Adulte souris veineuse Modèle d'hypertension: l'artère carotide commune à externe Veine jugulaire anastomose.

1Department of Anesthesia and Perioperative Care and Center for Cerebrovascular Research, University of California, San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California, San Francisco, 3Department of Neurology, University of California, San Francisco
Medicine

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Summary

Nous décrivons un procédé pour créer un modèle fiable de l'hypertension veineuse cérébrale chez la souris adulte. Ce modèle a été largement décrits et testés chez le rat. Ce nouvel homologue de la souris ouvre la possibilité d'utiliser des animaux génétiques modifiés et élargit ainsi les applications du modèle.

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Yang, S. T., Rodriguez-Hernandez, A., Walker, E. J., Young, W. L., Su, H., Lawton, M. T. Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.. J. Vis. Exp. (95), e50472, doi:10.3791/50472 (2015).

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Abstract

La compréhension de la physiopathologie de malformations artério-veineuses cérébrales et fistules artério-veineuses se est améliorée grâce à des modèles animaux. Un modèle de rat créant une fistule artificielle entre l'artère carotide commune (CCA) et la veine jugulaire externe (CPA) a été largement décrit et prouvé techniquement possible. Cette construction provoque une hypertension veineuse cérébrale cohérente (CVH), et a donc contribué à l'étude de la contribution de l'hypertension veineuse à la formation, les symptômes cliniques, et le pronostic de MAV cérébrales et FAV durale. Modèles de souris ont été équivalentes ne décrit guère et ont montré des problèmes avec une sténose de la fistule. Un modèle murin établie permettrait l'étude de la physiopathologie non seulement mais aussi des thérapies génétiques potentiels pour ces maladies cérébrovasculaires.

Nous présentons un modèle de fistule artério-veineuse qui produit une hypertension veineuse intracrânienne durable chez la souris. Microsurgical anastomose of murin CCA et EJV peut être difficile en raison de l'anatomie diminutif et entraîner fréquemment dans une fistule non-brevet. Dans ce protocole, étape par étape, nous adressons à tous les défis importants rencontrés au cours de cette procédure. Éviter la rétraction excessive de la veine lors de l'exposition, en utilisant 11-0 au lieu de 10-0 sutures, et de faire une anastomose soigneusement planifiée fin à côte sont quelques-unes des étapes critiques. Bien que cette méthode nécessite des compétences de microchirurgie de pointe et une courbe d'apprentissage plus que l'équivalent chez le rat, il peut être constamment développé.

Ce modèle de roman a été conçu pour intégrer les techniques de souris transgéniques avec un système expérimental déjà bien établie qui se est avéré utile d'étudier les MAV cérébrales et FAV durale. En ouvrant la possibilité d'utiliser des souris transgéniques, un plus large éventail de modèles valides peut être réalisée et les traitements génétiques peut également être testée. Construction expérimentale pourrait également être adapté à l'étude des otses maladies cérébro-vasculaires liés à l'hypertension veineuse comme la migraine, l'amnésie globale transitoire, la cécité monoculaire transitoire, etc.

Introduction

Les modèles animaux d'hypertension veineuse cérébrale se sont révélés être un outil essentiel dans la compréhension de la physiopathologie de malformations artério-veineuses cérébrales et fistules artério-veineuses 1-7. Le plus utilisé est le modèle de rat créée par une fistule artificielle entre l'artère carotide commune (CCA) et la veine jugulaire externe (CPA), qui provoque une hypertension veineuse cérébrale cohérente (CVH) chez le rat 1,8-10. Modèles de souris équivalent, en ouvrant la possibilité d'utiliser différentes souches de souris transgéniques, permettrait une étude plus approfondie non seulement sur la physiopathologie, mais aussi des thérapies génétiques potentiels pour ces maladies cérébrovasculaires. En outre, le produit d'assemblage expérimentale pourrait également être adapté à l'étude d'autres maladies cérébro-vasculaires liées à l'hypertension veineuse telles que la migraine, amnésie globale transitoire, la cécité monoculaire transitoire, etc. 11 Cependant, les tentatives antérieures pour construire ces modèles de souris have démontré les difficultés avec la perméabilité de la fistule en raison de l'anatomie diminutif 5,12. Ici, nous décrivons notre protocole étape par étape pour une anastomose succès de la CCA et EJV murin qui se traduit à long terme de la fistule de brevet et un hypertension veineuse durable chez la souris.

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Protocol

1. Préparation de la souris

  1. Induire une anesthésie générale chez la souris avec le gaz isoflurane. Injecter 0,15 ml de brupenorphine intrapéritonéale pour la gestion de la douleur. Avant de commencer, vérifiez si le niveau d'anesthésie est satisfaisante en piquant les pattes de la souris.
  2. Mettez la souris en décubitus dorsal avec les quatre membres fixées par un ruban adhésif. Enlever les poils du cou et la poitrine avec des ciseaux. Par injection sous-cutanée, administrer 0,2 à 0,4 ml de solution saline à 0,9% pour maintenir la souris hydraté au cours de la procédure chirurgicale.
  3. Préparer le champ opératoire stérile suivant une méthode rigoureuse. La zone de l'incision de la peau doit être nettoyée avec 90% d'alcool.

2. Dissection l'artère carotide commune et la veine jugulaire externe

  1. Faire une incision médiane cervicale horizontale à travers la région du cou inférieure de la souris. Après l'approfondissement de la plaie, élever les glandes salivaires et les tissus mous col de l'utérus en utilisant auraction suture (figure 1). Exposer la veine jugulaire externe droite (CPA) latérale au muscle sterno (SMC). Cette étape doit être effectuée sous le microscope, depuis traction excessive sur la veine pourrait l'endommager et induire sa thrombose.
  2. Disséquer soigneusement le droit EJV long de son cours de la clavicule à la base du crâne. Habituellement pince bipolaire électriques, coagulent et se divisent toutes les branches de préparer une longueur suffisante pour le placement du clip temporaire plus tard et anastomose.
  3. Latéral à la trachée et en dedans de l'Accord SMC, d'explorer l'artère carotide commune (CCA). Il doit être soigneusement exposée de la clavicule juste au-delà de sa bifurcation dans les artères carotides externe et interne. Lors de cette étape, une attention devrait être accordée à nouveau pour éviter une traction excessive à la CPA qui pourraient plus tard compromettre la perméabilité de l'anastomose.

3. Préparation de l'anastomose

  1. Ligaturer le CCA avec 10-0 Nylon juste proximale par rapport à sa bifurcation. Ensuite, appliquez un clip temporaire sur la proximale CCA aussi près de la clavicule que possible.
  2. Une fois que le flux a été interrompue, sectionner l'artère un peu moins de la ligature de bifurcation et irriguer avec une solution saline pour laver du sang restant à l'intérieur de la lumière. Éviter la coagulation bipolaire dans cette étape, depuis la blessure thermique à la paroi de l'artère pourrait mettre l'anastomose avenir en péril.
  3. Afin d'améliorer la visibilité des bords de la CPA, la paroi médiale est marqué avec un marqueur bleu le long du parcours de la veinotomie prévu. Une fois que la CPA est marqué, en utilisant un fil de suture 10-0 pour ligaturer l'extrémité distale comme caudale que possible et appliquer un clip vasculaire temporaire sur l'extrémité proximale du crâne comme possible.
  4. Avec une amende de 30 aiguille G et 0,5 ml seringue, faire une ouverture initiale sur la zone marquée de la CPA et immédiatement irriguer la lumière avec une solution saline pour éviter la formation de thrombus. Ensuite, étendre la veinotomie avec les microciseauxjusqu'à ce que la longueur est d'environ 2 à 3 fois le diamètre de l'ACC. Évitez violente étirement et faire attention à conserver un avantage de tranchant et soigné.
  5. Rapprocher la fin de la CCA à la CPA. Faire une incision latérale en coupe de l'extrémité de donneur de l'ACC pour régler le diamètre de la longueur à la taille de Phlebotomie (figure 2).

4. End-to-anastomose

  1. Utilisez un suture en nylon 11-0 de monofilament pour l'anastomose-CCA à EJV fin à côte. Suturer la paroi médiale de l'anastomose dans une direction d'crânien-caudal est la première étape. Chaque point doit être placé de l'extérieur dans la paroi veineuse première (figure 3) et intérieur à l'extérieur de la paroi artérielle (Figure 4) suivant. Cela permet de garder le nœud sur la surface extérieure des vaisseaux anastomotiques en tout temps (Figure 5). Soit interrompus ou sutures continues peuvent être utilisés, mais tous les sutures continues doivent être serrées que l'étape finale.
  2. Once la paroi médiale a été suturée, répéter la procédure à partir caudale à crânienne avec la paroi latérale. Maintenant, chaque point doit être placé de l'extérieur dans la paroi artérielle et de première intérieur vers l'extérieur la paroi veineuse suivant. irrigation Saline aidera à garder la lumière de l'anastomose visible en tout temps pendant la procédure.
  3. Après la fin de toutes les étapes de l'anastomose, retirer le clip temporaire de la première veine et de l'artère suivant. Le sang artériel se écoule dans la CPA avec peu ou pas de suintement de l'anastomose (voir vidéos modèle VH et le modèle VH 2). Le saignement minime devrait cesser sans utiliser la compression de coton sur l'anastomose. Cela doit être évité afin de prévenir la thrombose de la veine délicate.
  4. Une fois pulsatile circuler à travers l'anastomose est confirmé et aucun saignement apparent est observé, irriguer le champ opératoire avec une solution saline et fermer l'incision cervicale avec une suture 6-0 en nylon. Enfin, administrer 0,15 ml plus intrapbrupenorphine eritoneal pour la gestion de la douleur postopératoire et 0,2 à 0,4 ml de solution saline sous-cutanée de 0,9% pour reconstituer la perte de sang pendant la chirurgie.

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Representative Results

Le succès du modèle est une fistule artério-veineuse de brevet qui induit l'hypertension veineuse dans le cerveau de souris. Pour valider le modèle nous avons d'abord mesuré la pression veineuse intracrânienne dans le sinus sagittal de la souris à 2, 3 et 4 semaines après la chirurgie. 6 souris ont été affectés à différents chaque groupe de temps. La pression des sinus était de 8,8 ± 1,2 mmHg dans le groupe mesurés deux semaines après la chirurgie. Dans les 6 souris mesurées 3 semaines après la chirurgie, la pression de sinus était 4,7 ± 1,4 mmHg. Enfin, les six souris mesurée 4 semaines après une intervention chirurgicale a une pression de sinus de 3,9 ± 0,6 mmHg (figure 6). Postopératoire pression des sinus de 2 semaines était significativement supérieure à la pression des sinus à 3 et 4 semaines (deux p <0,001).

Cependant, la technique complexe requise pour mesurer la pression des sinus ne est pas nécessaire pour assurer la perméabilité fistule hypertension veineuse et sur une base régulière. Au lieu de cela, le résultat souhaité peut être checked par inspection directe de la fistule et par des signes cliniques de l'hypertension veineuse chez la souris.

La perméabilité de la fistule peut être inspecté directement à la fin de la procédure chirurgicale par deux méthodes. La première consiste d'obstruction temporaire du crânienne EJV à la zone de anastomsis avec une pince de bijoutier. Ce point est maintenant le seul écoulement du sang provenant de la CCA. Si l'anastomose termino-latérale est brevet, le CPA dilatable immédiatement ballon comme le montre la vidéo d'essai de perméabilité 1. La seconde méthode est effectuée en bouchant l'extrémité distale de la greffe de la veine de l'anastomose et lentement le vider ou "traite" il avec une paire de pinces de bijoutier. Comme le montre la deuxième vidéo pour le test de perméabilité, une fois l'occlusion est libéré, une anastomose de brevet devrait rapidement remplir le segment vidé.

Si le modèle fonctionne, l'élargissement de l'œil de la souris convient de noter 24 heures après la chirurgie. Ce MAy être due à drainage veineux composé de la tête et du cou. Bien que les deux yeux se élargie après la chirurgie, le phénomène est plus visible sur le côté opéré comme on peut l'observer sur la figure 7.

Figure 1
Figure 1:. Incision de la peau A mi-ligne incision cervicale horizontale à travers la région du cou inférieure de la souris et une traction douce des glandes salivaires expose la veine jugulaire externe droite (CPA). Notez l'emplacement superficielle de la CPA qui justifie une attention incision de la peau pour éviter les blessures à la veine délicate.

Figure 2
Figure 2:. Préparation de l'anastomose La paroi interne de la CPA a été marquée par une ligne bleue le long du parcours de la veinotomie prévu. A côté inci-coupéession dans l'extrémité de donneur de l'ACC est effectuée pour ajuster le diamètre de l'artère à la longueur de la Phlebotomie.

Figure 3
Figure 3:. Extérieur dans la paroi interne de l'anastomose est suturé dans une direction de crânien-caudal avec le point 11-0 abord placé de l'extérieur dans la paroi veineuse.

Figure 4
Figure 4:. Inside-out L'aiguille est entraîné ici de l'intérieur vers la paroi artérielle pour terminer une suture dans la paroi interne de la manière appropriée pour maintenir le noeud sur la surface extérieure de l'anastomose.

Figure 5
Figure 5: Garder le nœud en dehors Remarque ho.w le nœud de la suture interrompue choisie dans ce cas reste en dehors de la lumière des vaisseaux pour éviter la formation de thrombus qui obstruer la fistule.

Figure 6
Figure 6:. Analyse de pression Sinus Bart Ce graphique affiche graphiquement la différence de la pression intracrânienne du sinus mesurée en mmHg à 2, 3 et 4 semaines après la chirurgie.

Figure 7
Figure 7:. Exophtalmie Un jour après la chirurgie, les deux yeux sont élargie, mais l'élargissement de l'œil droit (ipsilatéral à la chirurgie) est plus important.

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Discussion

Hypertension veineuse cérébrale soutenue a été étroitement liée à des manifestations cliniques plus graves et mauvais pronostic chez les patients atteints FAV durale et MAV cérébrales 3. Ces effets de CVH ont été largement étudiés dans des modèles de rats 1,2,8. Un modèle équivalent chez la souris permettrait l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés qui finirait par permettre l'analyse des voies moléculaires impliquées sur la pathogenèse de l'hypertension veineuse et sa relation avec AVF dural et le cerveau AVM.

Nous rapportons ici une méthode pour créer l'hypertension veineuse cérébrale chez la souris adulte par une carotide-jugulaire fistule fin à côte. Ce nouveau modèle améliore les modèles carotide-jugulaire fistule bien décrits chez le rat en la traduisant à la souris et permettant ainsi la possibilité d'enquêter sur précitée voies moléculaires et les thérapies géniques.

Les problèmes fréquemment rencontrés et suggestions

Un autre pro communeblème est nuisible pour l'veine avec une traction excessive, compression, ou d'une dissection long de son cours. Par conséquent, l'exposition de EJV doit être soigneusement effectuée au microscope pour déterminer le plan de dissection approprié. Toutes les petites branches qui se déversent dans Il devrait également être identifiés et coagulés. Cela permettra d'éviter un saignement incontrôlé exigeant la compression de la veine et fournira une redondance suffisante pour éviter une tension excessive.

Il ne est pas rare d'avoir un mauvais fonctionnement de la fistule après avoir retiré les clips temporaires. Dans ce cas, la première étape devrait être l'air pour les points possibles de tension ou angulation dans le CCA. En outre dissection de l'artère ou d'une résection partielle du muscle sterno résoudra ce problème. Toutefois, si un mauvais fonctionnement continue après ces manœuvres, la thrombose du site d'anastomose doit être suspectée. Dans ce cas, au lieu de rouvrir le site d'anastomose et retirer le thrombus, nous vous recommandons d'effectuer une nouvelleanastomose crânien à la précédente. Dans notre expérience, un tiers anastomose est impossible. Il n'y a pas assez de longueur de la CPA et la souris ne tolère pas d'anesthésie pour une telle longue période de temps.

Limites de la technique

Les principales limites de cette technique sont les suivants: (1) l'anatomie diminutif de navires exige des compétences de microchirurgie de pointe et une courbe d'apprentissage plus long que pour le modèle équivalent chez le rat; (2) la perméabilité de l'anastomose est souvent compromise par la formation de thrombus et de la longueur de la CPA de la souris permettra seulement une tentative supplémentaire pour résoudre ce problème; et (3) la chirurgie peut prendre jusqu'à trois heures, l'exposition de la souris pour une longue période anesthésie. Toutefois, suivant les suggestions techniques proposées ci-dessus et en gardant la souris chaude et hydratée pendant la procédure, un brevet CCA à EJV peut être effectuée avec succès et un taux de survie élevé des animaux atteints dans notre expérience.

Un modèle cérébrale veineuse hypertension fiable et durable chez la souris est un outil important qui peut servir un large nombre de fins de recherche cérébrovasculaire 13-16. En ajoutant la technologie de finale de souris transgéniques, ce nouveau modèle devrait faciliter la recherche sur les gènes in vivo pour toutes les pathologies associées à l'hypertension veineuse cérébrale.

Auparavant, d'autres auteurs ont décrit le modèle de l'hypertension veineuse chez le rat et l'ont utilisé pour étudier la physiopathologie de dural AVF et le cerveau AVM 4,5,8,9. Nous décrivons maintenant la méthode avec succès à traduire ce même modèle pour les souris, ouvrant ainsi ses applications potentielles à toutes sortes de tests de traitement génétique.

Conclusion

Nous démontrons ici un protocole pour obtenir un brevet CCA à EJV anastomose chez la souris adulte. Cette fistule offreun cerveau hypertension veineuse durable qui a été un outil utile pour développer différents modèles de maladies cérébrovasculaires chez le rat. En fournissant cette première étape pour développer ces mêmes modèles chez les souris, nous ouvrons la possibilité de tester des traitements génétiques pour les maladies cérébrovasculaires.

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Disclosures

Les procédures expérimentales des animaux de laboratoire ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Californie, San Francisco (UCSF).

Les auteurs ne ont aucun conflit d'intérêts potentiels liés aux médicaments et les matériaux utilisés dans cette procédure.

Acknowledgements

Ce projet est partiellement financé par le NIH T32 GM008440 à Espen Walker, R01 NS27713 à William L.Young, P01 NS44155 à William L.Young et Hua Su, R21 NS070153 Hua SU et par l'American Heart Association AHA 10GRNT3130004 Hua Su. Dr Ana Rodríguez Hernández-est soutenu par une subvention de "Obra Social La Caixa"

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 Sterile Microsuture Arosurgical Ic. VT5A010Q10
11-0 Sterile Microsuture Arosurgical Ic VT4A00N07
DUROTIP Scissors Aesculap BC210R
Micro-Adson Tissue Forceps Aesculap BD510R
Microscissors Aesculap OC496R
Micro Forceps #5 Jewelers Aesculap BD331R
Angled Jewelers Forceps Aesculap BD329R
Micro Suture Forceps Aesculap BD338R
DUROGRIP Needle Holder Aesculap BM009R

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References

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