Ratiometrisk Biosensors som måler Mitokondrie Redox stat og ATP i levende gjærceller

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver bruk av to Ratiometrisk, genetisk kodet biosensorer, som er basert på GFP, til å overvåke mitokondrielle redokstilstand og ATP-nivåer på subcellular oppløsning i levende gjærceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mitokondriene har roller i mange cellulære prosesser, fra energiomsetningen og kalsiumhomeostase til kontroll av mobilnettet levetid og programmert celledød. Disse prosessene påvirker og påvirkes av redoks status og ATP produksjonen av mitokondriene. Her beskriver vi bruk av to Ratiometrisk, genetisk kodet biosensorer som kan oppdage mitokondrie redokstilstand og ATP-nivåer på subcellular oppløsning i levende gjærceller. Mitokondrielle redokstilstand måles ved hjelp av redoks-sensitive grønt fluorescerende protein (roGFP) som er målrettet mot den mitokondriematrix. Mito-roGFP inneholder cysteiner i posisjonene 147 og 204 av GFP, som er gjenstand for reversibel og miljø-avhengig oksidasjon og reduksjon, som i sin tur endrer eksitasjon spektrum av proteinet. MitGO-ATeam er en Förster resonans energi overføring (FRET) probe der ε subenhet av F o F 1-ATP syntase er klemt mellom FRET donor og acceptor fluorescent proteiner. Binding av ATP til ε subenheten resultater i konfirmasjoner endringer i protein som bringer FRET donor og akseptor i umiddelbar nærhet og gir mulighet for fluorescens resonans energi overføring fra giver til acceptor.

Introduction

Mitokondrier er viktige organeller for ATP produksjon, biosyntesen av aminosyrer, fettsyrer, heme, jern svovel klynger og pyrimidiner. Mitokondriene spiller også sentrale roller i kalsiumhomeostase, og i regulering av apoptose. En økende bevis linker mitokondrier til aldring og aldersrelaterte sykdommer som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og Huntingtons sykdom. 2 Mens individer lever hele sitt liv med mutasjoner i mitokondrie proteiner som er assosiert med nevrodegenerative sykdommer, sykdomssymptomer forekommer først senere i livet. Dette indikerer at endringer skjer i mitokondriene med alderen som gjør at sykdommen patologi å dukke opp. Faktisk er mitokondrie fitness korrelert med generell celle helse og levetid i gjær og mammalske celler. 3,4 Her beskriver vi hvordan du bruker genetisk kodet, Ratiometrisk fluorescerende biosensorer for å vurdere to kritiske funksjoner i mitochondria i levende gjærceller: redokstilstand og ATP nivåer.

Mitokondriefunksjon i aerobic energi mobilisering er godt etablert. Mitokondrielle redokstilstand er et produkt av å redusere og oksiderende arter i organeller, inkludert NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutation / glutation disulfide (GSH / GSSG) og reaktive oksygen arter (ROS). Uncoupling mitokondrier eller hypoksi påvirker mitokondrielle luftveiene aktivitet og endrer forholdet mellom NAD + til NADH i organeller. ROS, som er produsert fra ineffektiv elektron overføring mellom komplekser av elektrontransportkjeden i den indre mitokondrie-membran, så vel som fra deaminering av aminer via monoaminoksidase i den ytre mitokondriemembranen 5, skade lipider, proteiner og nukleinsyrer, og har vært knyttet til aldring og alder-assosiert nevrodegenerative sykdommer 6,7,8. ROS også spille en rolle i signaloverføringen i mitochondria, gjennom oksidasjon av GSH. For eksempel NADH dehydrogenase ikke bare bidrar til ROS produksjon, men også er regulert gjennom interaksjoner med glutation pool 9,10. α-ketoglutarat dehydrogenase og aconitase, komponenter av TCA-syklus, utviser redusert aktivitet i oksiderende omgivelser 11,12.

Faktisk er redoks-avhengige reguleringen av aconitase aktivitet bevart fra bakterier til pattedyr 13,14. Dermed overvåke redokstilstand og ATP nivåer av mitokondrier er avgjørende for å forstå deres funksjon og rolle i patologi.

Biokjemiske metoder har blitt brukt til å vurdere redokstilstand eller ATP nivåer av hele celler eller isolerte mitokondrier. Brukte metodene for å vurdere redokstilstand av hele celler eller isolerte mitokondrier er basert på å måle nivåene av redoks par GSH / GSSG 15. Den luciferin-luciferase system er vanlig å måle mitokondrielleATP-nivåer i enten permeabilized hele celler eller isolerte mitokondrier. 16,17,18,19,20 i denne analysen, bindes til ATP og luciferase katalyserer oksydasjonen av luciferin og kjemiluminescens fra. 21. Intensiteten av det utsendte lys er proporsjonal med mengden av ATP i reak-sjonsblandingen. 22.

Disse fremgangsmåter har vist fundamental informasjon vedrørende mitokondriell funksjon, inkludert det funn at pasienter med nevrodegenerative sykdommer, så som Alzheimers sykdom, er unormalt lave ATP-nivåer. 23. De kan imidlertid ikke brukes til bilde levende, intakte celler. Videre metoder basert på hel-celle-analyse gir et gjennomsnitt på redoks-tilstanden eller ATP-nivåer i alle kamrene i cellen. Målinger i isolerte organeller er potensielt problematisk fordi mitokondrie redokstilstand eller ATP-nivåer kan endres i løpet subcellular fraksjonering. Til slutt, nyere studier fra vårt laboratorium og andre tyder på atmitokondriene i individuelle celler er heterogene i funksjon, som i sin tur påvirker levetiden for mor og datter celler. 3. Dermed er det behov for å måle mitokondrie ATP nivåer og redokstilstand i levende celler med subcellular oppløsning.

De biosensorer for mitokondriefunksjonen beskrevet her er begge basert på GFP. Redox-sensitive GFP (roGFP) 24,25 er en GFP variant der overflate-utsatte cysteiner legges til molekylet. roGFP, som vill-type GFP, har to eksitasjon toppene (på ~ 400 nm og ~ 480 nm) og ett utslipp topp på ~ 510 nm. Oksydasjon av cysteinrester i roGFP resulterer i en økning i eksitasjon ved ~ 400 nm. Reduksjon av disse cysteinene favoriserer eksitasjon ved ~ 480 nm. Således, avslører forholdet 510 nm emisjon ved eksitering av roGFP ved 480 nm og 400 nm den relative mengde av redusert og oksidert roGFP, som reflekterer redokstilstand av fluoroforen miljø.

To versioner av roGFP er utbredt: roGFP1 og roGFP2. Begge inneholder de samme cystein innsettinger. roGFP1 er basert på vill-type GFP og roGFP2 er basert på S65T GFP, som har mer effektiv eksitasjon ved 480 nm og mindre effektiv eksitasjon ved 400 nm i forhold til wtGFP 24. roGFP1 er mindre pH sensitiv enn roGFP2 og dens dynamiske området strekker seg videre inn i redusert rekkevidde. Således kan roGFP1 være mer nyttig for å overvåke mer reduserende avdelinger som mitokondrier eller i cytosol, og rom med variabel pH, slik som endosomer. roGFP2 tilbyr lysere signal, og i noen studier, en større dynamisk omfang enn roGFP1 24,26. Studier hos Arabidopsis thaliana indikerer at den tid som kreves for respons på endringer i redokstilstand er lik for begge sensorer (halveringstiden for oksidasjon, 65 og 95 sek og halveringstiden for reduksjon, 272 og 206 sek, for roGFP1 og roGFP2, henholdsvis). 26.

MitGO-ATeam2 er en minimal invasiv, påliteligsensor som måler mitokondrie ATP i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam er en Förster resonans energioverføring (FRET) probe som består av ε subenhet av K o K 1-ATP syntase klemt mellom FRET donor og akseptor fluorescerende protein (GFP og appelsin fluorescerende protein (OFP), henholdsvis). 27. Binding av ATP til ε subenheten resulterer i konformasjonsendringer i proteinet som bringer FRET donor i umiddelbar nærhet til akseptor og gi rom for energioverføring fra donor til akseptor. Det finnes to varianter av GO-ATeam, GO-ATeam1 og GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en høyere affinitet for MgATP enn GO-ATeam1, noe som gjør den mer egnet for å måle vanligvis lavere [ATP] i mitokondriene i forhold til cytosol. 27.

Å sondere mitokondrie redokstilstand, bygget vi en fusjon protein (mito-roGFP1) bestående av roGFP1 smeltet til ATP9 ledersekvensen ennd uttrykt fra en centromer-basert (lav kopi nummer) gjær ekspresjonsplasmid under kontroll av den sterke glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (BNP) promoter (p416GPD, Addgene). Vi brukte roGFP1 å sondere redox status av mitokondrier i sammenheng med aldring av modellen sopp Saccharomyces cerevisiae. Vi finner at roGFP1 kan detektere endringer i mitokondriell redokstilstand som opptrer under aldring og som svar på næringsstoffer, men har ingen tydelig skadelig virkning på gjærcellene. Vi ser også variasjon i redokstilstand av mitokondriene i individuelle levende gjærceller, et funn som understreker viktigheten av en biosensor med subcellular romlig oppløsning.

MitGO-ATeam2 er en variant av GO-ATeam2, som har mitokondrie signal sekvens av cytokrom c oksidase subenheten VIIIA satt inn i aminoenden av GO-ATeam2. 27. Vi endret mitGO-ATeam2 probe (vennlig levert av laboratoriet av H. Noji, Institutt of Scientific and Industrial Research, Osaka University, Japan) for bruk i gjær ved subkloning det, via Xba1 og HindIII områder, inn i gjær ekspresjonsvektoren pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), som er en lav-kopi plasmid inneholder sterke konstituerende GPD promoter. Vi uttrykte mitGO-ATeam2 i spirende gjær, og finne, ved kontrafarging med den DNA-bindende fargestoff DAPI, at den lokaliserer utelukkende til mitokondriene, hvor det tjener som en effektiv sonde for å måle fysiologiske forandringer i mitokondrie ATP-nivåer.

roGFP og GO-ATeam er både genetisk kodet. Som et resultat, kan de innføres og opprettholdes stabilt i intakte celler, og gir informasjon om redokstilstand eller ATP-nivåer i individuelle, levende celler. Dessuten, begge biosensorer overvåke endringer i redokstilstand eller ATP nivåer som oppstår under fysiologiske forhold. 28. Begge sondene er også proporsjonal. Som et resultat, er målinger gjort med disse probene ikke påvirket av changes i biosensor konsentrasjon eller prøve belysning eller tykkelse. Til slutt, begge biosensorer gi subcellular romlig oppløsning. Faktisk har roGFP blitt rettet mot mitokondrier, ER, endosomes og peroxisomes 24, og kan oppdage endringer i redokstilstand av hver av disse organeller, stort sett uavhengig av pH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Transformasjon av gjærceller med Biosensors

  1. Transformere den ønskede gjærstamme med plasmid peiling mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 bruker litium acetat metode 27.
  2. For å bekrefte transformasjon med plasmidet-borne biosensor og for å hindre tap av plasmidet ved å velge og opprettholde transformanter på passende selektiv syntetisk komplett medium (SC-ura for mito-roGFP, eller SC-Leu for mitGo-ATeam2). Hvis den fluorescerende probe er blitt subklonet i et annet plasmid som ikke er beskrevet her, bruk passende selektivt medium. Visualisere transformants av fluorescens mikroskopi for å bekrefte at de uttrykker den fluorescerende biosensor og viser normal mitokondrie morfologi.

2. Vekst av celler og klargjøring for Imaging

Cellefunksjon og respons på behandling er svært avhengig av celle tetthet og metabolsk aktivitet. Best resultat oppnås når celleneaktivt delende (middels logaritmisk fase, ~ 0.5 - 1 x 10 7 celler / ml). Den mest pålitelige måte for å generere mid-log fase kulturer av konsistent densitet er å inokulere fra en stasjonær-fase pre-kultur.

  1. Forbered en stasjonær-fase pre-kultur: plukke en enkelt koloni av transformerte celler fra en plate og vaksinere selektive flytende medier (5 ml i en 50 ml konisk bunn tube). Vokse ved 30 ° C med rysting ved 225 rpm inntil den optiske tetthet av kulturen ved 600 nm (OD 600) har nådd et platå (24-48 timer).
  2. Forbered en mid-log fase kultur for observasjon: Bruk passende volum av pre-kulturen å vaksinere 5 ml av selektive medier i en 50 ml konisk bunn tube. YPD-medier er autofluorescent og bør ikke brukes for disse studiene. Bruk syntetiske komplett, glukose basert, dropout (SC-Ura) media. Dyrke cellene ved 30 ° C og ristet ved 225 opm i 4-16 timer, inntil de når middels logaritmisk fase (~ 0.5 - 1 x 10 7 celler / ml). Celletettheten kan bestemmesved å måle OD 600, kalibrere spektrofotometer for å bestemme riktig OD 600 lesing. På vår Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), tilsvarer mid-log fase til en OD 600 av 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 sanser svingninger i organeller i respons på metabolske endringer. For eksempel, i denne analysen mitokondrielle redoks tilstandsendringer når gjær vokse på fermenterbare karbonkilder (for eksempel glukose, som i SC media) versus ikke-fermenterbare karbonkilder (for eksempel glyserol, som i SGlyc media), og også i forskjellige satser av samme media. Derfor bruker samme batch av media for alle eksperimenter.

  1. Cellene er klar for konsentrasjon (se trinn 2.4) og bildebehandling hvis ingen behandling blir utført. Dersom cellene blir behandlet, inkubere cellene med passende behandling, og fortsette til neste trinn.
  2. Konsentrer 1 ml av kulturen ved sentrifugering ved 6000 xg i 15 sek ogresuspendering av cellepelleten i 20 mL av mediet. Disse forholdene maksimere antall skjelnes celler i synsfeltet.
  3. Påfør 2 mL av resuspenderte celler i et lysbilde. Dekk med et dekkglass (nr. 1.5, gjerne med høy ytelse 170 ± 5 mikrometer tykkelse), og forsegle kantene av dekkglass med klar neglelakk eller valap (se reagenser). Å forsegle med valap, smelte en liten mengde på en metall slikkepott ved å holde den over en gassbrenner flamme, deretter spre en liten mengde langs kantene av dekkglass.
  4. Vedlikeholde celler ved 30 ° C under bildebehandling. En objektiv varmeapparatet på 100x olje nedsenking objektiv for bildebehandling fungerer godt for dette programmet. Under disse forholdene, mitokondrie morfologi, redokstilstand og ATP nivåer forbli uendret under bildebehandling for 10-15 min.

3. Imaging Setup

  1. Oppsett for bildebehandling mito-roGFP1 på et bredt felt fluorescens mikroskop
    Trinnene her er skreddersydd til AxioObserver.Z1 mikroskop utstyrt med en Colibri LED eksitasjon kilde, et bredt felt Orca ER kamera og AxioVision oppkjøpet programvare. Fotobleking av både kanaler og photoconversion av oksidert mito-roGFP1 reduseres betraktelig ved hjelp av LED-belysning i forhold til kvikksølv arc lampe belysning (se nedenfor).
    Å maksimere signal og oppløsning, bruke den høyeste numerisk aperture mulig i mål, og laveste forstørrelse som gir tilstrekkelig romlig oppløsning. I tillegg, for mito-roGFP bildebehandling, må du kontrollere at målet overfører bra på 365 nm. Den 100x/1.3NA EC PlanNeofluar objektiv (Zeiss) fungerer godt for dette programmet.
    Konfigurer oppkjøpet programvare for å fange de oksiderte og reduserte mito-roGFP1 arter. Vi bruker følgende forhold.
    1. Konfigurere kanal for oksydert mito-roGFP å bruke eksitasjon ved 365 nm (100% LED-strøm) og en emisjonsbølgelengde filter egnet for GFP, slik som 38 Den filtersett (Zeiss), med den medfølgende excitatioN filteret fjernet fra kuben. Fjerning av magnetiseringssystemet filter kan eksitasjon ved både 365 nm og 470 nm uten behov for å skifte filtre og dermed øker oppnåelig tidsoppløsning.
    2. Konfigurere kanal for redusert mito-roGFP å bruke eksitasjon ved 470 nm (100% LED-strømmen), og, som nevnt ovenfor, den samme utslipp filter terning brukes for oksydert mito-roGFP. Sett kameraet til 1x1 binning å optimalisere romlig oppløsning.
    3. Sett programvare for å skaffe az stabel bestående av 11 stykker med 0,5 mikrometer avstand, samle begge kanalene på hver z posisjon. Denne modusen for oppkjøpet er tregere enn å kjøpe hver z stabelen i sving, men det hindrer gjenstander som følge av mitokondrie bevegelse mellom kjøp av oksidert og redusert kanaler.
    4. Bilde flere celler for å bestemme en passende eksponeringstid, produsere en sterk, men ikke mette signalet. Det er viktig å opprettholde forholdet for eksponeringstider for oksidert og redusert mito-roGFP1 for alle eksperiments. For eksempel bør hvis eksponeringstider for oksidert og redusert mito-roGFP1 er 300 og 100 msek, så eksponeringstiden for oksidert mito-roGFP1 være tre ganger at for redusert mito-roGFP for alle eksperimenter.
  2. Oppsett for bildebehandling mitGO-ATeam2 på en spektral konfokalmikroskop
    Å kvantifisere ATP nivåer ved hjelp mitGO-ATeam2, fluorescens fra GFP (utslipp maksimalt 510 nm) må skilles fra at fra OFP (utslipp maksimalt 560 nm). Det er fluorescens filter sett som løser fluorescens slippes ut fra disse fluorophores. Imidlertid finner vi at en spektral detektor, tilgjengelig på mange laserskanning confocal mikroskoper, fungerer best for dette programmet. En spektral detektor skiller fluorescensemisjonen til mange komponenter (typisk 32 eller mer) i henhold til bølgelengde. Flere nærliggende bølgelengdebånd kan kombineres til ett bilde kanal. Bølgelengdene som skal kombineres velges empirisk for å maksimalisere signal fra GFP og OFP samtidig unngå crossover av signal som ville forvirre FRET måling. Bruk den høyeste numerisk blenderåpning tilgjengelig. Vi bruker en 100x/1.49 eller 60x/1.49 Apo-TIRF objektiv. Vi bruker Nikon A1R konfokalmikroskop kjører NIS Elements programvare. Konfigurer oppkjøpet programvare for å fange de ATP-bundet og ATP-ubundet mitGO-ATeam2 arter. Vi bruker følgende forhold.
    1. Sett pinhole til 1,0 Luftige enheter (AU), som i vårt system tilsvarer az oppløsning på ca 0,42 mikrometer.
    2. Sett scan zoom å nærme seg Nyquist sampling grense, som vil maksimere spatial informasjon i bildet. På vårt system pixel størrelsen er 0,12 mikrometer.
    3. Fordi mitokondriene kan bevege seg under bildebehandling, kan det være nyttig å øke bildebehandling hastighet ved beskjæring feltet til 512 x 256 piksler. Den totale tiden som kreves for å bildet ett i vårt system er 1,0 sek, inkludert en to-fold scan gjennomsnittet. Avhengig av ønsket romlig oppløsning, kan feltet bli ytterligere beskåret til økte tidsoppløsning.
    4. Excite ved 488 nm, og samle utslipp 500-520 nm for GFP, og 550-580 nm for OFP. Faktiske optimale verdiene kan variere med egenskaper ved imaging system.
    5. Den optimale laser makt for systemet vårt er mellom 6,0 og 6,4%. Den optimale lasereffekten vil variere for hver mikroskop system, men vil ideelt være så lave som mulig og likevel produsere tolkbare et bilde. Bruk en intern eller ekstern strøm meter for å overvåke endringer i laser makt, som oppstår vanligvis over tid i noen optisk system.
    6. Juster detektor forsterkning og belysning lysintensitet for å maksimere den detekterte spekter av pikselverdier men unngå metning av signalet, for så mange celler som mulig. Ikke analysere eventuelle celler som inneholder mer enn 1% mettet piksler. Bilde alle prøvene som bruker samme objektiv, laser makt, skanne zoom, pixel størrelse, gain og offset.

4. Image Acquisition

  1. Finn det sentrale pla ne av celler av interesse ved hjelp av overført lys til å minimalisere bleking den fluorescerende probe.
  2. Etter å lokalisere en eller flere celler av interesse, samle en z-serie gjennom hele dybden av en typisk celle (ca. 7 mikrometer) med en trinnstørrelse på 0,5 ym.
  3. Image andre celler av interesse på lysbildet, men ikke bilde et enkelt lysbilde i mer enn 15 min. Etter 15 min på lysbildet, cellene mister levedyktighet.

5. Analyse

Mitokondriemyopati ATP-nivå bestemmes ved å måle forholdet mellom den mitGO-ATeam2 emisjon ved 560 nm til den ved 510 nm 27 redoks-tilstanden i organeller måles som reduseres til oksydert (R / O)-forhold på mito-roGFP;. Dvs utslipp på 510 nm ved eksitasjon ved 470 nm dividert med utslipp på 510 nm ved eksitasjon ved 365 nm. Før beregningen av forholdet, trekker vi bakgrunn og bestemme en terskelverdi for piksler som tilhører den fluorescerende mitokondriene.

telt "> Offentlig sektor (f.eks ImageJ 30) eller kommersielt tilgjengelig (f.eks Volocity, Perkin-Elmer) programvare kan brukes til analyse av mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam2. Avhengig av programvaren som brukes for bildeopptak og for analyse, bildene kan først må konverteres til et annet format, for eksempel TIFF, før du åpner dem i analysen programvaren. Hvis bildene er konvertert, er det viktig å kontrollere at bildepunktverdier ikke endres under konverteringen. Analyse av mito-roGFP1 data, ved hjelp begge programmene er beskrevet nedenfor. Program menyer og alternativer å velge innenfor hver meny er uthevet i fet kursiv.

5.1 ImageJ analyse

  1. Åpne bilder og endre typen til 32 bit: Bilete → Type → 32 bit.
  2. Tegn en region av interesse (ROI) i et område der det ikke er noen celler. Beregn middelverdien intensiteten i denne ROI: Analyser → Measure.
  3. Trekk beregnet gjennomsnittlig bakgrunn fra bunken: Process → Math → Trekk.
  4. Bruke trekkes z-stack, finne midten slice og terskel på mitokondriene: Bilete → Juster → Terskel og klikk på Apply på terskelen vinduet. Gjelde for alle sektorer i bunken. Sjekk angi bakgrunn piksler til NaN.
  5. Lag forholdet z stack: Process → Bilde Kalkulator Del redusert bunken av oksidert z stabelen for mito-roGFP1 analyse. Dele 560 nm (ATP bundet) bilde av de 510 nm (ATP ubundet) image for mitGO-ATeam2 analyse.
  6. Tegn en ROI rundt området av interesse. Velg Analyser → Verktøy → ROI Manager og klikk på Legg til for å ta opp avkastningen. Flere regioner kan lagres i manager. I ROI Manager velger alle ROIs, velg deretter Mmalm → Multi-Tiltak for å måle alle stabel skiver. Eksportere data til et regneark for analyse.

5.2 Volocity analyse

  1. Importere bilder inn i en Volocity biblioteket og lage et bilde sekvens med to kanaler.
  2. Tegn en region av interesse (ROI) i et område der det ikke er noen celler. Velg Verktøy → forhold.
  3. Bruk Volocity å beregne bakgrunnen: Få Fra ROI.
  4. Juster terskelen for å inkludere mitokondrielle strukturer.
  5. Sjekk muligheten for å bruke en regnbue LUT til forholdet kanal. Intensiteten-modulert kanal kan gi en mindre støyende bilde for fremleggelsen, men det bør ikke brukes for kvantifisering av gjennomsnittlig ratio.
  6. Velg Measurement velger du forholdet kanal og trekke en ROI rundt området av interesse. Måle forholdet kanal, unntatt null verdier. Flere regioner kan bli valgt og målessamtidig. Eksportere data til et regneark for analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling mitokondrie redokstilstand med mito-roGFP

Her viser vi at mito-roGFP1 har det dynamiske området til å oppdage endringer i mitokondrie redokstilstand fra fullt oksidert til redusert i levende gjærceller, uten at det påvirker gjær cellevekst eller mitokondrie morfologi. Først finner vi vokser celler uttrykker mitokondrier-målrettet GFP og roGFP1 ved normale priser (figur 1A). Den maksimale veksten, målt ved maksimal helling på vekstkurven i log-fase vekst og tiden for å nå maksimal vekstrate, er lik i cellene uttrykker mito-GFP og mito-roGFP1. Videre mitokondrier i gjær uttrykke mito-roGFP1 utstillingen vill-type morfologi (figur 1B). Spesielt de er rørformet, justere langs mor-bud aksen, og akkumuleres på tuppen av mor og datter celler. Siden mitokondriedysfunksjon ofte induserer fragmentering, støtter denne normal morfologi ideen om at mito-roGFP1 gjørikke forstyrre mitokondriefunksjonen.

For å vurdere den dynamiske rekkevidden til mito-roGFP1, behandlet vi mid-log fase vill type gjærceller med hydrogenperoksid (H 2 O 2) og ditiotreitol (DTT), henholdsvis, og målte gjennomsnittlig mitokondrie R / O ratio å vurdere mitokondrie redokstilstand (figur 2). Titrering med H2O 2 eller DTT 0-10 mM resulterer i en dose-avhengig forandring i gjennomsnittlig cellulær O / V-forhold med et målte området fra 0,6 (under oksiderende betingelser) til 1,23 (under reduserende betingelser). Dermed er mito-roGFP1 en effektiv biosensor for analyse av mitokondrie redokstilstand i levende celler.

Mito-roGFP1 tilbyr også subcellular oppløsning på mitokondrie redokstilstand. Dette subcellular oppløsning avslører at mitokondriene i individuelle gjærceller varierer i forhold redokstilstand. Hvis mitokondrier innenfor en enkelt gjærcelle er funksjonelt distinkte, er det mulig at deny er passivt eller aktivt segregert (figur 3). En slik segregering kunne bidra til mor-datter alder asymmetri og en fornyelse av datter celler. Dette funnet understreker behovet for en biosensor med subcellular oppløsning på mitokondrie redokstilstand.

Det har lenge vært kjent 31 at lys kan indusere endringer i GFP kromofor. Ved eksponering for høy intensitet 400 nm lys, gjennomgår roGFP1 photoconversion til en art med en annen emisjonsspekteret 26. Når photoconversion skjer, er det en nedgang i grønt utslipp fra oksidert mito-roGFP1 og en økning i grønt utslipp ved eksitasjon av redusert mito-roGFP1, som endrer forholdet mellom R / O mito-roGFP1 (Figur 4B). Ved hjelp av lav-intensitet eksitasjon (f.eks belysning på 40% ved hjelp av de 400 nm LED i Colibri lyskilde), er det ingen signifikant photoconversion under analyseperioden (figur 4C). Den p referert måte å redusere photoconversion er å opphisse oksidert form av roGFP på 365 nm (se diskusjon).

Måling mitokondrie ATP med mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 lokaliserer til mitokondriene når det uttrykkes i celler hos pattedyr. 27. Vi finner at mitGO-ATeam2 colocalizes med DAPI-farget mitokondrie-DNA i gjær, og finnes i rørformede strukturer som er typisk for vill-type gjær mitokondrier (Figur 5A). Således bekreftet vi at den mitokondrielle målsøkende sekvens fra pattedyr-cytokrom c oksidase subenheten VIIIA lokaliserer sonden til mitokondriene i gjær uten å forstyrre mitokondriell morfologi. I tillegg finner vi at veksten av celler uttrykker mitGO-ATeam2 er lik som celler uttrykker mitokondrier-målrettet GFP både glukose og glyserol media (Figur 5B). Dermed gjør ekspresjon av mitGO-ATeam2 ikke vises skadelige for cellen eller mitokondrier.

_content "> Deretter testet vi om mitGO-ATeam2 FRET reagerer på endringer i mitokondrie ATP nivåer. For å gjøre dette, behandlet vi celler med antimycin, en agent som binder seg til cytokrom c reduktase hemmer oksidasjon av ubiquinol i elektrontransportkjeden , forstyrrer proton gradient, og hemmer mitokondrie ATP produksjon. 20. Median FRET ratio nedgang i celler behandlet med antimycin (figur 6C).

Gitt bevis som mitGO-ATeam2 er en effektiv biosensor for mitokondrisk ATP, benyttet vi denne sonde for å overvåke mitokondrielle ATP-nivåer i gjær som ble dyrket ved hjelp av fermenterbare og ikke-fermenterbare karbonkilde (fig. 6A og 6B). Reduksjonen i det totale areal fluoriserende i glukose-vokst celler bekreftet at glukose undertryk resulterer i en reduksjon i mitokondriell overflod. Vi noterer celle-til-celle variasjon i nivået av mitGO-ATeam2. Interessant, viser våre foreløpige data at det ma y være forskjellene i ATP-nivåer i forskjellig mitokondriene i den samme cellen (figur 6D).

Figur 1
Figur 1. Mito-roGFP1 detekterer mitokondrielle redokstilstand uten å påvirke celle-vekst eller mitokondrie morfologi. (A) Vekst av gjær som uttrykker GFP-målrettede mitokondrier eller ro-GFP1 ble målt som forandring i optisk tetthet ved 600 nm som en funksjon av tid med vekst i SC-Ura flytende medium ved 30 ° C. (B) Øvre paneler: Normal mitokondrie morfologi og lokalisering kanal i RAW-bilder. Lavere paneler: Ratio bilder viser redusert kanalen dividert med oksidert kanal (farge henvisning til høyre). Bildene viser effekten av terskelen valg på resultatene. Den optimale terskel inkluderer mitokondrielle strukturer og ekskluderer bakgrunn.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 2

Figur 2. Mito-roGFP1 registrerer endringer i mitokondrie redokstilstand i respons på behandling med hydrogenperoksid eller ditiotreitol. (AB) Midt-log fase gjærceller uttrykker mito-roGFP1 ble inkubert i SC-Ura media med ingen behandling (0) eller med de angitte konsentrasjoner av H 2 O 2 eller DTT i 20 min ved 30 ° C. (A) maksimal intensitet projeksjoner av de R / O mito-roGFP1 ratio bildene oppå overførbare lys bilder, som viser celle skisserer. Fargen referanse for mito-roGFP1 vises øverst til høyre. Bar:. 5 mikrometer (B) Klikk her for å se større figur.

Figur 3
Figur 3. Mito-roGFP1 tilbyr subcellular oppløsning på mitokondrie redokstilstand. En maksimal intensitet projeksjon av R / O mito-roGFP1 ratio kanal legges oppå et overført lys bilde. Fargen referanse for mito-roGFP1 vises øverst til høyre. Bar: 5 mikrometer. Dette bestemte celle har en gjennomsnittlig R / O mito-roGFP1 ratio på 0,88. Men enkelte mitokondriene i denne cellen viser ulike Redox stater. Tallene som er oppgitt er den beregnede R / O mito-roGFP1 ratio for ulike mitokondrie reregionene. Klikk her for å se større figur.

Figur 4
Figur 4. Høy intensitet eksitasjon fører til photoconversion og endret R / O mito-roGFP1 forholdstall. Midt-log fase gjær uttrykke mito-roGFP1 ble belyst med 400 nm lys på 40% (A) eller 100% (B) strøm fra en LED-lyskilde , og fluorescens fra redusert og oksidert mito-roGFP1 ble fanget hvert 4. sekund. Bildene som vises, er maksimumsbeløp anslag på hvilke farger representerer R / O ratio på mito-roGFP1 (se fargeskala i nedre høyre). Bar:. 5 mikrometer (C) R / O ratio på mito-roGFP1 holdt seg konstant over bildebehandling periode ved belysning på 40% LED makt. Imidlertid, ved belysning ved 100% LED kraft, viobservere en tidsavhengig endring i R / O ratio på mito-roGFP1, noe som gjenspeiler photoswitching av fluorophore. Svarte firkanter, LED 40% strøm;. Grå diamanter, 100% LED strøm Klikk her for å se større figur.

Figur 5
Figur 5. MitGO-ATeam2 lokaliserer til mitokondriene i gjær og påvirker ikke gjærcellevegg vekstrater. (A) Gjærceller uttrykker mitGO-ATeam2 ble dyrket til midt-log fase, festes ved hjelp paraformaldehyde og farget med DNA-bindende fargestoff DAPI, som beskrevet tidligere . 19. Bildene er maksimal intensitet projeksjoner av dekonvolveres z-serien. For enkelthets skyld ble de mitGO-ATeam2 bilder som oppnås ved hjelp av en konvensjonell GFP filteret, slik at de bare representerer populasjonen ubundet til ATP. Cell utlinjer er vist i hvitt. N: kjerne-DNA. mtDNA: mitokondrie-DNA. Bar: 1 mikrometer (B) Vekstkurver av vill-type gjærceller uttrykker mitokondrier-målrettet GFP eller mitGO-ATeam2 i glukose-baserte (SC) og glyserol-baserte (SGlyc) flytende medier ved 30 ° C.. Denne informasjonen er gjennomsnittet av quadruplicates for hver stamme på hvert tidspunkt, og er representativ for to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se større figur.

Figur 6
Figur 6. MitGO-ATeam2 måler endring i ATP nivåer i gjær mitokondrier på subcellular og suborganellar oppløsning. (AB) Utslipp av mitGO-ATeam2 fra GFP (510 nm) og OFP (560 nm), og kvantifisering av de 560/510 nm utslipp forholdet gjær celler dyrket over natten i glucoSE-baserte (SC) (a) eller glycerol-basert (SGlyc) (B)-media. Fargen referanse for 560/510 ratio kanal vises nederst til høyre. Bar:. Omkring 1 pm (C) Kvantifisering av 560/510 forholdet for celler dyrket i SGlyc media med eller uten antimycin A (2 ug / ml) i 1 time ved 30 ° C. Nedgangen i ATP-nivåer ved antimycin behandling er statistisk signifikant (Kruskal-Wallis betydning test). (D) 560 nm/510 nm forholdet mitGO-ATeam2 av en mid-log fase vill-type celle dyrket på SC media. Fargen referanse for 560/510 ratio kanal vises nederst til høyre. Cellen omriss er vist i hvitt. Middelverdien 560/510 nm-forholdet for hele cellen er 0,43. Tallene som er oppgitt er de 560/510 nm prosenter av bestemte regioner i mitokondriene. Bar: 1 mikrometer. Klikk her for å se større figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi metoder for å bruke mito-roGFP1 og mitGO-ATeam2 som biosensorer for å vurdere mitokondrie redokstilstand og ATP nivåer i levende gjærceller. Vi finner at uttrykket av plasmid-borne mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterer i kvantitative målretting til mitokondriene, uten noen åpenbar effekt på mitokondrie morfologi eller distribusjon eller på mobilnettet vekstrater. 3 Mito-roGFP1 kan oppdage endringer i mitokondrie redokstilstand fra høyt oksidert til sterkt reduserte stater. Likeledes kan mitGO-ATeam måle endringer i mitokondrie ATP-nivåer som opptrer i gjær gjennomgår åndedrett-drevet vekst og gjær ble behandlet med en åndedrett inhibitor. Dessuten, siden begge biosensorer tilby subcellular oppløsning, kan de oppdage heterogenitet i redokstilstand eller ATP nivåer av mitokondriene i individuelle celler. Til slutt, siden begge biosensorer er Ratiometrisk sonder, er de ikke påvirkes av endringer i konsentrasjon eller variasjon i utvalget tykkelse eller sykumination. Disse sondene gir en minimal invasiv tilnærming til å studere mitokondriefunksjon med subcellular oppløsning i levende celler.

Å kunne anvende denne metode, må bildet erverves med den maksimalt mulige signal-til-støy-forhold. Et viktig første skritt er å undersøke celler 10-20 transformant kolonier under mikroskopet og velg de med robust fluorescens og normal mitokondrie morfologi og vekstrater. Deretter bør tenkelig betingelser være optimalisert for å produsere høy, men ikke mette, intensiteter uten å forårsake photodamage til den fluorescerende protein eller cellene. Noen få celler i en populasjon (<1%) kan ha uvanlig høyt eller lavt samlet fluorescens forårsaket av variasjon i plasmid-kopitall, og disse kan ses bort fra i favør av fange interpretable bilder av flertallet av celler.

Mens fordelene med mito-roGFP er klare, er det også viktig å være oppmerksom på mulige fallgruver. Vi registrererforskjeller i mitokondriell redokspotensial ikke bare med karbon-kilde-induserte forskjeller i celle-metabolisme, men også ved formering av gjær i forskjellige satser av samme medium. Derfor må man være forsiktig når du velger celle vekstmedier for mitokondrie redox målinger. Dessuten, selv om mito-roGFP tilbyr enestående romlig oppløsning på mitokondrie redokstilstand, er temporal oppløsning på roGFP ikke tilstrekkelig til å oppdage utbrudd av ROS som er forbundet med ROS signaloverføringen 31. Til slutt må man være forsiktig når du velger eksitasjonsbølgelengde og intensiteten for den oksiderte formen for roGFP. Belysning på 400 nm hisser optimalt de oksiderte arter av roGFP. Imidlertid eksiterer det også redusert roGFP i større grad sammenlignet med eksitasjon ved 365 nm. Dette fører til redusert følsomhet ved måling av mitokondriell redokstilstand. Videre eksponering av mito-roGFP1 til høyintensitets belysning ved 400 nm fører til photoconversion av proteinet til en speckaper med endrede spektrale egenskaper. Vi har ikke sett photoconversion på høy intensitet belysning på 365 nm. Derfor anbefaler vi eksitasjon bruker 365 nm hvis mulig.

MitGO-ATeam2 har også begrensninger. For eksempel, siden mitGO-ATeam2 er i seg selv et protein det kan bli skadet av mobilnettet fornærmelser inkludert reaktive oksygenforbindelser, som kan svekke dens biosensor aktivitet. I tillegg må GFP og OFP utslipp bølgelengder (510 og 560 nm) løses for FRET analyse, noe som kan være vanskelig på konvensjonelle fluorescensmikroskoper.

I motsetning til in vitro enzymanalyser, disse levende celle-analyser rapportere relative endringer i mitokondrie ATP eller redokstilstand, og måler ikke den absolutte konsentrasjon av ATP eller redusert cystein. Selv om en standard kurve kunne teoretisk bli generert ved å måle responsen til sensoren proteiner i løsning, kan dette ikke gjelder for de ulike molekylære miljø i mitokondriene. Ther ør, disse analysene gir et middel for å sammenligne celler under forskjellige betingelser. I tillegg bildebehandling forholdene varierer, så eksakte ratio verdier ervervet på en avbildning oppsettet kan ikke bli kopiert på en annen.

Disse teknikkene for forholdet bildebehandling kan tilpasses for andre Ratiometrisk indikatorer, blant annet roGFP eller GO-ATEAM isoforms og andre funksjonelle sonder. Valget av bred-felt eller konfokal mikroskopi, vil avhenge av sonden og den romlige oppløsning er nødvendig. Den vide-field-metoden ble benyttet her for mito-roGFP fordi den tillater eksitasjon ved 365 nm, noe som forbedrer følsomheten og stabiliteten av sensoren. Den confocal metoden med en spektral detektor, som brukes her for mitGO-ATEAM, gir en praktisk måte å eliminere utslipp crossover ved å justere de spektrale deteksjon vinduer. Det er imidlertid mulig å utføre lignende eksperimenter i bredt felt mikroskopi ved å bruke tilpassede filtre eller eliminere crossover beregningsmessig.

ntent "> Den vanligste problemer med denne type eksperiment avbildning er utilstrekkelig signal. Imaging maskinvare (spesielt objektivlinsen og detektor) er kritisk for å samle nok signal til å tolke dataene.

De thresholding trinn har stor innflytelse på resultatene, som inkludering av bakgrunnen piksler kan dempe eventuelle trender i forhold innhentet. Automatiske metoder er å foretrekke, men på grunn av begrenset signal, er manuell thresholding ofte den beste tilgjengelige metoden. Hvis manuelle terskler er brukt, bør de kriteriene som brukes være formulert så godt som mulig, og analysen må utføres blind eller av ulike forskere å demonstrere reproduserbarhet. Kontroll eksperimenter med antimycin (for mitGO-Ateam2) og H 2 O 2 eller DTT (for mito-roGFP) kan brukes til å bekrefte den anslåtte endringer i fluorescens forholdstall.

Mito-roGFP og mitGO-ATeam2 er ikke-invasiv, Ratiometrisk prober for overvåking mitochondrial fitness i levende gjærceller. De Ratiometrisk sensorer som brukes her ble rettet mot mitokondriene ved fusjon av mitokondrier-spesifikke signalsekvenser. Andre cellene kan bli studert med tilsetning av egnede målretting sekvensene til de opprinnelige sensorer. I tillegg er det mulig å kombinere noen av disse sensorene med komplementære fluorescerende markører (for eksempel for organeller eller signalinnretninger forhold) eller følere (for eksempel for kalsium) for samtidig å måle flere prosesser i levende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av utmerkelser fra HHMI 56006760 til JDV, National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) til DMAW, og fra Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) og NIH (GM45735, GM45735S1 og GM096445) til LP. GM45735S1 ble utstedt fra NIH under den amerikanske Recovery og reinvestering Act av 2009. Mikroskopene som brukes for disse studiene ble støttet delvis gjennom en NIH / NCI tilskuddet (5 P30 CA13696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10, (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29, (3-4), 222 (2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131, (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443, (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70, (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278, (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279, (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20, (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276, (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301, (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270, (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30, (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231, (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6, (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6, (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297, (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143, (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. 45-57 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics