Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יש לי המיטוכונדריה תפקידים בתהליכים תאיים רבים, מחילוף חומרים של אנרגיה והומאוסטזיס סידן לשלוט של הסלולר תוחלת חיים ומות תאים מתוכנת. תהליכים אלה משפיעים ומושפעים מהמצב של חיזור וייצור ATP במיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים ratiometric, מקודדים גנטי שיכול לזהות מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאים חי שמרים. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי נמדדת באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק חיזור רגיש (roGFP) כי הוא ממוקד למטריקס המיטוכונדריה. מיטו-roGFP מכיל cysteines בעמדות 147 ו -204 של ה-GFP, אשר עוברות חמצון הפיך ותלוי בסביבה וצמצום, אשר בתורו משנה את ספקטרום העירור של החלבון. MitGO-ATeam היא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שבמקטע של ε o F F-ATP synthase 1 הוא דחוקה בין סריג תורם acceptor fluoחלבוני rescent. כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם acceptor בסמיכות ומאפשרת העברת אנרגיה תהודה הקרינה מהתורם לacceptor.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים לייצור ה-ATP, סינתזה של חומצות אמינו, חומצות שומן, heme, ברזל וגופרית אשכולות pyrimidines. מיטוכונדריה גם לשחק תפקידים מרכזיים בומאוסטזיס סידן, וברגולציה של אפופטוזיס. 1 קישורי ראיות הגדלת מיטוכונדריה למחלות הזדקנות וקשורות לגיל, כולל מחלת פרקינסון, אלצהיימר, טרשת לרוחב amyotrophic, ומחלת הנטינגטון. 2 בעוד אנשים חיים את כל חייהם עם מוטציות בחלבוני המיטוכונדריה הקשורים למחלות ניווניות, את תסמיני המחלה מתרחשות רק מאוחר יותר בחיים. זה מצביע על כך ששינויים מתרחשים במיטוכונדריה עם גיל שיאפשר מחלת הפתולוגיה לצוץ. ואכן, כושר המיטוכונדריה הוא מתואם עם בריאות כללית תא ותוחלת חיים בשמרים ותאי יונקים. 3,4 כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בחיישנים ביולוגיים גנטי מקודדים, רציומטרי ניאון כדי להעריך שני מאפיינים קריטיים של mitochondria בתאים חי שמרים: מדינת חיזור ורמות ה-ATP.

תפקוד המיטוכונדריה בגיוס אנרגיה אירובי הוא מבוסס היטב. מדינת חמזור מיטוכונדריאלי היא תוצר של הפחתת חמצון ומינים באברון, כולל NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, דיסולפיד גלוטתיון / גלוטתיון (GSH / GSSG) ומיני חמצן תגובתי (ROS). שחרר את סוגר המיטוכונדריה או היפוקסיה משפיע על פעילות נשימה המיטוכונדריה ומשנה את היחס בין NAD + ל NADH באברון. ROS, אשר מיוצרים מהעברת אלקטרון בין קומפלקסים לא יעילה של שרשרת העברת האלקטרונים בקרום המיטוכונדריה הפנימית, כמו גם מdeamination של אמינים באמצעות מונואמין אוקסידאז בקרום החיצוני של המיטוכונדריה 5, שומנים, חלבונים, נזק וחומצות גרעין ויש לי נקשר להזדקנות ומחלות ניווניות גיל הקשורים 6,7,8. ROS גם לשחק תפקיד בהעברת אותות במ 'itochondria, באמצעות חמצון של GSH. לדוגמה, NADH דהידרוגנז לא רק תורם לייצור ROS אלא גם מוסדר באמצעות אינטראקציות עם בריכת גלוטתיון 9,10. דהידרוגנז וaconitase α-ketoglutarate, רכיבים של מחזור TCA, מפגינים פעילות מופחתת בחמצון סביבות 11,12.

ואכן, תקנת חיזור תלויה של פעילות aconitase נשמרת מחיידקים ליונקים 13,14. לפיכך, ניטור מצב חיזור ורמות ה-ATP של המיטוכונדריה הוא חיוני להבנת תפקודם והתפקיד במחלת פתולוגיה.

שיטות ביוכימיות שמשו כדי להעריך את מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים שלמים או מבודד מיטוכונדריה. שיטות המשמשות באופן נרחב כדי להעריך את מצב חיזור של תאים או שלמים מבודדת המיטוכונדריה מבוססות על מדידת הרמות של זוג חמזור GSH / GSSG 15. המערכת נמצאת בשימוש luciferin-לוציפראז נפוץ למדידת המיטוכונדריהרמות ה-ATP בכל תאים שלמים permeabilized או מבודד המיטוכונדריה. 16,17,18,19,20 ב assay זה, לוציפראז נקשר ה-ATP ומזרזת חמצון של וchemiluminescence מluciferin. 21 עוצמת האור הנפלט הוא ביחס ישר לכמות של ה-ATP בתערובת התגובה. 22

שיטות אלה חשפו מידע מהותי בנוגע לתפקוד המיטוכונדריה, כולל מציאת כי בחולים עם מחלות ניווניות, כמו מחלת אלצהיימר, יש רמות נמוכות באופן חריג ה-ATP. 23 עם זאת, הם לא יכולים לשמש למגורים, תמונת תאים שלמים. יתר על כן, שיטות המבוססות על ניתוח כל התא מספקות ממוצעת של מדינת חיזור או רמות ה-ATP בכל התאים של התא. מדידות באברונים מבודדים הן פוטנציאל בעייתיים משום שמדינת חמזור המיטוכונדריה או רמות ה-ATP עשויה להשתנות במהלך חלוקה subcellular. לבסוף, מחקרים שנעשה לאחרונה מהמעבדה ועוד מצביעים על כךהמיטוכונדריה בתוך תאים בודדים הן הטרוגנית בפונקציה, אשר בתורו משפיעה על תוחלת החיים של תאים אם ובתה. 3 לפיכך, יש צורך למדוד את רמות ה-ATP והמיטוכונדריה מדינת חיזור בתאים חיים עם הרזולוציה subcellular.

את biosensors לתפקוד המיטוכונדריה מתואר כאן הם על בסיס ה-GFP. GFP חיזור רגיש (roGFP) 24,25 הוא גרסת ה-GFP שבו מוסף החשוף על פני השטח cysteines למולקולה. roGFP, כמו פראי סוג של GFP, יש שתי פסגות עירור (ב ~ 400 ננומטר ו ~ 480 ננומטר) ושיא פליטה אחד ב~ 510 ננומטר. חמצון של שאריות ציסטאין בתוצאות roGFP בעלייה בעירור ב ~ 400 ננומטר. הפחתה של cysteines האלה מעדיפה עירור ב ~ 480 ננומטר. לפיכך, היחס בין פליטת ננומטר 510 על עירור של roGFP ב480 ננומטר ו -400 ננומטר מגלה את הכמות היחסית של חמצון מופחת וroGFP, המשקף את מצב חיזור של הסביבה של fluorophore.

שני versיונים של roGFP נמצאים בשימוש נרחב: roGFP1 וroGFP2. שניהם מכילים את אותם הוספות ציסטאין. roGFP1 מבוסס על פראי סוג GFP וroGFP2 מבוסס על S65T GFP, שבו יש עירור יעיל יותר ב480 ננומטר ופחות יעיל בעירור 400 ננומטר לעומת wtGFP 24. roGFP1 הוא פחות רגיש מאשר pH roGFP2 והטווח הדינמי שלה מרחיב עוד יותר לתוך הטווח המופחת. לפיכך, roGFP1 עשויה להיות שימושי יותר לניטור תאים יותר להפחתה כגון המיטוכונדריה או cytosol, ותאים בעלי חומציות משתנה, כגון endosomes. roGFP2 מציע אות בהירה, בחלק מהמחקרים, טווח דינמי גדול יותר מroGFP1 24,26. מחקרים בthaliana ארבידופסיס מצביעים על כך שהזמן הנדרש לתגובה לשינויים במצב חיזור הוא דומה בשני החיישנים (t ½ לחמצון, 65 ו -95 שניות ולא ½ להפחתה, 272 ו 206 שניות, לroGFP1 וroGFP2, בהתאמה). 26

MitGO-ATeam2 הוא פולשנית, אמינהחיישן שמודד את המיטוכונדריה ה-ATP בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים. GO-ATeam הוא העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) בדיקה שמורכבת המקטע של ε F o F-ATP synthase 1 דחוקה בין סריג תורם וחלבוני ניאון acceptor (GFP וכתום חלבון פלואורסצנטי (OFP), בהתאמה). 27 כריכה של ה-ATP לתוצאות מקטע ε בשינויי קונפורמציה בחלבון המביאים סריג תורם בסמיכות לacceptor ולאפשר להעברת אנרגיה מתורם לacceptor. ישנן שתי גרסאות של Go-ATeam, GO-ATeam1 וללכת-ATeam2. יש GO-ATeam2 זיקה גבוהה יותר לMgATP מאשר ללכת-ATeam1, מה שהופך אותו מתאים יותר למדידה בדרך כלל נמוכים יותר [ATP] במיטוכונדריה לעומת cytosol. 27

לחקור מדינת חמזור המיטוכונדריה, אנו נבנו חלבון היתוך (מיטו-roGFP1) בהיקף של roGFP1 התמזג רצף מנהיג ATP9ND הביע מביטוי שמרי centromere מבוסס (מספר עותק נמוך) פלסמיד תחת שליטה של ​​דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט החזק (GPD) האמרגן (p416GPD, Addgene). אנחנו השתמשנו roGFP1 לחקור את מצב חיזור של המיטוכונדריה בהקשר של הזדקנות של cerevisiae Saccharomyces פטריית המודל. אנו מוצאים כי roGFP1 יכול לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה המתרחשים במהלך הזדקנות ובתגובה לזמינות חומרי הזנה, אבל אין כל השפעה מזיקה לכאורה על תאי שמרים. כמו כן, אנו רואים השתנות במצב חיזור של המיטוכונדריה בתוך תאי שמרי חיים בודדים, ממצא זה מדגיש את החשיבות של biosensor עם רזולוציה מרחבית subcellular.

MitGO-ATeam2 הנו נגזרת של GO-ATeam2, שבו יש רצף של המיטוכונדריה אות VIIIA מקטע מונואמין ג ציטוכרום הוכנס בתחנה הסופית של אמין GO-ATeam2. -27 שונה חללית mitGO-ATeam2 (בחביבות על ידי המעבדה של ח Noji, מכון OF מדע ומחקר תעשייתי, אוניברסיטת אוסקה, יפן) לשימוש בשמרים על ידי subcloning, באמצעות Xba1 ואתרי HindIII, לתוך וקטור ביטוי שמרי pAG415GPD-ccdB (Addgene, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב), שהוא נמוך עותק פלסמיד המכיל את אמרגן GPD המכונן החזק. אנחנו הביעו mitGO-ATeam2 בשמרי ניצנים, ולמצוא, לפי counterstaining עם הצבע DAPI-DNA המחייב, כי זה localizes באופן בלעדי למיטוכונדריה, שם היא משמשת כבדיקה יעילה למדידת שינויים פיסיולוגיים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה.

roGFP וללכת-ATeam שניהם מקודדים גנטי. כתוצאה מכך, הם יכולים להיות הציגו ומתוחזק ביציבות בתאים שלמים, ולספק מידע על מצב חיזור או רמות ה-ATP בתאים בודדים, המתגוררים. יתר על כן, שני biosensors לעקוב אחר שינויים במצב חיזור או רמות ה-ATP שמתרחשות בתנאים פיסיולוגיים. 28 שתי הבדיקות גם ratiometric. כתוצאה מכך, מדידות שנעשו עם בדיקות אלה אינן מושפעות על ידי צ'הnges בריכוז biosensor או תאורת מדגם או עובי. לבסוף, שני biosensors לספק רזולוציה מרחבית subcellular. ואכן, roGFP כבר ממוקד למיטוכונדריה, ER, endosomes וperoxisomes 24, ויכול לזהות שינויים במצב חיזור של כל אחד מהאברונים האלה, בלתי תלויים ברמת החומציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טרנספורמציה של תאי שמרים עם Biosensors

  1. להפוך את זן השמרים הרצויים עם פלסמיד נושא מיטו-roGFP או mitGO-ATeam2 בשיטה אצטט ליתיום 27.
  2. כדי לאשר את השינוי עם biosensor פלסמיד הנישא ועל מנת למנוע אובדן של פלסמיד, לבחור ולשמור על transformants הבינוני המלאה המתאימה סלקטיבית הסינטטי (SC-Ura למיטו-roGFP, או SC-Leu לmitGo-ATeam2). אם הבדיקה הניאון כבר subcloned בפלסמיד שונה מאלה המתוארים כאן, להשתמש במצע סלקטיבי המתאים. דמיין transformants על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר שהם מביעים biosensor הניאון ולהציג מורפולוגיה המיטוכונדריה נורמלית.

2. צמיחה של תאים והכנה להדמיה

תפקוד תא ותגובה לטיפול תרופתי תלויים מאוד בצפיפות תאים ופעילות מטבולית. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר תאיםבאופן פעיל בחלוקה (שלב אמצע יומן, ~ 0.5 - 1 x 10 7 תאים / מ"ל). הדרך אמינה ביותר ליצירת תרבויות שלב אמצע יומן, של צפיפות עולה בקנה אחד היא לחסן ממראש תרבות נייחת שלב.

  1. הכן מראש תרבות נייחת שלבים: פיק מושבה אחת של תאים הפכו מצלחת ולחסן תקשורת נוזלית סלקטיבית (5 מ"ל בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי התחתון). לגדול ב 30 ° C עם הרועד בסל"ד 225 עד הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) הגיעה לרמה (24-48 שעות).
  2. הכן את תרבות שלב אמצע יומן לתצפית: להשתמש בנפח המתאים של טרום התרבות לחסן 5 מ"ל של תקשורת סלקטיבית בצינור חרוטי התחתון 50 מ"ל. תקשורת YPD היא autofluorescent ולא אמור לשמש ללימודים אלה. השתמש שלמה, סוכר, המבוסס נשירה (SC-אורה) תקשורת סינטטי. לגדל תאים על 30 מעלות צלזיוס, רועד ב225 סל"ד, 4-16 לשעה, עד שהם מגיעים לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - 1 x 10 7 תאים / מ"ל). ניתן לקבוע צפיפות תאיםעל ידי מדידת קוטר 600; לכייל ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את קריאת OD 600 הנכונה. בקמן DU530 (Beckman Coulter, אינדיאנפוליס, אינדיאנה), שלב אמצע יומן מתאים לOD 600 של 0.1-0.3.

מיטו-roGFP1 תנודות חושים באברון בתגובה לשינויים מטבוליים. לדוגמה, בשינויי מצב חיזור המיטוכונדריה assay זה כאשר שמרים גדלים על מקורות פחמן (למשל תסיס גלוקוז, כמו בתקשורת SC) לעומת מקורות פחמן שאינו תסיס גליצרול (למשל, כמו בתקשורת SGlyc), ואפילו בקבוצות של אותו שונים תקשורת. לכן, השתמש באותה הקבוצה של אמצעי תקשורת לכל הניסויים.

  1. תאים מוכנים לריכוז (ראה שלב 2.4) והדמיה אם מתבצע ללא טיפול. אם מטופלי תאים, דגירה תאים עם הטיפול המתאים ולהמשיך לשלב הבא.
  2. להתרכז 1 מ"ל של התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 שניות וresuspension של גלולה התא ב20 μl של תקשורת. תנאים אלה למקסם את מספר התאים להבחנה בשדה הראייה.
  3. החל 2 μl של תאי resuspended לשקופית. לכסות עם coverslip (מס '1.5, רצוי בעל ביצועים גבוהים 170 ± עובי 5 מיקרומטר), וסוגר את הקצוות של coverslip עם לק או ברורים valap (ראה ריאגנטים). לאטום עם valap, להמס כמות קטנה במרית מתכת על ידי מחזיק אותו מעל להבת מבער בונזן, ולאחר מכן התפשט בכמות קטנה לאורך הקצוות של coverslip.
  4. שמור על תאים על 30 מעלות צלזיוס במהלך ההדמיה. דוד אובייקטיבי על עדשת טבילת שמן 100x משמשת להדמיה עובד היטב עבור יישום זה. בתנאים אלה, מורפולוגיה המיטוכונדריה, מדינת חיזור ורמות ה-ATP יישארו ללא שינוי במהלך הדמיה למשך 10-15 דקות.

3. התקנת הדמיה

  1. התקנה להדמית מיטו-roGFP1 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום
    השלבים כאן הם מותאמים לAxioObserver.Z1 מיקרוסקופ מצויד במקור Colibri LED עירור, אורקה ER מצלמה רחבת שדה ותוכנת רכישת AxioVision. Photobleaching של שני הערוצים וphotoconversion של חמצון מיטו-roGFP1 מצטמצם משמעותי שימוש בתאורת LED בהשוואה לתאורת כספית קשת מנורה (ראה להלן).
    על מנת למקסם את האות ורזולוציה, השתמש בצמצם הגבוה ביותר המספרי האפשרי במטרה, וההגדלה הנמוכה ביותר המספקת רזולוציה מרחבית מספיק. בנוסף, למיטו-roGFP הדמיה, ודא שהמטרה מעבירה היטב ב365 ננומטר. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar האובייקטיבי (Zeiss) עובד היטב עבור יישום זה.
    הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני מיטו-roGFP1 חמצון ומצטמצמים. אנו משתמשים בתנאים הבאים.
    1. הגדר את הערוץ לחמצון מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 365 ננומטר (100% כוח LED) ומסנן פליטה מתאים לGFP, כגון 38 הם לסנן סט (Zeiss), עם excitatio הכלולהn המסנן הוסר מהקובייה. הסרת מסנן העירור מאפשרת עירור ב 365 ננומטר ושני 470 ננומטר, ללא הצורך לעבור מסננים, וכך להגדיל את הרזולוציה זמן השגה.
    2. הגדר את הערוץ למופחת מיטו-roGFP להשתמש עירור ב 470 ננומטר (100% כוח LED), וכפי שהוזכר לעיל, אותה קוביית מסנן הפליטה המשמשת לחמצון מיטו-roGFP. להגדיר את המצלמה ל1x1 binning כדי לייעל את הרזולוציה מרחבית.
    3. הגדר את התוכנה לרכישת AZ מחסנית בהיקף של 11 פרוסות עם מרווח 0.5 מיקרומטר, איסוף שני ערוצים בכל עמדת z. מצב זה של רכישה הוא איטי יותר מאשר רכישת כל ערימת z בתורו, אבל הוא מונע חפצים הנובעים מתנועה המיטוכונדריה בין רכישת ערוצי חמצון ומצטמצמים.
    4. תמונת מספר תאים כדי לקבוע זמן חשיפה מתאים, הפקת אות להרוות חזקה, אבל לא. חשוב לשמור על היחס של זמני חשיפה לחמצון והקטין מיטו-roGFP1 לכל הניסויים. לדוגמה, אם מתחמצנים את זמני החשיפה ולהקטינו מיטו-roGFP1 הם 300 ו -100 אלפיות שני, בהתאמה, ולאחר מכן את זמן החשיפה לחמצון מיטו-roGFP1 צריך להיות 3 פעמים שהקטין למיטו-roGFP לכל הניסויים.
  2. התקנה להדמית mitGO-ATeam2 על מיקרוסקופ confocal רפאים
    כדי לכמת רמות ה-ATP באמצעות mitGO-ATeam2, הקרינה מGFP (ננומטר הפליטה המרבי 510) יש להבחין בין שמOFP (ננומטר הפליטה המרבי 560). ישנן מערכות סינון הקרינה שתפתורנה את הקרינה הנפלטת מfluorophores אלה. עם זאת, אנו מוצאים כי גלאי רפאים, נגיש בליזר רבים סריקה מיקרוסקופי confocal, עובד הכי טוב עבור יישום זה. גלאי רפאים מפריד בין פליטת הקרינה למרכיבים רבים (בדרך כלל 32 או יותר) על פי אורך גל. כמה להקות גל סמוכות ניתן לשלב ערוץ תמונה אחת. אורכי הגל שנבחרו באופן אמפירי בשילוב כדי למקסם אות GFP וOFP תוך הימנעות מוצלב של אות שהייתי לבלבל סריג מדידה. השתמש בעדשת הצמצם המספרית הגבוהה ביותר הקיימת. אנו משתמשים ב100x/1.49 או 60x/1.49 עדשת Apo-TIRF. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal A1R ניקון פועל תוכנת אלמנטי ש"ח. הגדר את תוכנת הרכישה כדי ללכוד את מיני mitGO-ATP ATeam2 בכריכות וATP-מאוגד. אנו משתמשים בתנאים הבאים.
    1. הגדר חריר ל1.0 יחידות אווריריות (AU), אשר במערכת שלנו תואמות את AZ הרזולוציה של כ 0.42 מיקרומטר.
    2. הגדר זום סריקה כדי להתקרב לגבול דגימת נייקוויסט, אשר תהיה למקסם את המידע המרחבי בתמונה. במערכת שלנו הוא בגודל פיקסל 0.12 מיקרומטר.
    3. בגלל המיטוכונדריה עשויה לעבור במהלך הדמיה, זה יכול להיות מועיל כדי להגביר את מהירות הדמיה על ידי חיתוך לשדה 512 x 256 פיקסלים. הזמן הכולל נדרש לתמונת מסגרת אחת במערכת שלנו הוא 1.0 שניות, כולל סריקה ממוצעת פי 2. בהתאם לרזולוציה מרחבית רצויה, השדה יכול להיות קצוץ נוסף לincreasדואר רזולוציה זמן.
    4. אקסייט ב 488 ננומטר, ולאסוף פליטה 500-520 ננומטר עבור ה-GFP, ו550-580 ננומטר לOFP. ערכים אופטימליים בפועל עשויים להשתנות עם מאפיינים של מערכת ההדמיה.
    5. כוח לייזר האופטימלי למערכת שלנו הוא בין 6.0 ו 6.4%. כוח לייזר האופטימלי ישתנה עבור כל מערכת מיקרוסקופ, אבל באופן אידיאלי להיות נמוך ככל האפשר, תוך הפקת תמונה לפירוש. השתמש במד כוח פנימי או חיצוני כדי לפקח על שינויים בכוח לייזר, אשר מתרחשים בדרך כלל על פני זמן בכל מערכת אופטית.
    6. התאם רווח גלאי ועוצמת אור תאורה על מנת למקסם את הטווח של ערכים המזוהה פיקסל אך להימנע להרוות את האות, כלתאים רבים ככל האפשר. לא לנתח כל תאים המכילים יותר מ 1% פיקסלים רוויים. תמונה כל הדגימות באמצעות אותה מטרה, כוח לייזר, סריקת זום, גודל פיקסל, רווח, ולקזז.

4. רכישת תמונה

  1. איתור מוקדי PLA ne של תאים בעלי עניין באמצעות אור מועבר כדי למזער הלבנת הבדיקה הניאון.
  2. לאחר איתור תא אחד או יותר של עניין, לאסוף Z-סדרה באמצעות כל עומקו של תא טיפוסי (כ 7 מיקרומטר) באמצעות גודל צעד של 0.5 מיקרומטר.
  3. תמונת תאים אחרים בעלי עניין בשקופית, אבל אין תמונה בשקופית אחת למשך זמן ארוך יותר מ -15 דקות. לאחר 15 דקות בשקופית, תאים מאבדים את יכולת קיום.

5. אנליזה

רמת ה-ATP מיטוכונדריאלי נקבעת על ידי מדידת היחס בין פליטת mitGO-ATeam2 ב 560 ננומטר כדי שב 510 ננומטר 27 מדינת חיזור של אברון נמדדת כיחס מצטמצם לחמצון (R / O) של מיטו-roGFP;. כלומר פליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 470 ננומטר מחולק בפליטה ב 510 ננומטר על עירור ב 365 ננומטר. לפני חישוב היחס, אנו לחסר רקע ולקבוע ערך סף לפיקסלים השייכים למיטוכונדריה ניאון.

אוהל "> ברשות ציבור (למשל ImageJ 30) או זמינה מסחרי (Volocity למשל, פרקין אלמר) תוכנה יכולה לשמש לניתוח של מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam2. בהתאם לתוכנה המשמשת לרכישת תמונה ולניתוח, את התמונות ייתכן שיצטרך להיות מומר לפורמט אחר, כמו TIFF, לפני פתיחתם בתוכנת הניתוח. אם תמונות מומרות, זה חיוני כדי לוודא שערכי הפיקסלים לא משתנה במהלך ההמרה. ניתוח של נתונים מיטו-roGFP1, באמצעות שתי התוכניות מתוארת להלן. תפריטי תכנית ואפשרויות לבחירה בתוך כל תפריט מודגשים בכתב נטוי מודגש.

ניתוח ImageJ 5.1

  1. פתיחת תמונות ולשנות את סוג ל32 סיביות: תמונת → → סוג 32 ביט.
  2. צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. לחשב את עוצמת הממוצעת בהחזר על השקעה זו: נתח → מדוד.
  3. הפחת את הרקע הממוצע מחושב מהמחסנית: תהליך → המתמטיקה → לחסר.
  4. באמצעות Z-המחסנית נגרעה, למצוא את הפרוסה אמצעית ועל סף מיטוכונדריה: תמונת → התאם → הסף ולחץ על החל על סף החלון. אחול על כל הפרוסות בערימה. בדקו הגדרת פיקסלים רקע לנאן.
  5. ליצור יחס z ערימה: תהליך → מחשבון תמונה מחלקים את הערימה המופחתת על ידי הערימה מתחמצנת z לניתוח מיטו-roGFP1. מחלקים את תמונת 560 ננומטר (ATP המאוגד) על ידי 510 ננומטר (מאוגד ATP) תמונה לניתוח mitGO-ATeam2.
  6. צייר את ההחזר על ההשקעה מסביב לאזור של עניין. בחר לנתח → כלים → ROI מנהל, ולחץ על הוסף כדי להקליט את ההחזר על ההשקעה. אזורים מרובים עשויים להיות מאוחסנים במנהל. במנהל החזר על השקעה, בחר את כל ROIs, ואז לבחור Mעפרות → Multi-מדוד למדוד כל פרוסות המחסנית. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח.

ניתוח Volocity 5.2

  1. יבוא תמונות לתוך ספריית Volocity וליצור תמונה ברצף עם 2 ערוצים.
  2. צייר אזור של עניין (ROI) באזור שבו אין תאים. בחר: כלים → יחס.
  3. השתמש Volocity כדי לחשב את הרקע: קבל מהחזר על ההשקעה.
  4. התאם את הסף לכלול מבני המיטוכונדריה.
  5. בדקו את האפשרות להחיל LUT קשת לערוץ היחס. ערוץ עוצמת-מווסת עשוי להפיק תמונה פחות רועשת לpresenta tion, אבל זה לא צריך להיות בשימוש כדי לכמת את היחס ממוצע.
  6. בחר בכרטיסייה המדידה, בחר בערוץ יחס החזר על השקעה ולצייר מסביב לאזור של עניין. מדוד את ערוץ היחס, למעט ערכים אפס. אזורים מרובים עשויים להיות נבחרו ונמדדובאותו הזמן. יצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידת מדינת חמזור המיטוכונדריה עם מיטו-roGFP

כאן, אנו מראים שיש לו מיטו-roGFP1 הטווח הדינמי כדי לזהות שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה מחמצון מופחת באופן מלא לחיים בתאי שמרים, מבלי להשפיע על צמיחת תאי שמרים או במורפולוגיה של המיטוכונדריה. ראשית, אנו מוצאים תאים להביע GFP המיטוכונדריה במיקוד וroGFP1 לצמוח בשיעורים רגילים (איור 1 א). שיעור הצמיחה המרבי, כפי שנמדד על ידי שיפוע מרבי של עקומת הצמיחה במהלך צמיחת יומן שלב והזמן כדי להגיע לשיעור צמיחה מרבי, דומה בתאים המבטאים מיטו-GFP ומיטו-roGFP1. יתר על כן, המיטוכונדריה בשמרים להביע מורפולוגיה פראית סוג תערוכת מיטו-roGFP1 (איור 1). באופן ספציפי, הם צינורי, ליישר לאורך ציר אמא הנץ, ולצבור בקצוות של תאים אם ובתה. מאז תפקוד המיטוכונדריה לעתים קרובות גורם לפיצול, מורפולוגיה נורמלית זה תומך ברעיון שמיטו-roGFP1 עושהלא להפריע תפקוד המיטוכונדריה.

על מנת להעריך את הטווח הדינמי של מיטו-roGFP1, התייחסנו תאי שמרים פראיים מסוג אמצע יומן-שלב עם מי חמצן (H 2 O 2) וdithiothreitol (DTT), בהתאמה, ומדדתי את יחס R / O המיטוכונדריה הממוצע להעריך המיטוכונדריה מדינת חיזור (איור 2). טיטרציה עם H 2 O 2 או DTT מ -0 עד 10 מ"מ תוצאות בשינוי המינון תלוי ביחס R / O הסלולרי ממוצע בטווח נמדד מ0.6 (תחת תנאי חמצון) על 1.23 (תחת צמצום תנאים). לפיכך, מיטו-roGFP1 הוא biosensor יעיל לניתוח של מדינת חמזור המיטוכונדריה בתאים חיים.

מיטו-roGFP1 גם מציע רזולוציה subcellular של מדינת חמזור המיטוכונדריה. הרזולוציה subcellular זו מגלה כי המיטוכונדריה בתוך תאי שמרים בודדים שונה במדינת חמזור היחסית. אם המיטוכונדריה בתוך תא שמרים הן יחיד תפקודי מובהקת, זה אפשרי, כיy הם פסיבי או אקטיבי נפרד (איור 3). הפרדה כזו יכולה לתרום לאם ובת סימטריה גיל וההתחדשות של תאי בת. ממצא זה מדגיש את הצורך בbiosensor עם הרזולוציה subcellular של מדינת חמזור המיטוכונדריה.

זה כבר זמן רב ידוע כי 31 אור יכול לגרום לשינויים בchromophore ה-GFP. בחשיפה לאור בעוצמה גבוהה 400 ננומטר, roGFP1 עובר photoconversion למין עם ספקטרום פליטה שונה 26. כאשר photoconversion מתרחש, יש ירידה בפליטה ירוקה מחומצן מיטו-roGFP1 וגידול בפליטה ירוקה על עירור של מופחת מיטו-roGFP1, המשנה את היחס של R / O-מיטו roGFP1 (איור 4). באמצעות עירור (תאורה לדוגמה ב 40% תוך שימוש ב400 ננומטר LED במקור אור Colibri) בעצימות נמוכות, אין photoconversion משמעותי במהלך התקופה נותחה (איור 4C). עמ ' דרך המכונה להפחית photoconversion היא כדי לעורר את טופס חמצון של roGFP ב365 ננומטר (ראה דיון).

מדידת המיטוכונדריה ATP עם mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 localizes למיטוכונדריה כאשר באו לידי ביטוי בתאי יונקים. 27 אנו מוצאים כי mitGO-ATeam2 colocalizes עם ה-DNA המיטוכונדרי DAPI מוכתם בשמרים, והוא נמצאו במבנים צינוריים טיפוסיים של שמרים פראיים סוג המיטוכונדריה (איור 5 א). לפיכך, אנו וידאנו שרצף מיקוד המיטוכונדריה מציטוכרום C אוקסידאז המקטע VIIIA היונקים localizes את החללית למיטוכונדריה בשמרים מבלי לשבש את המורפולוגיה של המיטוכונדריה. בנוסף לכך, אנו מוצאים כי שיעור הצמיחה של תאים המבטאים mitGO-ATeam2 דומה לזה של תאים להביע GFP המיטוכונדריה ממוקד בשניהם גלוקוז ותקשורת גליצרול (איור 5). לכן, הביטוי של mitGO-ATeam2 אינו מופיע מזיקים לתא או מיטוכונדריה.

_content "> בשלב הבא, בדקנו אם mitGO-ATeam2 סריג מגיב לשינויים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה. לשם כך, אנו תאי מטופלים עם antimycin, סוכן שנקשר לציטוכרום C רדוקטאז, מעכבים את החמצון של Ubiquinol בשרשרת העברת האלקטרונים , משבש את שיפוע הפרוטון, ומעכב את ייצור ה-ATP של המיטוכונדריה. החציון 20 סריג ירידות יחס בתאים שטופלו בAntimycin (איור 6 ג').

בהתחשב בראיות שmitGO-ATeam2 הוא biosensor יעיל למיטוכונדריה ה-ATP, השתמשנו בבדיקה זו כדי לעקוב אחר רמות ה-ATP המיטוכונדריה בשמרים שהיו מופצת באמצעות התססת מקור פחמן או שאינן התססה (איור 6 א ו 6 ב). ההפחתה באזור הניאון הכולל בתאים שגודלו בגלוקוז אישר כי תוצאות דיכוי הגלוקוז בירידה בשפע המיטוכונדריה. נציין וריאציה תא אל תא ברמת mitGO-ATeam2. מעניין לציין, כי נתונים הראשוניים שלנו מצביעים על כך שיש ma y להיות הבדלים ברמות ה-ATP במיטוכונדריה שונה בתוך אותו התא (איור 6 ד ').

איור 1
איור 1. מיטו-roGFP1 מזהה מדינת חמזור המיטוכונדריה מבלי להשפיע על שיעורי צמיחת תא או במורפולוגיה של המיטוכונדריה. () צמיחה של שמרים שמבטאים GFP המיטוכונדריה במיקוד או RO-GFP1 נמדד כשינוי בצפיפות אופטית ב 600 ננומטר, כפונקציה של זמן של צמיחה ב בינוני SC-Ura נוזלי ב 30 מעלות (ב ') פנל עליון ג: מורפולוגיה המיטוכונדריה רגילה וערוץ לוקליזציה בתמונות גולמיות. לוחות נמוכים: רציו תמונות להראות ערוץ המופחת מחולק בערוץ חמצון (הפניה צבע בצד ימין). התמונות מראות את ההשפעה של בחירת סף על תוצאות. הסף האופטימלי כולל מבני המיטוכונדריה ורקע לא כולל.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2

איור 2. מיטו-roGFP1 מזהה שינויים במצב חיזור המיטוכונדריה בתגובה לטיפול עם מי חמצן או dithiothreitol. (א.ב.) תאי שמרים לשלב אמצע היומן להביע מיטו-roGFP1 הודגרו בתקשורת SC-Ura ללא טיפול (0) או עם הריכוזים המצוינים של H 2 O 2 או DTT עבור 20 דקות ב 30 ° C. () תחזיות בעוצמה מרביות של תמונות מיטו-roGFP1 יחס R / O הן על גבי מועברות בתמונות אור, אשר מראות קווי המתאר סלולרי. ההתייחסות לצבע מיטו-roGFP1 מוצגת בפינה ימנית עליונה. בר:. 5 מיקרומטר (ב ') לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. מיטו-roGFP1 מציע רזולוציה subcellular של מדינת חמזור המיטוכונדריה. הקרנת העצמה מקסימלית של ערוץ יחס מיטו-roGFP1 R / O היא על גבי תמונה משודר אור. ההתייחסות לצבע מיטו-roGFP1 מוצגת בפינה ימנית עליונה. בר: 5 מיקרומטר. תא המסוים הזה יש לו יחס מיטו-roGFP1 R / O ממוצע של 0.88. עם זאת, מראה פרט המיטוכונדריה בתוך תא זה חיזור מדינות שונות. את המספרים המוצגים הם היחס מחושב R / O-מיטו roGFP1 עבור מחדש המיטוכונדריה שונהgions. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4. עירור בעוצמה גבוהה גורם לphotoconversion ויחסים שינה R / O-מיטו roGFP1. שמרי שלב אמצע היומן להביע מיטו-roGFP1 היו מוארים באור 400 ננומטר ב 40% (א) או (ב) כוח ממקור אור LED 100% והקרינה מהחמצון מופחת ומיטו-roGFP1 נתפסה כל 4 שניות. תמונות המוצגות הן תחזיות מרביות שבו צבעים מייצגים את יחס R / O של מיטו-roGFP1 (ראה קנה מידה צבע בפינה ימנית תחתונה). בר:. 5 מיקרומטר (ג) יחס R / O של מיטו-roGFP1 נשאר קבוע לאורך כל תקופת ההדמיה על תאורה ב 40% כוח LED. עם זאת, על תאורת LED ב 100% כוח, אנחנותבחין בשינוי תלוי זמן ביחס R / O של מיטו-roGFP1, המשקף photoswitching של fluorophore. ריבועים שחורים, 40% LED כוח;. יהלומים אפורים, 100% כוח LED לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. MitGO-ATeam2 localizes למיטוכונדריה בשמרים ואינו משפיע על שיעורי צמיחת תאי שמרים. () תאי שמרים המבטאים mitGO-ATeam2 גדלו ליומן אמצע שלב, קבוע באמצעות paraformaldehyde ומוכתם עם הצבע DAPI-DNA המחייב, כפי שתוארו לעיל 19. תמונות מוצגות הן תחזיות המרבית בעוצמה של deconvolved Z-Series. לשם פשטות, את תמונות mitGO-ATeam2 התקבלו באמצעות מסנן GFP קונבנציונלי, כך שהם מייצגים רק את האוכלוסייה מאוגדת ל-ATP. תא החוצהקווים מוצגים בלבן. N: ה-DNA הגרעיני. mtDNA: ה-DNA של המיטוכונדריה. בר: 1 מיקרומטר (ב ') עקומות צמיחה של תאי שמרים פראיים מסוג להביע GFP המיטוכונדריה במיקוד או mitGO-ATeam2 במבוסס גלוקוז (SC) ומבוסס גליצרול (SGlyc) תקשורת נוזלית על 30 ° C.. נתונים אלה הוא ממוצע של quadruplicates עבור כל זן בכל נקודת זמן, והוא הנציג של שני ניסויים בלתי תלויים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
איור 6. אמצעי MitGO-ATeam2 שינויים ברמות ה-ATP במיטוכונדריה שמרים ברזולוציה subcellular וsuborganellar. (א.ב.) פליטה של mitGO-ATeam2 מGFP (510 ננומטר) וOFP (560 ננומטר), ולכמת את יחס פליטת ננומטר 560/510 של שמרים תאים שגודלו בלילה גלוקוSE מבוסס (SC) (א) או מבוסס גליצרול (SGlyc) (ב) כלי תקשורת. ההתייחסות לצבע ערוץ 560/510 היחס מוצגת בפינה ימנית תחתונה. בר:. 1 מיקרומטר (C) Quantitation של יחס 560/510 לתאים מופץ באמצעי תקשורת SGlyc עם או בלי antimycin (2 מיקרוגרם / מ"ל) עבור השעה 1 ב 30 ° C. הירידה ברמות ה-ATP על antimycin טיפול הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית (מבחן משמעות קרוסקל-ואליס). (ד ') 560 ננומטר nm/510 יחס של mitGO-ATeam2 של תא באמצע יומן שלב פראי סוג מופץ באמצעי תקשורת SC. ההתייחסות לצבע ערוץ 560/510 היחס מוצגת בפינה ימנית תחתונה. קווי המתאר התא מוצג בלבן. יחס 560/510 ננומטר אומר עבור כל התא הוא 0.43. המספרים המוצגים הם 560/510 ננומטר היחסים של אזורים ספציפיים בתוך המיטוכונדריה. בר: 1 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטות לשימוש מיטו-roGFP1 וmitGO-ATeam2 כחיישנים ביולוגיים להערכת מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP בתאים חי שמרים. אנו מוצאים את ביטוי שתוצאות פלסמיד שמקורן מיטו-roGFP1 או mitGO-ATeam בכמותית המיקוד למיטוכונדריה, ללא כל השפעה ברורה על מורפולוגיה של המיטוכונדריה או הפצה או בשיעורי צמיחה סלולריים. 3 מיטו-roGFP1 יכול לזהות שינויים במצב חיזור מהמיטוכונדריה ביותר מתחמצן למדינות מופחתות מאוד. באופן דומה, mitGO-ATeam יכול למדוד שינויים ברמות ה-ATP המיטוכונדריה המתרחשים בשמרים בתהליך הצמיחה המונעת על ידי נשימה ושמרים שטופלו במעכבי נשימה. יתר על כן, מאחר ששני biosensors מציע רזולוציה subcellular, הם יכולים לזהות ההטרוגניות במדינת חיזור או רמות ה-ATP בתוך המיטוכונדריה של תאים בודדים. לבסוף, מאחר ששני החיישנים הביולוגיים הם בדיקות ratiometric, הם אינם מושפעים משינויים בריכוז או השתנות בעובי מדגם או חולהumination. בדיקות אלה מספקות גישה פולשנית לחקר תפקוד המיטוכונדריה עם הרזולוציה subcellular בתאים חיים.

כדי ליישם את השיטה בהצלחה, צריכים להירכש תמונות עם יחס אות לרעש המרבי האפשרי. צעד ראשון חשוב הוא לבחון תאי 10-20 מושבות transformant מתחת למיקרוסקופ ובחר אלה עם הקרינה חזקה ומורפולוגיה המיטוכונדריה נורמלית ושיעורי צמיחה. בשלב הבא, צריכים להיות מותאמים לתנאי הדמיה לייצר גבוהה, אבל לא להרוות, ללא גרימת נזקי עוצמות לחלבון פלואורסצנטי או בתאים. כמה תאים באוכלוסייה (<1%) עלולים להיות הקרינה כוללת גבוהה במיוחד או נמוכה עקב שינוי במספר עותק פלסמיד; אלה ניתן להתעלם לטובת לכידת תמונות לפירוש של רוב התאים.

למרות היתרונות של מיטו-roGFP ברורים, זה גם חשוב להיות מודע לבעיות פוטנציאליות. אנו מזהיםהבדלים בפוטנציאל חיזור של המיטוכונדריה לא רק עם הבדלים המושרה מקור פחמן בחילוף חומרים בתא, אלא גם על הריבוי של שמרים במנות של אותו המדיום שונות. לפיכך, יש לנקוט בזהירות בעת בחירת תקשורת צמיחת תאים למדידות חמזור המיטוכונדריה. יתר על כן, למרות שמיטו-roGFP מציע רזולוציה מרחבית חסרת תקדים של מדינת חמזור המיטוכונדריה, החלטה זמנית של roGFP אינה מספיק כדי לזהות התפרצויות של ROS המשויכים ROS התמרה אות 31. לבסוף, יש להקפיד בבחירת אורך הגל ועוצמת העירור לטופס חמצון של roGFP. תאורה בצורה אופטימלית 400 ננומטר מרגשת את מיני חמצון של roGFP. עם זאת, זה גם מלהיב roGFP הפחית במידה רבה יותר בהשוואה לעירור ב 365 ננומטר. זה מוביל לרגישות מופחתת במדידת מצב חיזור של המיטוכונדריה. יתר על כן, חשיפה של מיטו-roGFP1 לתאורה בעוצמה גבוהה ב 400 ננומטר מובילה לphotoconversion של החלבון למפרטies עם מאפיינים ספקטרליים שהשתנו. לא ראו photoconversion על תאורה בעוצמה גבוהה ב365 ננומטר. לכן, אנו ממליצים להשתמש בעירור 365 ננומטר, אם אפשר.

MitGO-ATeam2 יש גם מגבלות. לדוגמה, מאז mitGO-ATeam2 הוא בעצמו חלבון זה עלול להינזק על ידי עלבונות סלולריים כוללים מיני חמצן תגובתי, אשר עלול לפגוע בפעילות biosensor שלה. בנוסף, ה-GFP ואורכי גל פליטת OFP (510 ו 560 ננומטר) חייבת להיפתר לסריג ניתוח, שעלולה להיות קשה במיקרוסקופי הקרינה קונבנציונליים.

שלא כמו במבחני אנזים במבחנה, מבחני לחיות תאים אלה לדווח על שינויים יחסיים במיטוכונדריה ה-ATP או מדינת חיזור, ולא מודדים את הריכוז המוחלט של ה-ATP או ציסטאין מופחת. למרות שעקומה סטנדרטית יכולה תיאורטית להיות שנוצרה על ידי מדידת התגובה של חלבוני חיישן בפתרון, זה אולי לא יחול על הסביבה המולקולרית שונה בתוך המיטוכונדריה. Ther efore, מבחני אלה לספק אמצעי השוואת תאים בתנאים שונים. בנוסף, תנאי הדמיה להשתנות, ולכן ערכי היחס המדויקים שנרכשו על התקנת הדמיה אחד לא יכולים להיות משוכפלים על אחר.

טכניקות אלו ליחס הדמיה יכולה להיות מותאמות לאינדיקטורים אחרים, כולל ratiometric roGFP האחר או isoforms GO-ATeam ובדיקות פונקציונליות אחרות. הבחירה של מיקרוסקופיה שדה רחב או confocal תהיה תלויה בבדיקה וברזולוציה מרחבית הנדרשת. השיטה רחבה בתחום שימש כאן למיטו-roGFP משום שהיא מאפשרת עירור ב 365 ננומטר, אשר משפר את הרגישות ויציבות של החיישן. שיטת confocal עם גלאי רפאים, כפי שמשמשים כאן לmitGO-Ateam, מספקת דרך נוחה כדי לחסל מוצלב פליטה על ידי התאמת חלונות איתור הרפאים. עם זאת, ניתן לבצע ניסויים דומים במיקרוסקופ שדה רחב באמצעות מסננים מותאמים אישית או ביטול מוצלב המחשוב.

ntent "חומרת הדמיה> הקושי הנפוץ ביותר בסוג זה של ניסוי הדמיה זו הוא אות מספיק. (במיוחד את העדשה והגלאים אובייקטיביים) היא קריטית לאיסוף מספיק אות לפרש את הנתונים.

יש שלבי thresholding השפעה רבה על התוצאות, כהכללה של פיקסלים רקע יכולה לצנן את מגמות כלשהן ביחסים שהושגו. שיטות אוטומטיות הן עדיפות, אך בשל אות מוגבלת, thresholding הידני הוא לעתים קרובות את השיטה הטובה ביותר שקיימת. אם נעשה שימוש בספים ידניים, צריכים להיות ביטוי הקריטריונים המשמשים טוב ככל האפשר, וניתוח ייתכן שיהיה צורך לבצע עיוור או על ידי הנסיינים שונים כדי להפגין שחזור. ניסויים שליטים עם antimycin (לmitGO-Ateam2) ו-H 2 O 2 או DTT (למיטו-roGFP) ניתן להשתמש כדי לאשר את השינויים הצפויים ביחסי הקרינה.

מיטו-roGFP וmitGO-ATeam2 הם בדיקות בלתי פולשניות, רציומטרי לניטור מיטוכושר chondrial בתאים חי שמרים. חיישני ratiometric משמשים כאן היו ממוקדים למיטוכונדריה על ידי שילוב של רצפי אותות המיטוכונדריה ספציפיים. תאים סלולריים אחרים יכולים להיות למדו עם התוספת של רצפי מיקוד מתאימים לחיישנים המקוריים. בנוסף, ניתן לשלב את אחד מחיישנים אלה משלימים עם סמני ניאון (למשל עבור אברונים או גורמי איתות) או חיישנים (למשל סידן) כדי למדוד תהליכים רבים בו זמנית בתאים חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מHHMI 56006760 לJDV, המכונים הלאומי לבריאות (NIH) (2 TL1 RR 24,158-6) לDMAW, ומהרפואי קרן אליסון (AG-SS-2465) ו-NIH (GM45735, GM45735S1 וGM096445) ל-LP. GM45735S1 הוצא מ-NIH תחת Recovery Act האמריקאי מהשקעה של 2009. המיקרוסקופים המשמשים למחקרים אלה נתמכים בחלקו על ידי NIH / NCI מענק (5 P30 CA13696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10, (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29, (3-4), 222 (2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131, (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443, (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70, (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278, (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279, (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20, (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276, (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301, (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270, (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30, (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231, (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6, (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6, (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297, (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143, (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. 45-57 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics