En effektiv Manuel Afbening metode til at forberede Intakt Mouse næsevæv med bevaret Anatomisk Organization

1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
* These authors contributed equally
Published 8/10/2013
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization. J. Vis. Exp. (78), e50538, doi:10.3791/50538 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pattedyr næse er en multi-funktionel orgel med indviklede interne strukturer. Næsehulen er foret med forskellige epitheler såsom olfaktoriske, luftveje og pladeepitel, der afviger markant i anatomiske steder, morfologi, og funktioner. Hos voksne mus, er næsen dækket med forskellige kranieknogler, begrænser eksperimentel adgang til interne strukturer, især i den bageste som den i hovedsagen lugtepithelet (MOE). Her beskriver vi en effektiv metode til opnåelse af næsten hele og intakt nasale væv med konserverede anatomisk organisation. Brug kirurgiske redskaber under et dissektionsmikroskop, vi sekventielt fjerne kraniet knogler omkring den nasale væv. Denne procedure kan udføres på begge paraformaldehydet-faste og frisk dissekeret, flået mus hoveder. Hele udbening tager ca 20-30 min, hvilket er betydeligt kortere end den eksperimentelle tid, der kræves til konventionel kemisk-baserede deforkalkning. Derudover præsenterer vi en nem metode til at fjerne luftbobler fanget mellem turbinates, som er afgørende for at opnå intakte tynde vandrette eller koronale eller sagittale sektioner fra den nasale væv forberedelse. Nasal væv fremstillet ved hjælp af vores metode kan anvendes til hel mount observation af hele epithel, samt morfologiske, immuncytokemiske, RNA in situ hybridisering og fysiologiske studier, især i studier, hvor region-specifik undersøgelse og sammenligning er af interesse.

Introduction

Pattedyrs næsehulen indeholder forskellige typer af væv og organer, der tjener forskellige funktioner. Næsehulen udgør indløbsdelen af ​​de øvre luftveje, der tillader luft rejser ind og ud af lungerne. Inhaleret luft passerer gennem næsehulen, hvor det gennemgår temperatur og fugtighed condition 1 samt rengøring eller filtrering at fjerne irriterende og giftige stoffer og smitsomme mikroorganismer 2. Begge behandlinger udføres af næse-epitel og subepithelial væv, herunder kirtler og fartøjer og er afgørende for at beskytte de nedre luftveje og lungerne. Ud over sin rolle i respiration og epithelial forsvar, også den nasale væv indeholder perifere sensoriske apparater af olfaktoriske og trigeminal systemer, som detekterer en bred vifte af kemiske stoffer i den passerende luft. Afhængig af hvilket system er aktiveret, kan sensoriske påvisning af kemikalier i næsen fremkalde entenen lugtesans, irritation eller smerter 3,4.

Den perifere olfaktoriske system er komplekst og består af flere anatomisk adskilte olfaktoriske sanseorganer i næsehulen. Blandt dem er den vigtigste lugtepithelet (MOE) den største, som udgør ca 45-52% af næse-epitel hos gnavere 5 og er placeret i den bageste region. I anteroventral region, er der et par af rørformede strukturer kendt som vomeronasale organ 6, som sidder langs hver side af næseskillevæggen. To yderligere små grupperinger af olfaktoriske sensoriske neuroner, kendt som septal organ Masera 7,8 og Gruneberg ganglion 9 opholde sig sammen ventrale septum og den dorsale indgangsområdet af næsehulen, hhv. Disse perifere organer indeholder neuro-epiteler med karakteristiske træk i morfologi, cellemarkør udtryk, og fysiologiske funktioner. Sammen vil de opdage tusindvis af lugtmolekyler med udsøgt følsomhed 10-12.

Ud over de olfaktoriske sanseorganer, også næsehulen huser andre sensoriske systemer. Det er kendt, at peptiderge trigeminale nerve fibre er til stede i den nasale epitel, især det respiratoriske epitel 13,14. Nogle af disse fibre registrerer irriterende og giftige kemikalier og er ansvarlige for at indlede beskyttende reflekser såsom hoste og nysen 4,15. Irriterende lugtende og bitre forbindelser kan også påvises ved en nyligt opdaget population af ensomme chemosensory celler (SCC'er), hvoraf mange er innerveres af trigeminus nervefibre 16-19. Disse SCC'er er placeret i højere tæthed i posten region næsehulen og vomeronasale indrejse kanaler, antyder, at de også kan tjene en beskyttende funktion 16-18. Således kan næse-epitel væsentlige forskelle i funktion, morfologi og cellesammensætning afhængig af deresanatomiske steder.

Selv inden for en enkelt og specialiseret epitel, er der regionale forskelle. MOE er et sådant eksempel. De MOE linjer forskellige turbinates, som er komplicerede og krøllede strukturer. På grund af dem, regioner forskellige fra de MOE opleve forskellige luftmængder, og dermed forskellige diffusion og clearance af luftbårne lugtmolekylerne 20. Desuden er det kendt, at olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN) udtrykker en given lugt receptor er placeret i en af fire omgås zoner MOE 21,22. Hvordan dette sted forskel påvirker en OSN reaktion på lugtstoffer stort set ikke kendt. Desuden udviser nogle OSN populationer regional præference. Guanylylcyclase-D (GC-D)-udtrykkende OSN har zoneinddeles fordelinger begunstige cul-de-sac regioner af ectoturbinates 23,24. For nylig fandt vi en delpopulation af kanoniske OSN der udtrykker transient receptor potentiale kanal M5 (trPM5) og fortrinsvis placeret i de laterale og ventrale regioner 25. Disse resultater indikerer, at MOE er ikke ensartet. Men hvordan disse regionale forskelle påvirker olfaktoriske kodning ikke forstået. Dette er til dels fordi grundig fysiologisk undersøgelse af MOE og næse er blevet begrænset af vanskeligheden ved at opnå intakt næse-epitel med bevaret anatomisk organisation ved hjælp af gængse metoder.

Af næse-epitel overvejende omgivet af de forreste knoglerne i kraniet, herunder nasal, overkæben, Palatine, zygomatic og ethmoid knogler. Hos voksne mus og andre gnavere modeller, er disse ben hård og vanskelig at fjerne uden at beskadige tæt forbundet nasal væv, især de fine turbinates. Ofte er kemisk-baserede afkalkning bruges til at blødgøre knoglerne til at tillade cryosectioning nasale væv til morfologiske, immunhistokemiske og in situ hybridisering undersøgelser, men afhænding af alderen på dyret, kan afkalkning processen sidste overnatning op til 7 dage 24,26-28. Denne behandling er også begrænset, fordi det kræver væv være fiksativ bevarede. Derudover kan kemisk afkalkning være barske og påvirke immunolabeling visse følsomme antistoffer 29,30. Til fysiologiske studier, er levende væv kræves, og dermed er disse eksperimenter ofte udført på isolerede OSN eller MOE skiver opnået fra nyfødte, hvis kranium knogler er tynd og blød 17,31,32. Fysiologiske undersøgelser kan også udnytte hele mount forberedelser spaltning af hovedet 25,33,34, men som regel kun den mediale flade af næsen er let tilgængelig, hvilket begrænser fysiologiske optagelser på andre områder.

Her beskriver vi en effektiv, manuel udbening fremgangsmåde til fremstilling af intakte nasale væv med bevaret oprindelige anatomiske organisation og morfologi. Vi sekventielt fjerne de store knogler i forrestekranium under en dissektion mikroskop for at eksponere en næsten fuldstændig intakt næseepitelet samtidig holde de tynde turbinatceller knogler intakt medmindre musene er meget gammel og cryosectioning er nødvendig. Vi har også udvide den metode til at bevare forbindelsen mellem de nasale væv og olfaktoriske pærer, samt resten af ​​hjernen, således lette samtidig behandling af både perifere og centrale kredsløb. Vores metode kan anvendes til at fremstille paraformaldehyd-fikseret, samt frisk, levende nasal væv. Således er vores metode forventes at lette morfologiske, immunhistokemiske og fysiologiske studier af respiration, lugtesansen, og nasal skade og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Mus Næse Forberedelse

Vi brugte voksne C57BL / 6 baggrund mus i denne undersøgelse. Alle dyrepleje og-procedurer er godkendt af Animal Care og brug udvalg (IACUC) i University of Maryland, Baltimore County.

1.1 Erhvervelse næsen fra paraformaldahyde-fikserede mus

Figur 1
Figur 1. Knogler en mus kranium A:. Dorsal visning af kraniet B:. Ventral visning af kraniet er fjernet underkæben. Kraniet blev fremstillet ud fra en 40-dage gammel mus. Individuelle knogler er farvet for en bedre visualisering. Klik her for at se større figur .

  1. Perfundere transcardialt at fastsætte individuelle mus efter the protokol Lin, et al., (2008) 16. Kort fortalt blev musene dybt bedøvet med tribromethanol (Avertin 250 ug / g kropsvægt), perfunderet transcardialt med 0,1 M fosfatbuffer (, 30-50 ml), efterfulgt af en phosphatpufret fiksativ indeholdende 3% paraformaldehyd, 19 mM L-lysin monohydrochlorid, og 0,23% natrium m-periodat (ca. 35-50 ml). Man kan også følge trinene i JOVE artikel for dyr perfusion 35..
  2. Brug en saks til at afskære underkæbe (eller underkæben) og fjern huden på hovedet.
  3. Adskil hele hovedet fra resten af ​​kroppen.
  4. Fjern ganen. Også rense og fjerne det resterende bindevæv og muskler på overfladen af kraniet for at opnå vist i figur 1A og 1B.
  5. Under en dissektion mikroskop fjerne kraniet dækker hjernen og olfaktoriske pærer. Trim overskydende væv og knogler. Ingente, til den udvidede vævspræparatet hvor hjernen og næse forblive forbundet, er det kun kraniet knogler fjernet. For immunohistokemiske forsøg, var vævet efterfikseret i 1,5 time og overført til 0,1 M phosphatpufret saltvand (PBS) med 25% saccharose natten over. Næsevæv bør holdes befugtet hele dissektion ved at dyppe den i den bufrede sucroseopløsning flere gange.

1.2 Erhvervelse næsen fra frisk aflivet mus

  1. Individuelle mus blev overført til et rent bur og udsat for CO 2 gas, som blev efterfulgt af cervikal dislokation 5 minutter efter den sidste åndedrag. For at reducere blod i næsen væv, bruge en saks til at åbne brystet og skæres hjertet til at tillade blod at dræne.
  2. Gentag trin 1.1.2 til 1.1.5, undtagen post-fiksering og cryoprotection med 25% saccharose. Prøven skal holdes fugtig og vedligeholdes med Tyrodes saltopløsning indeholdende (i mM): 140 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 Na pyruvat, 10 D-glucose, og 10 N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyrepuffer (HEPES, justeret ved pH 7,4). Alternativt kan folde et stykke af Kimwipes, sættetid det med Tyrodes opløsning og plads under prøven, mens dissekere og lejlighedsvis dyppe prøven i Tyrodes løsning eller tabe nogle løsning på vævet for at holde det fugtigt at opretholde levedygtigheden af ​​celler og væv .

2.. Fortand, Anterior vomer og Maxilla Bone Removal

  1. Start fra en ventral synspunkt. Find vomer knogle og bryde vomer knogle langs sin længde ved hjælp af en rongeur eller pincet med tænder at bryde den ventrale meste af knoglen.
  2. Brug savtakkede pincet fjerne de knækkede dele af vomer knoglen ved forsigtigt sejler knoglerester væk fra vomeronasal Organ (VON). Bemærk, for mus mindre end en måned gammel, eller hvis der kun er interesseret i MOE, disse to steps kan springes over.
  3. Hold hoved fast med en pincet. Brug rongeur at bryde den forreste del af både fortænder og ende regionen af ​​forreste maxilla mellem de to fortænder og vomer knogle.
  4. Bryde den ventrale del af den højre overkæben på området lige foran den kindbensbuer op til niveauet for den dorsale zygomatic plade.
  5. Vend næse for en dorsal synspunkt. Brug rongeur at bryde den rigtige overkæben forreste af den dorsale zygomatic plade. Hele højre maxilla forreste af zygomatic plade skal være løs. Brug de fine pincet til forsigtigt at adskille en eventuel nasal væv ligger til grund for overkæben, og derefter forsigtigt løfte væk knoglen fragment.
  6. Gentag trin 2.4 og 2.5 for at løsne venstre fortand og venstre forreste maxilla og fjerne dem efter den nasale knogle er blevet fjernet.

3.. Nasal Bone og Dorsal Zygomatic Plate Removal

  1. Brug savtakkede pincet eller rongeur at reflytte den resterende del af de frontale knogler lige kaudale til den nasale knogler. Efter fjernelse dette stykke knogle, kan den bageste del af nasale knogle gribes med en pincet.
  2. Brug rongeur at bryde den forreste del af kindbensbuer, som er forbundet til zygomatic plade.
  3. Tag de fine pincet i det laterale kant af den dorsale ende af zygomatic pladen og forsigtigt flip knoglen og fjerne det. Hvis knoglen ikke er løst, skal du bruge rongeur at klemme den forsigtigt for at løsne den til fjernelse.
  4. Brug fine tænger eller et barberblad at løsne den mediale sutur mellem højre og venstre nasal knogler.
  5. Brug savtakket pincet til at gribe den kaudale ende af den højre nasale knogle. Bevæg knogle fra side til side for at adskille den fra underliggende væv. Det er nyttigt at flytte tang langs den kaudale tredjedel af den nasale knogle til at bevæge knogle side til side. Som den nasale knogle skiller, langsomt løfte knoglen fra den kaudale ende.
  6. Mens tHan næseben er let løftet, vippe knoglen sideværts at afsløre en lateral outcropping i knoglerne, der er foret med tynd respiratorisk epitelial væv. Brug fine tænger til forsigtigt frigive denne væv fra den nasale knogle. Fortsæt med at løfte den nasale knogle. Når knoglen er helt adskilt fra det underliggende væv, bruge saks til at afskære den nasale knogle ved rostralt ende.
  7. Gentag trin 3.1, 3.5 og 3.6 til fjernelse af venstre nasal knogler.
  8. Gentag trin 3.2 og 3.3 for den venstre side af næsen.

4.. Lateral Zygomatic Plate Removal

  1. Fjern zygomatic pladen én side ad gangen. Enten zygomatic plade kan fjernes først.
  2. Fra en ventral synspunkt, bryde maxilla ringere end den kindbensbuer indtil brud når kindbensbuer.
  3. Fra en dorsal synspunkt, grab forsigtigt kindbensbuer og løft fremad og lateral. Hvis zygomatic pladen stadig er fastgjort til enhver væv, tage den finetænger og forsigtigt afskære forbindelserne mellem vævet og knoglerne.
  4. Gentag for zygomatic plade på den anden side af næsen.

5.. Orbit Bone Removal

  1. Fra en ventral synspunkt bryde Palantine knogle mellem kindtænder i næsen.
  2. Brug rongeur at bryde de 3 kindtænder og maxilla på hver side af næsen.
  3. Break og fjerne eventuelle resterende tykke stykker af knogle ventrale og posteriore til turbinates på hver side af næsen.

6.. Ethmoid Bone Removal

  1. Break nogen del af ethmoid knogle stikker caudale til turbinates. Dette er nødvendigt for at undgå tab af turbinate serviet, når du fjerner tynde stykker af ethmoid knogle dækker turbinates.
  2. For den rette side af næsen, placere fine tænger på den forreste kant af ethmoid knogle og forsigtigt fjerne det. Hvis en del af knoglen tilbage, gentages denne procedure, indtil alleden tynde ben dækker turbinates er blevet fjernet. De turbinatceller knogler behøver ikke at blive fjernet i de fleste af forberedelserne. I alderen mus, bliver cribriform plade skørt. Hvis cryosectioning af den nasale væv er nødvendig, fjerne små stykker af pladen med fine tænger til at reducere den potentielle skade forårsaget af knogle.
  3. Gentag trin 6.2) til venstre side af næsen.
  4. Fjern eventuelle resterende knoglerester før skæring. Note: i dyrene mere end et år gammel, posterodorsal region af skillevæggen knoglen er lidt tykke og hårde. Man kan fjerne denne del ved hjælp af fine tænger. Sæt spidsen af ​​tangen i begge sider af knoglen for at adskille den dorsale del af skillevæggen knogle og foring epitelvæv. Brug en tang til at gribe knoglen og holde prøven. Brug en anden tang til at bryde den øverste knoklede del fra den nedre bruskspidserne del af skillevæggen og forsigtigt fjerne det.

  1. Opsæt aspiratorvakuum pumpen.
  2. Placer næsen i et indlejring støbeform. Sænk næsen i OCT medier.
  3. Brug en vakuum for at fjerne luftbobler fanget i næsen væv. Denne proces tager op til 5 min.
  4. Efter fjernelse luftbobler, indstille vævet i den ønskede orientering.
  5. Frys OLT og vævet i formen ved hjælp tøris. Den indlejrede væv kan derefter cryosectioned straks eller opbevares ved -80 ° C til senere brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med denne metode, kan vi pålideligt opnå næsten helt intakt nasal væv. 2A viser et billede af voksen nasal prøve fra en paraformaldehyd-fikseret hoved. I denne prøve, er alle fire sub-olfaktoriske sensoriske organer, herunder Moe, septal orgel, den Gruneberg ganglion og VNO, intakt. Desuden er det respiratoriske epithel og subepithelial væv, såsom kirtler og fartøjer, bevares. Vi har med succes anvendt denne metode i en række undersøgelser, hvor vi undersøgte morfologi, distribution, nerve innervation og cellemarkør udtryk i forskellige specialiserede sensoriske cellepopulationer 16,17,36-38.

Figur 2B viser en model med hjernen, lugtesansen pærer, og næse sammen. Denne udvidede præparat er især nyttig i undersøgelser, der kræver nerve forbindelse mellem de perifere og centrale olfaktoriske system. Vi har forberedt dette eksemplar ved at fjerne kraniet knogler surrounding hjernen forud for fjernelsen af ​​ansigtets knogler. Vores udvidede metode giver efterforskerne at udføre eksperimenter på både perifere og centrale olfaktoriske system i et enkelt præparat.

Den nasale væv vist i figur 2 kan anvendes til hel-mount observation, samt til fremstilling af vævssnit. 3A viser et vandret snit snit gennem både MOE og respiratoriske regioner. Figur 3B viser en koronal sektion skære gennem midten af MOE. Vi farves afsnittene med neutral rød for et bedre overblik over de forskellige typer af epitel og submucosal strukturer på forskellige anatomiske steder. Disse resultater viser, at vores teknik bevarer selv sarte MOE turbinal struktur og anatomiske organisering af næsen, som muliggør omfattende og sammenlignende undersøgelse af nasale morfologiske og funktionelle ændringer under normale og patologiske tilstande.

Figur 2
Figur 2. Isoleret næse-og hjernevæv A:.. Dorsal visning af intakt næse væv dissekeret ved hjælp af vores udbening metode B:. Dorsal visning af en næse og hjerne med neurale forbindelser mellem de centrale og perifere olfaktoriske systemer intakte Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Sektioner af nasale væv A:.. En vandret snit visende olfaktoriske og respiratorisk epitel samt andre nasale strukturer B: Koronale snit gennem turbinates of MOE i den bageste del af næsen. Begge sektioner var 14 um tyk og farvet med neutral rød MOE:. Main lugtepithelet RE:.. Respiratory epitel Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi vist en trin-for-trin procedure til at isolere intakt olfaktoriske og respiratorisk væv fra mus næse ved sekventielt at fjerne de omgivende knogler mens skåne vævet nedenfor. Vi viser, at omhyggelig fjernelse af knogle kan bevare selv de mest sarte væv i deres helhed. Vi deler også indsigt i mulige ændringer af denne teknik, hvor vi isolerer både hjerne og næse væv sammen for at bevare nerven forbindelsen. Denne nye metode tilvejebringer et middel til at isolere hele olfaktoriske og respiratorisk væv i en enkelt prøve til yderligere behandling i immunhistokemisk, RNA in situ hybridisering og fysiologiske eksperimenter.

Fordele ved fjernelse af knogle

Før vores metode var afkalkning agenter typisk bruges til at blødgøre ben til vævssektionering og immunhistokemi. Men afhængigt af størrelsen af ​​knoglen og dyrenes alder, afkalkningkan være en langvarig proces, der kræver væv inkubation i knogler afkalkningsmidler for timer eller endda flere dage 29,30. Agenterne almindeligt anvendte også indeholde syrer, som kan have indvirkning på det væv, der kan ændre eller hindre immunolabeling 29,30. For at bekæmpe dette, nogle forskere anvender ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning til at udskille calciumioner fra knoglen 24,26-28. Denne metode til afkalkning kræver også dage. Dissektion vist her kan udføres i omkring 20-30 minutter og kræver ikke anvendelsen af ​​eventuelle kemiske opløsninger, der kan ændre stainability af væv.

Vores metode kan også anvendes til at opnå intakt nasal væv fra frisk dissekerede næser, giver en fordel for at opnå levende væv til fysiologiske optagelser. For eksempel er næse skiver almindeligt anvendt til Ca2 + billeddannelse af OSN og støtte celler i lugtepithelet 31,32. Disse skiver skal værefremstillet ud fra neonatale mus før knoglerne omkring den hærdede væv. Men neonatal prøver er ikke identiske med voksne, fordi lugtepithelet fortsætter udvikling og modning fødslen. Ved hjælp af vores metode, kan forskerne få intakt olfaktoriske væv fra mus ældre end neonatale aldre. Dette giver en betydelig fordel, især i undersøgelser af aldersbetingede forandringer.

Ændringer og fejlfinding

Vi viste en effektiv sekvens at fjerne omgivende knogler. Men der er andre sekvenser af knogle fjernelse at opnå intakte nasale væv og trinvis procedure kan modificeres efter de individuelle behov hos forskeren og væv mest interesse. For eksempel, hvis den vomeronasale orgel er behov skal vomer knogle fjernes tidligt i proceduren, fordi der er flere knogle-dækkede områder til at forstå at holde vævet på det ønskede sted under fjernelse. Ved tilpasTing proceduren for hver enkelt ansøgning, væv af interesse er mere tilbøjelige til at forblive intakt til videre forarbejdning. De nasale knogler også tendens til at være vanskeligt at fjerne, da vævet nedenfor klæber til knoglerne og vil ofte rive som knoglerne løftes væk. Ud over at vrikke den nasale knogler, som vist i videoen, kan små pincet forsigtigt indsat mellem den nasale knogle og det underliggende væv for at hjælpe med at flytte vævet ned og væk fra knoglerne under fjernelsen.

Dissektion varierer også lidt afhængigt af alder af musene. Hos unge mus, en tendens knoglerne til at være blødere, mens knoglerne af ældre mus er mere skrøbelige og stærkt fusioneret til de omkringliggende knogler i nogle regioner. Bløde knogler er lettere at adskille og fjerne i små stykker end hårdere knogle. Denne forskel kan let overvindes ved at bruge pincet til at score eller skrabe på forbindelser mellem knoglerne til at støtte i deres adskillelse og ren fjernelse. I ældre dyr, de posterodorsal region af septum er noget tyk og hård og bør fjernes før cryosectioning. Knoglens del af skillevæggen kan fjernes som beskrevet i procedure 6.4. Selv om der er små forskelle i dissektion for ældre og yngre mus, alder er ikke en begrænsende faktor. I vores undersøgelser har vi med succes forberedt intakte nasale væv fra mus varierede fra 14 dage til to år.

Der er ikke nogen signifikant forskel mellem de dissekere trin, der anvendes til fiksativ-fixed næse og til frisk næse selvom friskt væv er blødere og kræver mere omhyggelig manipulation. I begge præparater er at holde vævet befugtet under dissektion vigtig. Det er ikke nødvendigt at udføre den friske væv dissektion i bufret saltvand, dog regelmæssigt dyppe vævet i Tyrodes opløsning eller dryp opløsningen på vævet, mens dissekere er kritisk, da det vil holde vævet befugtet og næringsstoffer tilføres for at opretholde sin viability.

Den procedure, der præsenteres her kan yderligere modificeres til at indbefatte fjernelse af knogle, der forlader både hjernen og næse intakt i et enkelt eksemplar (figur 2B). Denne modifikation skåner nerve forbindelser mellem hjernen og næse, der passerer gennem cribriform pladen. Flere tekniske færdigheder og tid er nødvendige for denne dissektion end næsen alene. Men bevare de forbindelser fra periferien til hjernen giver mulighed for mere forskelligartede anvendelser af denne metode.

Begrænsninger

Vi har anvendt denne metode til at forberede nasal væv til en række undersøgelser, herunder immunhistokemiske mærkning og mRNA in situ hybridisering analyse, og har med succes mærkede mange proteiner i signalveje, farves cellemarkører i forskellige cellepopulationer, og undersøgte morfologiske træk og celle fordeling gennem næsehulen 16,17,36-39. Vi gjorde ikke experience begrænsninger cryosectioning og immunolabeling. For undersøgelser, der kræver cryosectioning af den forlængede præparat, der holder hjernen og nasal væv forbundet i et enkelt eksemplar, anbefaler vi, at bruge mus yngre end 4 måneder siden i ældre mus den sprøde cribriform pladen kan skabe vævsskader under skæring. Men for friskt væv bestemt til elektrofysiologiske optagelser, er de mediale væv mellem turbinates ikke let tilgængelige i hele mount præparat. Fjernelse af små stykker af væv eller opdeling i diskrete områder kan løse problemet. Fordi konventionelle elektro-olfactogram sker på mediale overflade af endo-turbinates 25,33,34 kan vores vævspræparat tillade optagelser fra andre regioner med lidt manipulation.

Ansøgninger uden Immunohistokemi

Mange anvendelser af fremgangsmåden findes for dem, der har mestret teknik. Mulig applicationer omfatter zoneinddeles undersøgelser af olfaktoriske og respiratoriske væv, som, ved hjælp af andre metoder, har været vanskeligt at opnå intakte og på deres oprindelige anatomiske konfiguration. Ansøgninger findes også for elektrofysiologi ved at tillade samtidige multiple-optagelser på hele, friske væv. Nogle af disse applikationer, som var vanskelige at udføre ved hjælp af eksisterende teknikker, er gjort mulig ved vores udbening metode. Endvidere kan denne protokol også tilpasses biokemiske, genomisk og proteom undersøgelser, der kræver konsekvent prøvetagning på forskellige områder til kritisk sammenligning.

Sammenfattende har vi udviklet en fremgangsmåde til hurtigt og pålideligt adgang olfaktoriske og respiratorisk væv i mus næse ved at fjerne de omkringliggende knogler. Denne fremgangsmåde har betydelige fordele i forhold til almindeligt anvendte teknikker, såsom afkalkning. Yderligere, vores metode kræver ingen kemisk behandling, og derfor er væv ikke begrænset til brug i immunohistochemistry eksperimenter, men kan også være gældende for in situ hybridisering og fysiologiske studier. Således er vores metode er en hurtigere, mere direkte måde at forberede musen næse til videre forarbejdning. Vi forventer, at vores metode vil lette olfaktoriske og respiratoriske studier i nasale regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 og ARRA administrative supplement NIH tilskud) til Weihong Lin. Vi har især takke Mr. Tim Ford på UMBC for hans teknisk bistand videooptagelser og forarbejdning. Vi ønsker også at takke Dr. Daphne Blumberg, Ms Chere Petty på UMBC og Mr. Nicholas McCollum fra Olympus America Inc. for deres udstyr assistance i videooptagelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width World Precision Instruments (WPI) 501333
Fine forceps, Dumont 3 WPI 503235
Fine forceps, Dumont 55 WPI 14099
Fine forceps, Dumont AA Fine Science Tools (FST) 11210-20
Specimen forceps, Serrated VWR 82027-440
Operating scissors WPI 501753
Iris scissors, Straight Miltex V95-304
Dissection microscope Olympus SZ40
Name Company Catalog Number Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Plastic embedding mold VWR 15160-215
Aspirator vacuum pump Fisher Scientific 09-960-2
Name Company Catalog Number Comments
Section staining
Neutral red ACROS Organic CAS 553-24-2 Nuclei staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
  2. Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
  3. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  4. Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. 2nd, Wiley-Liss. (2000).
  5. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
  6. Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
  7. Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
  8. Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
  9. Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
  10. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
  11. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
  12. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  13. Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
  14. Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
  15. Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
  16. Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
  17. Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
  18. Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
  19. Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
  20. Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
  21. Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
  22. Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
  23. Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
  24. Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
  25. Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
  26. Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
  27. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
  28. Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
  29. Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
  30. Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
  31. Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
  32. Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
  33. Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
  34. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  36. Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
  37. Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
  38. Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
  39. Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).

Comments

1 Comment

  1. dear David dunston,
    I would appreciate to be able to visualize your dissection method.Thanking you by advance, best regards, Patricia Duchamp-Viret

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    February 4, 2014 - 5:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats