estar ya incluido en la extracciónmezcla de lípidos ted.
  2. Preparación de la KvAP en mezcla con detergente solubilizado en 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-succinato (DOGS) --- un ejemplo de solubilización de lípidos completa para la reconstitución
    1. La preparación de lípidos es el mismo que para PAPA / POPG vesículas. La sonicación de lípidos hidratados en pequeñas vesículas unilamelares necesita más tiempo (por lo general 45 a 60 min) que el PAPA / POPG lípidos (usualmente 5-10 min). Las vesículas Los perros pueden fundir lentamente entre sí y formar pequeñas gotitas aceitosas.
      Debido a la dificultad en la toma de terrenos de alta calidad de DOTAP y perros reproducible, por lo general solubilizar estos dos lípidos completamente antes de mezclar con las proteínas.
    2. Para solubilizar el DOTAP o perros completamente, las vesículas sonicadas se mezclan con 10 mM de DM y 40 mM de n-octil-β-D-glucósido (β-OG). La mezcla de lípido / detergente se incuba durante la noche (> 15 h)a temperatura ambiente, y la mezcla no debe tener ningún pequeñas partículas o gotitas. Pero en cambio es bastante clara. Si no se alcance el equilibrio completo en este paso dará lugar a la formación de una fracción significativa de las vesículas multilamelares.
    3. Mezclar la proteína KvAP con el DOTAP o perros detergente-solubilizado en una relación proteína: lípido que es menor o igual a 01:10. La mezcla de proteína / detergente / lípido se dejó incubar a temperatura ambiente durante 2-3 horas con rotación de extremo a extremo.

2.2. La eliminación de los detergentes para formar proteoliposomas

  1. Diálisis --- retirada lenta de los detergentes, como DM y β-OG, que tienen concentraciones relativamente altas micelar crítica (CMC ≥ 1,0 mM)
    Preparar tampón de diálisis de 2 litros (Tabla 3) para cada mezcla de 1,0 ml.
    Cortar una longitud adecuada de tubo de diálisis (MWCO = 10K, 0.70 cm de ancho), y lavarlo con agua DI. Es importante revisar y hacerAsegúrese de que no hay fugas en el tubo. Para muestras sensibles, el tubo puede ser tratado primero con un tampón de 10 mM de Tris-HCl pH 8,0 y 2,0 mM de EDTA, y luego ser limpiado en agua hirviendo durante 3-5 min. El tubo se sujeta entonces en un extremo y se enjuaga con el tampón de diálisis.
    Cargar la mezcla proteína-lípido-detergente en un tubo de diálisis. Abrazadera ambos extremos de la tubería con un espacio mínimo dejado por encima de la solución. Poner el tubo de carga en el tampón de diálisis, y el uso de una placa de agitación de modo que el tubo gira lentamente en solución. Cambiar el tampón de diálisis una vez cada 8 horas. Después de que el primer cambio de tampón, la solución se enturbie debe si la mezcla proteína-lípido-detergente era completamente clara. Si la diálisis es demasiado rápido, puede haber sólido de color blanco precipitados en la parte inferior de los tubos de diálisis. Se recomienda que en el momento de cambio de tampón, el tubo debe ser frotado, y se invierte varias veces. Después de cinco cambios de tampón de diálisis, las vesículas suelen estar listos.
    Comprobamos la cantidad residual de detergentes por disparos de las vesículas en la bicapa lipídica. Cuando hay cantidad aún considerable de detergentes a la izquierda, la bicapa se rompe de forma casi instantánea. También es posible medir el detergente residual mediante el uso de método colorimétrico o la medición de la tensión superficial de la suspensión de vesículas.
  2. El uso de perlas de poliestireno para ayudar a eliminar los detergentes que tienen una baja CMC
    En muchos casos, tenemos que usar detergentes de baja CMC, como DDM (CMC ~ 0,17 mM en agua). Cuentas con pequeños poros hidrófobos se utilizan para eliminar estos detergentes 14.
    1. Preparación de las perlas. Pesar 0,5 g de granos secos y ponerlos en un tubo de 50 ml Corning, añadir 20 ml de metanol, sonicar la solución en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos para eliminar las burbujas atrapadas, la desaceleración de las cuentas a 5.000 rpm durante 5 min, y luego decantar más metanol. Repita el lavado con etanol y agua Milli-Q. Las perlas lavadas se almacenan en etanol al 20% a 4 ° C, ynecesitar ser cambiado a un tampón libre de detergente antes de su uso.
    2. Estimar la cantidad de detergentes en la mezcla de proteína / lípido / detergente a ser tratado, y calcular la cantidad de granos necesarios para eliminar los detergentes. Por DDM y DM, la capacidad de unión es de aproximadamente 100 mg de perlas de 10 mg detergentes. Los gránulos húmedos sin exceso de agua se pesan, y se añaden directamente a la mezcla de proteína. Se requiere al menos 15-20 min para las perlas de ser plenamente eficaz y la disminución de la concentración de detergente alcanza un nivel constante 14-16. Para eliminar 8,7 mg de DDM (dodecil-maltósido) en 1,0 ml de solución, equivalente a ~ 18 mM, un total de 87 mg de perlas de poliestireno, tales como Bio-Beads SM2, se utiliza en cinco fracciones iguales. Mezclar la mezcla de proteína / lípido / detergente con cada fracción durante 20-30 min con rotación de extremo a extremo constante a temperatura ambiente, girar hacia abajo las perlas, transferir el sobrenadante a la siguiente fracción de perlas, y repetir hasta el final.
      Cuando el detergente Concentrción alcanza su CMC, que intencionalmente extender el período de tiempo para que una hora para que la pequeña cantidad de detergente en la solución facilitará la fusión de vesículas pequeñas en las grandes.
    3. Para eliminar la cantidad de trazas de detergentes después de la última etapa, añadir 35 mg de Bio-Rad SM2 perlas y se incuba con las vesículas de 4 hr.
      Cuando los procedimientos para la eliminación del detergente descritas anteriormente son para ser aplicado a una nueva proteína, es generalmente aconsejable comenzar con la proporción de proteína / lípido (peso / peso) de ~ 1:10. La mezcla lípido / detergente tiene que estar preparado con cuidado para que suficientes detergentes se añaden para disolver completamente los lípidos (Figura 2A). Es importante para la incubación de la mezcla de lípido-detergente durante más de 2 horas a temperatura ambiente (con DTT 1-2 mM) con agitación constante (400 rpm) o la rotación de extremo a extremo. Cuando la proteína se mezcla con lípidos, la mezcla de proteína / lípido / detergente debe ser incubado el tiempo suficiente (durante la noche si la proteína es Stable) en cualquiera de temperatura ambiente o en una habitación fría de manera que la distribución de los detergentes y lípidos entre las micelas que contienen proteína y micelas libres de proteína es relativamente uniforme. Además, si se emplea rápida eliminación de detergentes mediante el uso de BioBeads, es importante averiguar la capacidad detergente de unión de las perlas. La eliminación lenta de detergentes probable que asegura que las proteínas tendrán suficientes lípidos para mantener su integridad y convertirse insertado en vesículas relativamente considerables.

2.3. El almacenamiento de la proteoliposoma y el control de calidad

  1. Una vez que las vesículas están listos, prepararlos en 50 alícuotas y flash a congelar las alícuotas de la inmersión directa en nitrógeno líquido. Las vesículas congeladas se almacenan a continuación en un congelador a -80 ° C. Para los ensayos bioquímicos, que no usamos vesículas congelados porque el ciclo de congelación-descongelación se encontró a veces para introducir artefactos en nuestra reacción cys-específica. Para la grabación eléctricas, y sólo la usamos vesículas que se almacenan en -80 ° C durante menos de 6 meses.
  2. Flotación de las vesículas en un gradiente de densidad (Figura 2B)
    1. Cargar 50 l de la suspensión de vesículas en la parte superior de las capas de gradiente de sacarosa que contienen 0,3 ml cada uno de 10, 35 y 55% de sacarosa hecho en 10 mM de HEPES y giran a 200.000 g durante 4 horas a 4 ° C. Acelerar y decelerar lentamente para evitar la interrupción de la interfaz entre las capas.
    2. Recoge 100 l fracciones de la parte superior a la inferior y ejecutarlos en un no reductor SDS-PAGE (Figura 2B). El KvAP se tiñe bien con el azul de Coomassie de tal manera que una banda de 0,5-1,0 microgramos de proteína es claramente visible. La proteína KvAP se debe encontrar en la interfaz entre 10 y 35% de sacarosa. No hay pesados ​​agregados de proteínas se observan en el rango de alta densidad, lo que indica que casi todas las proteínas se encuentran en las membranas.
  3. Compruebe la correcta conformación del canal KvAP en vesículas. <br /> Nuestros datos anteriores establecen que un único mutante de cisteína (L125C/C247S) KvAP, cuando se integra adecuadamente en bicapas, está totalmente enterrado en las membranas, y no se puede acceder por reactivos específicos cisteína-8. Los procedimientos de reconstitución se pusieron a prueba con este canal mutante, y verificados por un reactivo Cys-específica, MTS-PEG5000. La modificación en L125C con 1,0 mM de reactivo MTS a temperatura ambiente presenta un cambio de 5 kDa a la banda KvAP en un gel de SDS-PAGE no reductor. La implementación exitosa de nuestros procedimientos de reconstitución debe dar lugar a ninguna reacción detectable para los canales mutantes L125C en las membranas de fosfolípidos, lo que sugiere la inserción casi completa de todos los canales en bicapas. Como control positivo de la reacción, 5,0 mM de DM se introduce para hacer casi todos los residuos L125C en los canales mutantes accesibles para el reactivo MTS.
    Alternativamente, una toxina de poro de unión, tales como chrybdotoxin, se puede utilizar para contar los canales tetraméricos. Una base de anticuerpos vinculantedecir (ver Cuadro 2, donde Fv se prepara como un ligando conformación específica para KvAP) podrían ser utilizados para cuantificar los sitios de unión disponibles en las vesículas reconstituidas. Estos ensayos de unión se pueden comparar con un ensayo cuantitativo de la medición de la proteína total con el fin de averiguar qué fracción de los canales reconstituidos son tetrámeros y qué fracción de la proteína tiene la paleta del detector de voltaje (S3/S4 del sensor de voltaje) correctamente doblado.
    Para otras proteínas para ser reconstituido, es aconsejable introducir un método cuantitativo para evaluar qué fracción de las proteínas reconstituidos está correctamente plegada. Exploración funcional cuidadosa es por lo tanto un requisito previo para el desarrollo de un buen control de calidad para la reconstitución exitosa.

3. Aplicaciones de las vesículas reconstituidas Canal que contienen

3.1. Estudio funcional de las actividades del canal de iones en las membranas lipídicas negras.

Preparación de nmateriales ecesarios.

  1. Preparación de lípidos
    1. Limpiar un vaso tubo de ensayo, un vial de color ámbar con tapón de rosca de teflón de superficie, y un conjunto de jeringas de vidrio con cloroformo. Secar el vial de color ámbar bajo una corriente de gas argón.
    2. Transferencia 0,75 mg y 0,25 mg PAPA POPG en cloroformo en el vial de color ámbar y se evapora el cloroformo con gas argón.
    3. Lave los lípidos secos con 0,20 ml de pentano y seque completamente para eliminar el cloroformo residual. Finalmente disolver los lípidos en 50 l decano. Los lípidos en decano (20 mg / ml) se utilizan para el pintado de una bicapa lipídica a través de un orificio de 150-250 micras (Figura 3B) perforado en la porción adelgazada en un lado de una taza de bicapa experimental (Figura 3A).
  2. Preparación de soluciones
    1. Solución intracelular (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM de KCl
    2. Solución extracelular (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM de KCl
    3. Sal puente: Curva de capilares de vidrioen puentes en forma de U, y llenarlos con agar fundido 1,0% disuelto en solución extracelular.
      Se encontró que el gradiente osmótico que se establece entre las soluciones de trans y cis de ser el principal motor de la fusión de vesículas en la bicapa lipídica 17. Para lípidos cargados negativamente, 15 mM de CaCl2 o cargados positivamente péptidos poli-Arginina se encontró que eran capaces de inducir eventos de fusión. Lípidos fusogénicos, como DOTAP y perros, etc, podrían ser introducidos en los lípidos vesículas de modo que la probabilidad de eventos de fusión es mayor.

Los registros eléctricos de los canales KvAP en bicapas lipídicas

  1. Pre-pintar el agujero redondo (diámetro ~ 0.25 mm) que se perfora en la superficie cilíndrica de la copa bicapa (Figura 3B). Los lípidos se transfieren con una mano de mortero capilar que se hace en el laboratorio. La cabeza redonda de la mano del mortero capilar se pule y no raye la superficie de la taza. The pequeña cantidad de lípidos realizadas por la mano del mortero capilar se extiende alrededor del orificio en la copa bicapa, y secado al aire.
  2. Esperar durante 1-2 minutos para que el decano se evaporará completamente. Se debe tener cuidado para evitar la solución de lípidos de entrar en el agujero.
  3. Inserte la cubeta en la cámara de grabación, y poner en los puentes de sal y conectar los electrodos a los dos lados de la taza de la grabación (Figura 4A). Añadir el cis-y trans-solución a los dos lados del agujero. Un gradiente osmótico se estableció para facilitar la fusión de las vesículas en la bicapa lipídica.
  4. Ajuste el potencial de desplazamiento entre las dos caras de la copa a ~ 0 (usualmente <2 milivoltios). Utilice la mano del mortero capilar para transferir una pequeña cantidad de mezcla de lípidos en decano, y pintar el lípido a través del orificio hasta que se forma una membrana bicapa. La formación de la bicapa se detecta mediante el registro de la corriente capacitiva durante la entrega de un pulso de rampa.
  5. Espera a que la membranase adelgaza y se vuelve relativamente estable. Esperamos a que no hay más cambios en la capacitancia de la membrana durante 3-5 min.
    El pensamiento general acerca de la bicapa plana formada a través de un agujero grande es que la porción muy medio de la membrana está cerca de ser ~ 4,0 nm de espesor como una bicapa regular, y la membrana sea más espeso cuando se pone cerca del borde del agujero, donde hay un anillo alrededor y la mayoría del disolvente decano es 18, 19. Es inevitable que hay decano residual que queda en la parte central de la bicapa de la membrana. Pasado estimación de la relación en volumen de n-decano frente a PC fue 0,35-0,45 después de que el adelgazamiento de la bicapa 18, 20-22. EM examen de la bicapa adelgazada mostró que había lentes de decano intercaladas entre las dos valvas de una bicapa 22. Estos datos sugirieron que las proteínas de la membrana insertados en las membranas bicapa de lípidos coexisten con las islas pequeñas (hasta 50 nm de diámetro) de decano. El decano residual in la bicapa también disminuye la constante de 0,4-0,5 mF / cm 2, que se puede utilizar para obtener una estimación aproximada del tamaño de la bicapa adelgazada sobre la base de la capacitancia medida la capacidad eléctrica. Una bicapa de 100 pF de capacitancia proviene de una membrana bicapa circular de ~ 180 micras de diámetro.
    Para KvAP, el decano residual no perjudicar su compuerta dependiente de la tensión, a pesar de que la función de los canales no se ha examinado con cuidado en una bicapa libre de disolvente. La misma parecía ser cierto para los canales Kv1.2 NaChBac y los canales insertados en la BLM 23. Aún no está claro si el importante desplazamiento a la izquierda de la curva de GV medida desde los canales Kv1.2 en la bicapa lipídica decano-relativa a los canales en los ovocitos tiene nada que ver con el decano residual 23. Dependiendo de los lípidos utilizados en la formación de las bicapas, la cantidad de la decano residual en la bicapa puede variar. Por ejemplo, se informó de que la formación de lípidos plana membrAnes de MGDG (mono-galactosil-diacilglicerol) requiere el decano, posiblemente debido a las grietas entre el MGDG cónica está lleno de moléculas decano. Si el decano residual tiene efectos sobre las proteínas a estudiar es puramente empírica, y se necesita la prueba experimental para determinar si el efecto es significativo o no.
  6. Tan pronto como la membrana se vuelve estable, disparar 0,5-1,0 l-canal que contiene vesículas mediante la colocación de la punta fina de una punta de pipeta de P2-derecha por encima del orificio. Las vesículas caen hacia abajo a través del agujero de la parte inferior de la copa.
    Durante este proceso, múltiples vesículas se unen a la membrana a través del agujero. Dado suficiente tiempo, algunos están fusionados en la porción de dos capas de manera que un pequeño número de canales KvAP se han insertado correctamente en la bicapa plana en la parte central de la membrana. Tanto gradiente osmótico y la interacción electrostática son importantes en la fusión de las vesículas en las bicapas lipídicas 17, 24.
  7. Para probarlos canales KvAP en la bicapa, un pulso corto de 80 mV se entrega desde el potencial de mantenimiento de -80 mV. Debido a la inactivación rápida y lenta recuperación de la inactivación, un intervalo largo (~ 120 segundos para los canales en las membranas de PE / PG) se da entre dos impulsos. Una grabación de corriente típico de los canales en una membrana de PAPA / POPG se mostró en la Figura 3C. Si la corriente es pequeña, captando las vesículas. Una vez que la corriente se ve bien en tamaño, equilibrar las concentraciones de iones en las soluciones en ambos lados de la membrana. Los canales están listos para los experimentos electrofisiológicos.

3.2. La detección de ligandos específicos de conformación contra los canales en vesículas

  1. Introducción de la biblioteca de fagos.
    El fago biblioteca de péptidos 20-mer está presente en el extremo N-terminal de las cinco copias de proteínas-pIII en un extremo del bacteriófago filamentoso fd-tet 25. La biblioteca presenta aprox. 1 x 10 8 difierenrentes tipos de azar secuencias de péptidos 20-mer, y se proporcionó amablemente a nosotros por el laboratorio del Dr. Brown Kathlynn de UT Southwestern Medical Center 26. La infección por el fago en el E. coli K91 hace que las bacterias resistentes a 12 mg / ml de tetraciclina.
    Un procedimiento detallado para el cultivo bacteriano, la amplificación y la titulación de los fagos y la secuencia de las colonias de fagos ha sido descrita por McGuire, et al. 26 Vamos a dar una breve descripción de las operaciones básicas en la siguiente sección. Los lectores pueden encontrar más detalles en el documento de McGuire. Lugar nos centraremos en el aislamiento de clones específicos que se unen fuertemente a los canales iónicos reconstituida en vesículas (Figura 4A).
    La idea básica detrás de nuestra pantalla es que los fagos unidos a los canales reconstituidas específicamente se puede tirar hacia abajo con las vesículas. El fago unido se puede amplificar y probado contra los canales en las membranas lipídicas. Nuestro estudio delos cambios conformacionales de sensores de voltaje KvAP en diferentes membranas lipídicas 8 mostraron que es posible mantener los sensores de tensión en cualquiera de los estados de "reposo" "activado" o por la conmutación de los lípidos de fosfolípidos regulares a los que no contienen fosfatos en las regiones grupo de cabeza (DOTAP y perros en nuestros experimentos). Estas dos conformaciones lípidos determinados se utilizan en nuestra selección de ligandos específicos de conformación. La biblioteca de fagos será primero ser saturado por los canales en las vesículas de fosfolípidos (selección negativa) antes de ser seleccionado para aglutinantes ajustados a los canales de DOTAP y perros membranas (selección positiva).
  2. Procedimientos básicos detrás de la selección de fagos
    Crecimiento de bacterias K91 en medio LB: El tiempo de duplicación de las bacterias es de aproximadamente 20 min a 37 ° C con 200 rpm agitando.
    La amplificación de la biblioteca: Mezclar la solución de fago con la bacteria K91 en OD0.4. Después de 15 min de incubación a 37° C, las mezclas se extienden uniformemente sobre -9,5 pulgadas x 2 placas de agar que contienen 9,5 12 g / ml de tetraciclina, el uso de grandes placas impide el dominio de la cultura por las bacterias que tienen una mayor tasa de crecimiento. Una vez que la diversidad de la biblioteca es más pequeña, 10 cm de placas de Petri se utilizan para la selección y amplificación de pequeña escala.
    Amplificación a gran escala de clones individuales: Inocular una pequeña alícuota de fagos (~ 100 millones) en 250 ml de LB más el 5 mM MgSO 4 y 12 mg / ml de tetraciclina, crecer durante la noche a 37 ° C. Recoger las células por centrifugado 6000 rpm durante 10 min. Recoger el sobrenadante y añadir en ella 0,2 vol / vol de la precipitación de amortiguación (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Después de la incubación en hielo durante 1,0 h, se centrifuga la solución a 17.000 xg durante 30 min para sedimentar todos los fagos. Eliminar todo sobrenadante, añadir 1,0 ml de PBS, se incuban en hielo durante 30 min, resuspender suavemente el sedimento (sin agitación). Transferir la suspensión a un tubo nuevo, y se centrifuga a 14,000 rpm durante 2 min. Transferir el sobrenadante a otro tubo, y se incuba en 65 ° C baño de agua durante 15 minutos para matar todas las bacterias. Centrifugar el tubo durante 2 minutos a 13.000 rpm. Se desecha el precipitado, alícuota y almacenar la solución de fago a -80 ° C.
  3. Panorámica de los fagos contra los canales KvAP en vesículas lipídicas.
    1. Los fagos péptido-se presentan necesitan ser amplificada y se titularon antes de nuestros experimentos de manera que se conoce el número de fagos por unidad de volumen. KvAP se reconstituyó en POPE / POPG (03:01) más 0.50% vesículas biotina-DOPE como control negativo, y en PERROS: biotina-DOPE (199:1; mismo se hizo para DOTAP vesículas) se utiliza como el objetivo de selección. La concentración final de KvAP en vesículas es 0,50 mg / ml, y los lípidos son 5,0 mg / ml. El tampón de paneo contenía 500 mM de KCl, 100 mM de HEPES / KOH pH 7,4, y 0,10 mg / ml de BSA.
      En la primera carrera, ~ 10 10 fagos (100 ejemplares de cada tipo) se diluyeron a 0.050 ml de medio LB. Para los pasos siguientes, el paneo starting fago se ajustó a estar dentro de 6 10-08 10.
    2. Selección negativa:
      Incubar los fagos diluidos en 50 l LB con 100 l perlas de agarosa neutravidina (capaz de unirse a 1-2 mg de BSA biotinilada por ml de resina; Pierce) en 1,0 ml de tampón de paneo. Después de 10 minutos de incubación, separar las perlas por hilado de ellos a 100 xg durante 1,0 min. Repita este paso dos veces para eliminar los fagos que se unen directamente a las cuentas.
      Mezclar los fagos sobrantes de la etapa anterior con 50 l vesículas vacías (PAPA / POPG más 0,5% de biotina-DOPE) que no contienen proteínas. Agregar 100 granos neutravidina l que hayan sido lavados con el tampón panorámica a la mezcla de fagos vesícula. Después de girar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min, eliminar las perlas por centrifugado 100 xg durante 30 seg. Este paso se repite para las vesículas vacías de los perros: biotina-DOPE (199:1), así como para los canales KvAP en PAPA / POPG vesículas (con 0,5% de biotina-DOPE). El sobrenadante después de estos tratamientos contains el fagos totalmente despejado. Después de los dos primeros ciclos de la pantalla, la autorización previa se puede realizar sólo en contra de KvAP en PAPA / POPG vesículas.
    3. La selección positiva
      Incubar los fagos totalmente compensados ​​con canales KvAP en perros: biotina-DOPE (199:1), vesículas (lo mismo para las vesículas DOTAP), en presencia de 100 cuentas neutravidina l a temperatura ambiente durante 10 min. Llevar el volumen de la mezcla a 15 ml usando el tampón de paneo antes de la centrifugación a 100 xg durante 10 min. Recoger las perlas, y lávelos tres veces con 45 ml de tampón de paneo.
    4. Resuspender las perlas en 500 l de medio LB que contiene 5,0 mg / ml de biotina, y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas con el fin de liberar algunos de los fagos unidos de NeutrAvidin, que tiene menor afinidad que la biotina nativa. Se separan las perlas por centrifugado 100 xg durante un minuto. Recoger el sobrenadante y las perlas en dos tubos diferentes para titulación.
    5. Para amplificar los fagos seleccionados, mix 200 l del sobrenadante o las perlas resuspendidas en el último paso con 500 l K91 cultivo bacteriano (OD 600 ~ 0,4-0,6, cultivadas ~ 4 horas antes de que se utiliza). Después de la incubación a 37 ° C durante 15 min, la placa 50 l de cada en placas de tetraciclina para el cultivo de una noche.
      Durante los dos primeros ciclos de la pantalla (Figura 4A), recoger todas las 500 l sobrenadante y las perlas de la última etapa, mezclarlas con la 5 ml de cultivo de bacterias, y la placa en placas cuadradas de 9,5 pulgadas con el fin de recuperar y amplificar todas las colonias de fagos . Este paso es importante para la recuperación de esos fagos que hacen que las bacterias crecen más lentamente que otros.
    6. Las colonias de las placas se amplifican y se titularon antes del siguiente ciclo de panning y selección (véase McGuire, et al., 26).
    7. Examine las actividades de los fagos seleccionados positivamente en los canales.
      Después de 10 a 12 ciclos de selección, prueba del total de fagos amplificados en los canales KvAP en bila lípidosyers hechos de PAPA / POPG. Si hay una fracción significativa de los clones positivos, los fagos seleccionados a 100-500 nM deben bloquear una fracción significativa de los canales en la bicapa (Figura 4B), ya que estábamos seleccionando contra los canales estabilizadas en el estado de reposo. Los datos positivos sugieren que hay clones que mostrarán una unión fuerte a los canales en el estado de reposo. Después de 16 ciclos de selección, elija 50 colonias positivas para la secuenciación de una sola colonia. Los clones de fagos identificados dominantes se seleccionan a partir de la comparación de las secuencias, y se amplifican y se ensayaron frente a canales en bicapas. Una vez que se confirman los clones positivos, sintetizar los péptidos portados por los fuertes clones positivos y probarlos en los canales y para confirmar sus actividades conformación específicos.

3.3. La cristalización de canales KvAP en membranas para la estructura de determinación 27-29

  1. Para estabilizar la conformación deel canal, un aglutinante específico de conformación de la canal, proteína Fv de 33H1, se utiliza para formar el complejo KvAP / Fv. La preparación de la proteína Fv se detalla en el cuadro 2. Se purifica el complejo en una columna Superdex 200. El complejo eluye a alrededor de 11,4 ml en nuestro sistema.
  2. En la pantalla inicial, mezclar la proteína con DMPC o POPC que está completamente solubilizado en DM o β-OG. La mezcla de proteína / lípido / detergente se mezcla durante más de 15 horas con el fin de llegar a un equilibrio termodinámico en la distribución de los tres componentes entre las micelas mixtas. Por lo general, primero probamos tres relaciones de lípidos / proteínas diferentes (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) y tres niveles de pH diferentes (6.0, 7.0 y 8.0). El tampón de diálisis contiene 20 mM de tampón de fosfato potásico, 100 mM de KCl, 3,0 mM y NaN3. El tampón de diálisis se cambió cada 2-3 días. Una pequeña alícuota de los cristales se sacan cada 2-3 días para examinar la formación de vesículas y la posible aparición de la red cristalina.
    Una lista de los tabloidesde LPR vs pH se utiliza para determinar el comportamiento de la proteína en los dos tipos diferentes de lípidos. Se desea obtener vesículas de tamaño relativamente grande (más de 150 nm) o en hojas de membrana de diálisis cuando las muestras se examinaron por EM tinción negativa. Un pequeño patrón regular en las membranas sugiere un éxito y se puede usar para guiar una mayor optimización.
    EM Negativo-manchas: rejillas de cobre recubiertas con películas de carbono (~ 5.3 nm de espesor) se brillan descargada en el aire para que la superficie hidrófila de carbono. Un pequeño volumen (2-3 microlitros) de la suspensión de cristales se carga en la superficie del carbón, y se incubaron durante 0,5-1,0 min. Seque las rejillas por la banda con un borde roto de una pieza de papel de filtro Whatman # 4. Voltear la rejilla y se incuba durante ~ 15 segundos en la parte superior de una gota de solución de tinción de 150 microlitros (2,0% de PTA / KOH, pH 8,0 en agua más 0,5% de trehalosa, o 6,0% de molibdato de amonio / KOH, pH6.3-6.5 , en agua más 0,5-1,0% de trehalosa). Seque tanto como sea posible la solución de tque la superficie de la rejilla y deje que la parrilla se seque antes de insertarlo en un TEM para su examen. Imágenes de vesículas se toman en condiciones de baja dosis para evitar el daño de cualquier embalaje cristalino por los electrones.
  3. La pantalla se expande a continuación, para examinar pasos más pequeños de LPR con el fin de llegar a una LPR correcta. Si las proteínas son adecuadas para la cristalización, una red pequeña de las proteínas en las membranas puede hacerse visible. Alrededor de estas condiciones iniciales, optimizar aún más la cristalización mediante la variación de los tipos y concentraciones de sal, la temperatura, la velocidad y los métodos de eliminación del detergente, cationes divalentes, los detergentes utilizados para preparar las proteínas, precipitantes, la composición de los lípidos, etc
    Los cristales 2D optimizadas de complejo KvAPΔ36/Fv crecen en grandes hojas que van desde unas pocas micras a 20-30 micras (Figura 5A). En condiciones cryoEM, los cristales muestran claramente red cuadrada con evidente simetría cuatro veces como se esperaba desde el cuatro veces simétrica chanNels (Figura 5B y C).

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Representative Results

El flujo general de los experimentos para la purificación de la canal en KvAP homogeneidad bioquímica se describe en la Figura 1A. Las muestras típicas durante la expresión y purificación de la proteína se mostraron en el gel de SDS-PAGE en la Figura 1B. La proteína después de la purificación IMAC es relativamente puro. El rendimiento de la canal KvAP es de aproximadamente 1,0 mg / litro de cultivo.

La solubilización de las vesículas lipídicas con detergentes debe ser elaborado para cada par de lípidos versus detergente. La solubilización de las pequeñas vesículas unilamelares de PAPA / PAPA por DM se presenta en la Figura 2A, los resultados de la flotación vesículas son por lo general bastante sencillo. Los resultados típicos en el ensayo de SDS-PAGE de las fracciones de los gradientes se mostraron en la Figura 2B. En el gradiente de densidad de sacarosa, las vesículas que contienen canal de PAPA / POPG por lo general se concentran en la interfase entre la capa de 10% de und de la capa de 35%. Los KvAP que contienen DOTAP o perros vesículas son más ligeros y por lo general en la interfaz entre 5% y 10% (un poco penetrado en la capa de 10%). Si hay una fracción significativa de vesículas multilamelares, que por lo general son blanquecinas y se concentró por debajo de la interfaz de 10-35%. Hemos encontrado que esto sucede generalmente cuando la mezcla de proteína-lípido-detergente no se incubó el tiempo suficiente para llegar a una buena distribución de los lípidos.

Los registros eléctricos de los canales KvAP incorporados en bicapas lipídicas planas se muestran en la Figura 3. La traza actual típica muestra que a -80 mV, los canales son tranquilas. El cambio a 80 mV conduce a un pico capacitancia rápida (el picante en el momento de la conmutación de tensión). Un aumento lento de la fase actual sugiere que los canales se activan y son capaces de conducir la corriente de salida de potasio. Después de que el pico de la fase ascendente, la corriente comienza a disminuir, un paso llamado inactivación. El inactivatien toma unos pocos cientos de milisegundos para completarse. Una vez que la tensión se conmuta de nuevo a -80 mV, hay una fase de retorno después del pico de capacitancia a la baja, lo que refleja el cierre de los canales abiertos y se llama la desactivación (Figura 3C).

En el centro de la pantalla fago, hemos probado la actividad de los fagos amplificados en los canales de KvAP en las bicapas de PAPA / POPG. Después de 12 ciclos de selección, los fagos amplificados inhibieron las actividades del canal (Figura 4B, fago seleccionado). Sin embargo, la biblioteca de fagos de partida no mostró ningún efecto sobre los canales (Figura 4B, el control de fago). A pesar de que las actividades de los fagos seleccionados no eran muy altas, ya que sólo una baja concentración de los fagos positivos estaban alrededor, los, efectos reproducibles claros sugieren que hay, clones positivos activos que exhiben alta afinidad de unión, debe ser enriquecido selectivamente durante el restante cy selecciónculos y una vez enriquecidos, es probable que tengan actividades inhibidoras fuertes en los canales de las membranas.

En la primera etapa de cribado los cristales 2D, vimos pequeñas celosías en muchas vesículas pequeñas. Con la optimización, algunas hojas grandes se presentaron con una gran cantidad de pequeñas vesículas alrededor (Figura 5A). Las imágenes cryoEM de estos cristales mostraron siempre una gran cantidad de defectos locales (Figura 5B), lo que sugiere que se requiere una mayor optimización para obtener cristales mejores. Una vez que los cristales estaban bien optimizados, que exhibieron los bordes afilados, y aparecieron como hojas sueltas. A mayor aumento, las unidades individuales son claramente mucho mejor ordenado (Figura 5C).

Nombre de Reactivo / Material de Empresa Número de catálogo Comentarios
Triptona RPI Corp. T60060
Extracto de levadura RPI Corp. Y20020
NaCl Pescador S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Cloruro de Potasio Pescador BP366-500
n-dodecil-β-D-Maltósido Affymetrix D322S Sol-grado
n-octil-β-D-glucósido Affymetrix O311 Ana de grado
La aprotinina RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptina RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatina A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF P7626
DNasa I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
PAPA Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
PERROS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotina-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agaperlas rosa Piercenet 29200
Tubos de diálisis Espectro de Laboratorios, Inc 132-570
Pentano Pescador R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Chemicals M266501

Tabla 1. Lista de reactivos y materiales.

  • Cultivo bacteriano incubadora de agitación
  • Espectrofotómetro
  • Micro-sonda de ultrasonidos
  • Mecedora
  • Centrifugadora piso-modelo para la recogida de cultivo de bacterias y para muestras de concentración
  • Las columnas vacías
  • Columna Superdex 200 conectada a un sistema FPLC

Tabla 2. Equipo necesario.

Nombre comercial Buffer Contenido
El tampón de lisis IMAC 50 mM de Tris (pH 8,0), 100 mM de KCl
Tampón de lavado IMAC 50 mM de Tris (pH 8,0), 100 mM de KCl, y 5,0 mM de DM
Tampón de elución IMAC 50 mM de Tris (pH 8,0), 100 mM de KCl, 5,0 mM de DM, y 300 mM de imidazol
SDS-tampón de muestra (5X) (no reductor) 60 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 25% de glicerol, 2,0% de SDS, 0,10% de azul de bromofenol. (1,0% 2-mercaptoetanol añadido para hacer que el tampón de reducción).
Apilamiento tampón del gel de SDS-PAGE (4X) 0,50 M de Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% de SDS
Tampón de gel de resolución para SDS-PAGE (4X) 1,5 M de Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% de SDS
FPLC equiliración Tris 20 mM, pH 8,0, 100 mM de KCl, y 5,0 mM de DM
Diálisis liposomas 10 mM de HEPES, 100 mM de KCl

Tabla 3. Nombre comercial Buffer y contenido.

Figura 1
Figura 1. Preparación de KvAP para la reconstitución. Una. Flujo de trabajo general de la expresión de la proteína, la purificación y reconstitución. B. purificación bioquímica de la proteína. Cultivo inducido de E. coli XL1-blue KvAP expresar fue procesado y KvAP purificado. Veinte microlitros de cultivos de células antes (carril 1) o después (carril 2) de inducción, el extracto de detergente (carril 3), flujo a través de cromatografía de IMAC (carril 4), dos etapas de lavado (carriles 5,6), y 5,0 g del total proteína después de la300 mM de imidazol de elución (carril 7) y 5,0 g de la KvAP tetrámero de la FPLC de exclusión de tamaño (carril 8) se sometieron a la no reducción de 12% de SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.

La figura 2
Figura 2. Reconstitución de KvAP en Pope / POPG vesículas. Una. Fusión de vesículas y la solubilización como una función de las concentraciones de detergentes. Absorbancia a 410 nm se utiliza para controlar la dispersión de la luz de las vesículas (línea de base se resta a ninguna fracción de detergente). Lípidos (PAPA / POPG 03:01) eran 10 mg / ml. Las pequeñas vesículas unilamelares fuerte después de la sonicación, se monodispersa y tiene débil dispersión debido a sus tamaños de 30-50 nm de diámetro. Cuando se introdujeron los detergentes, se distribuyen entre la fase de solución y la fase de membrana lipídica. Debido a la fuerte curvatura en la pequeña vesículas unilamelares, el detergente introducido desencadenar la fusión de vesículas y la liberación de la curvatura (de ahí el bajo consumo de energía potencial de la superficie). Las vesículas fusionadas son más grandes en tamaño y muestran dispersión más fuerte a 410 nm. La fase ascendente del pico (área de color gris) por lo tanto, refleja la fusión detergente inducida, un buen régimen de las micelas de proteína de fusión de las vesículas. La concentración del detergente (DM como un ejemplo aquí) a la derecha en el pico de absorción fue de hecho elegido para nuestro proceso de reconstitución. B. Cincuenta microlitros de vesículas reconstituidas KvAP KvAP (0,5 mg / ml) se separó por gradiente de densidad de sacarosa. Las muestras de 100 l fracciones de arriba a abajo (1 ~ 9) del gradiente de sacarosa se analizaron en un 12% SDS-PAGE reductora. El gel fue teñido con azul de Coomassie. Carril 3 contenía ~ 2 g KvAP.

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Figura 3. La actividad eléctrica del canal KvAP en bicapas reconstituidos. A. grabación conjunto-en el interior de una jaula de Faraday, 1; dos electrodos, 2; secundarios trans, cis 3; laterales, 4; puente de sal. B. sección de la porción adelgazada ampliada en un lado de la taza de bicapa que muestra un agujero 5 , que se utiliza para la fabricación de membranas. se registró C. La actividad eléctrica de los canales de KvAP que se fusionaron en la membrana lipídica negro. Durante su detención en -80 mV, el potencial de membrana se pulsó a 80 mV a 150 ms, y luego cambió de nuevo al potencial de reposo. La corriente iónica se registró en el modo de fijación de voltaje usando un amplificador Axopatch 200B.

Figura 4
La Figura 4. La detección de CONFORMACIligandos en-específicos de una biblioteca de fagos. Una. Esquema detrás de la proyección contra los canales de iones reconstituida en vesículas. Las vesículas se dopan con biotina-DOPE, y que se pueden extraer de la solución mediante perlas de NeutrAvidin. La conformación del canal KvAP se controla por los lípidos específicos. Selecciones negativas en contra de los granos, vesículas vacías y vesículas con canales en una conformación diferente se llevan a cabo antes de que los fagos se incubaron con los canales en el estado conformacional de destino (en DOTAP o perros como un ejemplo aquí). Los fagos seleccionados se pueden amplificar y probados contra los canales en bicapas. B. Pruebas de los fagos seleccionados en el centro de la pantalla. La actividad eléctrica de KvAP en la bicapa en diferentes puntos de tiempo después de la adición de los fagos seleccionados: traza negro - antes de la adición; traza amarilla - 2 min después de; rastro rojo - 10 min después de la adición Arriba: La biblioteca de fagos de partida (total. ~ 10 10 fagos añadidoa la bicapa) se puso a prueba en los canales en bicapa, y se encontró que no tienen actividad detectable debido a que cada clon de fago tiene sólo alrededor de 100 copias Parte inferior:. Después de 12 ciclos de selección, los fagos eran todavía una mezcla de diferentes clones. Adición de unos 10 10 fagos de los canales en la bicapa de plomo a la clara inhibición de la actividad del canal, lo que sugiere que hay clones positivos que deben tener una alta afinidad. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 5
Figura 5. La cristalización en dos dimensiones de KvAP en las membranas. A. Imagen de cristales de la capa de tinción negativa individuales 2D en el medio de la optimización del cristal. Los cristales se tiñeron con 6,0% de amoniomolibdato, pH 6,4 más 0,50% de trehalosa. Debido a que el azúcar, a veces apilados unos con otros. El cuadro cuadrado negro designa un área que da lugar a el patrón de difracción se muestra en el lado derecho con manchas de difracción que van a ~ 20 Å. B. cryoEM imagen de un cristal de 2D a partir de una muestra similar a la utilizada en (A). La muestra se mezcló con 3% de trehalosa y se congela la inmersión directa y fotografiado bajo un cryoEM. La imagen se obtuvo a 50.000 x. Estaba claro que había defectos locales en el cristal de embalaje. C. cryoEM imagen de un cristal más optimizado. La muestra se embebió en 0,75% de tanino y 10% de trehalosa y la imagen fue tomada en 50.000 X. Las líneas rectas y el acondicionamiento hermético sugirieron que los canales estaban bien ordenados en este tipo de cristales. Las dos flechas negras marcan la red cuadrada.

Cajas:

Cuadro 1. Preparación de la columna de IMAC

  1. Volver a suspender la resina IMAC a fondo.
  2. Inmediatamente la transferencia de la cantidad requerida de resina en suspensión a un tubo de 50 ml. Utilizamos 2 ml de volumen de lecho de resina para la purificación de KvAP de 2 L cultura.
  3. Centrifugar el tubo a 700 xg durante dos minutos para que sedimenten hacia abajo la resina.
  4. Retire y deseche el sobrenadante.
  5. Añadir 10 volúmenes de lecho de MQH 2 O y mezclar brevemente para enjuagar la resina.
  6. Centrifugar a 700 xg durante 2 min para sedimentar la resina hacia abajo. Descartar el sobrenadante.
  7. Añadir 10 volúmenes de lecho de MQH 2 O y se vierte en la columna vacía.
  8. Espere hasta que la resina se asienta, y cerca de la columna con un adaptador de flujo para la cromatografía líquida de baja presión.
  9. Ejecutar 5 volúmenes de lecho de MQH 2 O y 5 volúmenes de lecho de tampón de equilibrio a través de la columna.

Cuadro 2. Purificación de Fv

Fv Transformación - Día 1

  1. Transformar100 ng del plásmido que contiene Fv Su 6 a 60 l de células JM83 competentes, placa de las bacterias en cuatro placas de LB-agar que contenían 100 mg / ml de ampicilina, y se incuba durante la noche en una incubadora de 37 ° C.
  2. Preparar 6 X 1 L LB para cultivo bacteriano.

La expresión de Fv - Día 2

  1. Chatarra de todas las colonias de las placas en medio LB. Añadir esta suspensión de bacterias a 6 X 1 L de LB en presencia de ampicilina (100 mg / L) e incubar hasta DO600 alcanza 0,5.
  2. Cuando OD alcanza 0,5, disminuir la temperatura a 20 ° C y 115 RPM para. Cuando la caída de temperatura a ~ 20 ° C, añadir anhidrotetraciclina (100 l de 1mg/ml en DMF a 1 L) para iniciar la inducción de la expresión de la proteína y se incuba otra 5 horas a 20 ° C con agitación normal.
  3. Cosecha de bacterias en 1 L de botella de centrifugación a 4000 xg durante 15 min. Verter el sobrenadante tanto como sea posible. Mantenga las bacterias recogidas en el hielo enuna sala de 4 ° C durante la noche fría.

La liberación de las moléculas Fv de las bacterias - Día 3

  1. Volver a suspender las bacterias en 150 ml de Fv de liberación de tampón (Tris 50 mM, pH 8,0, 20% de sacarosa, 1,0 mM de EDTA).
  2. Mientras se agita con una barra de agitación magnética, añadir lisozima a 0,1 mg / ml y mantener las bacterias en hielo durante 30 min. Después, añadir MgCl2 y 2,0 mm y mantener en hielo para otro 10-15 min.
  3. Centrifugar las bacterias tratadas a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Los esferoblastos bacterianas todos deben ir a la pastilla, y la mayoría de las moléculas Fv se liberan en el sobrenadante.
  4. Dializar el sobrenadante frente a 4,0 L de tampón de lavado (Tris 20 mM, pH 8,0, 100 mM de NaCl) en la habitación fría durante al menos 4 horas. Al final del día, cambie a tampón de diálisis fresca y diálisis durante la noche. Debido a la sacarosa en la solución, el volumen del dializado se incrementará en un 50%. El exceso de los tubos de diálisis se debe utilizar.

Purificación IMAC y FPLC - Día 4

  1. Equilibre 10 ml de volumen de lecho de resina de purificación de IMAC (ver Cuadro 1) con el tampón de diálisis en un tubo de 50 ml.
  2. Transferir el líquido de diálisis desde el tubo, añadir MgCl2 a 10 mM y aumentar el volumen a 200 ml. Mezclar con la resina pre-equilibrada y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
  3. Paquete de la columna de vacío con la resina incubada, y lavar la resina con 5 volúmenes de lecho de tampón de lavado, seguido de 5 volúmenes de lecho de tampón de lavado con imidazol 10 mM y 30 mM de imidazol cada uno.
  4. Se eluye la proteína unida con 20 ml de tampón de lavado más 300 mM de imidazol.
  5. Ejecutar el Fv concentrada a través de la columna Superdex 200 equilibrada previamente con tampón de lavado. Piscina las fracciones que contienen Fv (picos típicos se presenta en volumen de retención 17,6 ml) y la concentran en conjunto. Determinar la concentración de la muestra usando el coeficiente de extinción de Fv a 280 nm.

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Discussion

La reconstitución de los canales KvAP en diferentes membranas se ha utilizado en varios estudios 8-10. Siguiendo la idea de asegurar la distribución de los lípidos entre detergentes / lípidos micelas mixtas y las micelas mixtas proteína / detergente / lípidos, que son capaces de llegar a la reconstitución casi completa del KvAP en las membranas hechas de muy diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric necesita ~ 100 moléculas de lípidos para cubrir totalmente su dominio transmembrana. El requisito esencial es permitir suficientes moléculas de lípidos se fundan en las micelas de proteína / lípido / detergente antes de quitar los detergentes. Nuestras condiciones normales (0,5 mg de proteína y 5,0 mg de lípidos) asegurarse de que hay un promedio de ~ 1000 moléculas de lípidos por cada molécula de proteína. Nuestro experimento flotación y experimentos bioquímicos confirmaron que la reconstitución es casi completa. Los registros eléctricos de los canales insertados en las membranas lipídicas negros, la selección de los canales A reconstituidogainst una biblioteca de fagos, y el crecimiento de cristales 2D de los canales en las membranas de todos demuestran las aplicaciones exitosas de la reconstitución de membrana para diversos fines.

Los cambios conformacionales en lípidos dependientes de los canales KvAP y la proyección contra una biblioteca de fagos mostrar una nueva vía para la detección de bloqueadores de los canales o abridores de los canales por métodos bioquímicos en lugar de depender de electrofisiología para mantener los canales en conformaciones específicas 8. El éxito en nuestra pantalla para conformación aglutinantes específicos de sugiere que la misma estrategia se puede aplicar para encontrar aglutinantes específicos para la conformación activada. Es previsible que los canales reconstituidas en vesículas se pueden utilizar contra individuales bibliotecas de Fv de cadena, bibliotecas Fab, etc Del mismo modo, otras proteínas de membrana se pueden ejecutar a través de estas operaciones y asegurar sus aglutinantes ajustados que pueden ser útiles para diversos fines. Creemos que esta nemétodo w verá las aplicaciones más generales en el futuro.

Sistemas de membrana reconstituidas permitirán la elucidación de los detalles químicos detrás de los efectos sobre los lípidos en proteínas de la membrana 11. Interacción lípido-proteína ha sido conocido por ser importante para muchas proteínas de membrana, y ha sido sometido a múltiples estudios en el pasado 3. En los estudios basados ​​en células, las manipulaciones se pueden implementar para cambiar los componentes específicos en las membranas y, a continuación los cambios funcionales en las proteínas de membrana se asocian con los cambios estructurales y de composición de las membranas. Tales conexiones son indirectos y podrían resultar de múltiples factores en las membranas de las células que no están bien caracterizados. En una membrana homogénea reconstituida, es más definitiva en la toma de conexiones entre los cambios estructurales y funcionales de las proteínas de la membrana y los cambios en la composición de lípidos y propiedades de la membrana. En última instancia, para entender tque los principios químicos detrás de la interacción lípido-proteína, que necesitamos para delinear la distribución de los lípidos en todo el dominio de transmembrana, y para entender los cambios dinámicos de estos lípidos justo al lado de las proteínas. Un sistema reconstituido parece ser una manera fiable hacia tal entendimiento.

La reconstitución de proteínas de membrana requiere la eliminación controlada de los detergentes de proteína / lípido / detergente micelas mixtas, y la fusión de las micelas mixtas en las grandes que finalmente se convierten en vesículas 30. Tres métodos diferentes están siendo utilizados para la eliminación de detergentes, diálisis, perlas, y ciclodextrina 14, 31, 32. Pero sigue siendo difícil de lograr una eliminación bien controlada, gradual de detergentes a partir de un pequeño volumen 33, 34. Un método ideal para la eliminación del detergente tomaría los detergentes de la fase acuosa uniformemente a través de todo el volumen en un ritmo controlable, y no debe ejercer una fuerte interferencia on la reconstitución de membranas de bicapa. Tal método podría ser capaz de cambiar la velocidad y la eficacia de la reconstitución, y es probable que permitirá a la reconstitución en un volumen pequeño. Una combinación de lenta dilución y cualquiera de los tres métodos convencionales para la eliminación del detergente puede aproximarse a este objetivo. Lenta de dilución mediante la introducción de una pequeña cantidad de agua en la mezcla de proteínas / detergente / lípido es una manera controlable para disminuir de manera uniforme la concentración de detergente hacia abajo a su CMC. La eliminación del detergente después es menos crítica para la formación de vesículas, aunque sigue siendo importante para la fusión de vesículas pequeñas en grandes. Otras maneras de lograr la eliminación del detergente controlada todavía necesitan ser concebida y desarrollada.

Nuestro procedimiento de reconstitución toma la consideración de la distribución de lípidos entre micelas mixtas y la fusión inducida por detergente de las vesículas, así como las micelas mixtas. Su éxito abre el camino que conduce a un amplio espectro de aplicaciones de la rvesículas econstituted, mucho más que las tres direcciones que presentamos. La adaptación de nuestro procedimiento a otras proteínas de la membrana no debería tener muchos límite técnico. A pesar de que muchas proteínas de membrana se han reconstituido de una forma u otra, ha sido difícil de lograr cerca de la reconstitución completa y para evaluar la funcionalidad de las proteínas a partir de múltiples perspectivas diferentes. Nuestros esfuerzos en la reconstitución KvAP sugieren que nuestros métodos pueden permitir plena reconstitución y serán adecuados para estos fines.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los estudios sobre KvAP en el laboratorio de Jiang han obtenido una ayuda importante desde el laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon, de la Universidad Rockefeller. Un agradecimiento especial al Dr. Kathlynn Brown y Michael McQuire por sus consejos y ayuda en nuestros experimentos de pantalla fago. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (GM088745 GM093271 y de Q-XJ) y la AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

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References

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