Långsiktigt Potentiering av perforanta Pathway-gyrus dentatus Synapse i fritt uppför Möss

1Department of Engineering and Neuroscience Program, Trinity College
Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Transgena och knockout musmodeller av neurologiska sjukdomar är användbara för att studera rollen av gener i normala och onormala neurofysiologi. Den här artikeln beskrivs metoder som kan användas för att studera långsiktig potentiering, en cellulär mekanism som kan ligga bakom inlärning och minne, i transgena och knockout fritt beter musmodeller av neuropatologi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blaise, J. H. Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice. J. Vis. Exp. (81), e50642, doi:10.3791/50642 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studier av långsiktig förstärkning av synaptisk effekt, en aktivitetsberoende synaptisk fenomen som har egenskaper som gör den attraktiv som en potentiell cellulär mekanism underliggande lärande och informationslagring, har länge använts för att belysa fysiologi olika neuronala kretsar i hippocampus, amygdala och andra limbiska och kortikala strukturer. Med detta i åtanke, transgena musmodeller av neurologiska sjukdomar utgör användbara plattformar för att bedriva långsiktig potentiering (LTP) studier för att utveckla en större förståelse för den roll som gener i normala och onormala synaptisk kommunikation i neuronala nätverk som är inblandade i inlärning, känslor och upplysningar bearbetning. Denna artikel beskriver metoder för tillförlitligt förmå LTP i fritt bete musen. Dessa metoder kan användas i studier av transgena och knockout fritt beter musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar.

Introduction

Utvecklingen av tekniken för att manipulera gener har producerat transgena och knockout musmodeller av nästan alla neurodegenerativa och neurologiska sjukdomar. Detta har gjort det nödvändigt översättning av elektrofysiologiska forskningstekniker som tidigare använts i större gnagare till musen djurmodell. En sådan neurofysiologisk undersökningsteknik är användningen långsiktig potentiering (LTP) för att testa effekten av synapsförbindelser inom neuronala nätverk som är inblandade i olika neuropatologiska störningar. Detta protokoll beskriver tekniker för tillförlitlig elektrofysiologisk undersökning av LTP i fritt beter möss. Fördelen med detta protokoll framför andra är att det är enkelt och lätt att genomföra, det är också något mindre dyrt eftersom det inte kräver varken användningen av dyra datorstyrda Microdrive system eller fälteffekttransistor headstages och, så vitt vi vet, är den första videoprotokollet av kroniska elektrofysiologiska inspelningar to studera LTP i fritt beter möss. Därför beskriver vi i den här artikeln enkla metoder för att studera långtidspotentiering i fritt beter möss. Dessa metoder kan lätt översättas till transgena och knockout musmodeller för neuropatologiska störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll är lämpliga för möss av 3 och 18 månaders ålder och ungefärlig kroppsvikt av 30-50 g). Möss kan erhållas från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alla kirurgiska och experimentella protokoll godkändes av Trinity College Animal Care och användning kommittén och var enligt NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur.

1. Animal Förberedelser och kirurgiska ingrepp

  1. Förbered anestesi cocktail innehållande ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) och acepromazin (0,5 mg / ml). Injicera 1 ml / kg kroppsvikt i den nedre högra kvadranten av buken kompletterad med 0,2 ml / kg injektioner varje 45 min därefter för att upprätthålla en stabil anestesidjupet med pedalen tillbakadragande reflex.
  2. Förbered sövda musen för kirurgi genom att raka pälsen på sitt kranium använda en elektrisk rakapparat. Det rakade området bör innefatta mitten av ögonen till mitten av öronen. Se till att inte raka whiskers eftersom de är en del av musen fat sensoriska system.
  3. Använd bomullspinnar för att tillämpa isopropylalkohol följt av Betadine till det rakade området på huvudet. Därefter, även med hjälp av bomullspinnar, applicera en liten mängd mineralolja på ögonen för att förhindra ögonglober från torkning.
  4. Använd spädbarn råttöron manschetter istället för vanliga öron barer att montera djurets huvud på stereotaktisk ram apparaten. För att göra detta måste du först montera vänster öra på vänster öra manschetten. Sedan försiktigt lindra det högra örat på det högra manschetten genom att försiktigt stödjande djurets huvud med ena handen och föra öron manschetten med den andra handen. Nästa, placera en värmedyna under djurets kropp och sätta den till 86 ° C för att bibehålla kroppstemperaturen.
  5. Kontrollera sedan för bilaterala styvhet genom att försöka flytta huvudet från sida till sida. Djuret är ordentligt monterad på den stereotaktiska ramen, när huvudet är styv och kan inte flyttas från sida till sida men kan lätt svänga upp och ner.
  6. Vila försiktigtmusens nos på näsan / tand bar enheten att se till att framtänderna vilar försiktigt men säkert inom tandöppning av näsan / tand bar.
  7. Med en steril skalpell görs en mittlinjeincision början från mitten av ögonen till mitten av öronen. Se till skalpell hållas i 45 ° vinkel och applicera tillräckligt tryck för att skära igenom underliggande fascia men inte genom skallen eftersom det kommer att orsaka alltför stora blödningar.
  8. Använd bomullspinnar för att separera fascian och exponera skallen. Fyra Skull bregma och lambda bör synas tydligt (Figur 1A). Se till att djuret är i skallen plant läge genom att justera näsan / tand bar så att bregma och lambda-landmärken är på samma den dorsoventral ståndpunkt (DV) (+ 0,1 mm).
  9. Applicera en liten mängd steril koksaltlösning till det utsatta området och använda bomullspinnar för att försiktigt rengöra skallen. Sedan vänta 2-3 min för skallen att helt lufttorkainnan du fortsätter.
  10. Montera en nål till vänster stereotaxic armen för att mäta DV position bregma och lambda. DV positionering av dessa två landmärken bör ligga inom 0,1 mm från varandra. Om inte, kan näsan fältet i stereotaktisk ram justeras upp och ner för att uppnå detta.
  11. Placera nålen på bregma för att spela in sin anterior-posterior (AP), laterala (LAT) och dorsoventral (DV) mätningar. Se till att nålen rör bara skallen och tränger inte det.
  12. Använd en mus hjärna atlas, till exempel "The Mouse Brain i Stereotaxic Koordinater" 1, för att bestämma koordinaterna för målstrukturerna: medial perforanta vägen (MPP) i vinkel bunten och dentate gyrus (DG) i hippocampus, jämfört med lambda och bregma, respektive (se även tabell 1). Använd sedan en fin-punkt penna för att markera dessa punkter på skallen.
  13. Också, markera två fler punkter på den kontralaterala sidan av skallen. Dessa punkter which kommer att fungera som jord (GND) och referens (REF) bör vara ca 3 mm från mittlinjen och placeras i längdriktningen i förhållande till varandra (Figur 1A, även tabell 1).
  14. Ta bort nålen markören från vänster stereotaxic armen och ersätta den med en elektrisk tandläkarborr försedd med en stereotaktisk fäste. Placera borren över varje markerad punkt och göra små burr hål på ca 0,5 mm i diameter. När borrning, använd en upprepad upp-och-ner rörelse och kontrollera ofta om borren har trängt in i skallen att exponera hjärnytan.
  15. Försiktigt men bestämt driva en skruvelektrod (# 0-80 1/8 i rostfria skruvar, slitsade Lins) i var och en av de kontralaterala hål (GND och REF) så att de rör bara den kortikala ytan utan att penetrera det (Figur 1A ). Dessa två skruvelektroder fungerar som jord och referens.
  16. Mount stimulerande och registreringselektroderna i elektrode innehavare på vänster och höger stereotaktiska armar, respektive.
  17. Anslut de stimulerande elektrodklämmor till en elektrofysiologisk stimulator med nuvarande isolering och inspelningen elektroden terminal till en elektrofysiologisk differentialförstärkare (vinst = 1000, bandpassfilter = 1 Hz till 3 kHz) och sedan till ett digitalt oscilloskop för visuell inspektion av evoked potential. Dessutom, anslut GND och REF elektrodterminaler till differentialförstärkaren.
  18. Försiktigt och långsamt lägre både stimulerande och registreringselektroderna i steg om 0,5 mm medan visuellt övervaka stimulerat svar på ett stimulus chock av 600-800 uA. Fortsätt att sänka varje elektrod tills de når sina respektive mål DV position och en stereotyp signal observeras på oscilloskopet (Figur 1B).
  19. Efteråt använder dentala akryl cement för att göra en mössa för att hålla elektrodterminaler i stället, något dentalcement som berör huden ska torkas bortomedelbart. När tandcement är helt botad överföra djuret från stereotaktisk ram till en ren gnagare bur. Använd en värmelampa eller pad att behålla kärntemperatur.
  20. Övervaka djuret varje timme tills det återfår medvetandet. En injektion av flunixin kan administreras som ett analgetikum.

2. LTP Induktion

  1. Låt djuret 5-7 dagar att återhämta sig från operationen. Placera djuret i inspelningsmiljön som består av en Faradays bur (122 cm x 43 cm x 43 cm) utrustad med ljuddämpande material och en 5-kanals roterande kommutatorn ansluter elektroden leder till stimulerande / inspelningsinställningar.
  2. Låt djuret att acklimatisera sig i 1-2 timmar i inspelningsmiljön innan du ansluter elektroderna till stimulerande och registreringsinstrument (se steg 1,17).
  3. Ställ in stimulatorn kontrollerna till utgång 400 uA och spela in amplituden på i genomsnitt 10 evoked potential att se till thpå minst 10 sekunder förflyta mellan stimuli. Använd den metod som visas i figur 1C för att kvantifiera den framkallade svaret. Upprepa proceduren för 600, 800, 1.000, 1.200 och 1.400 uA.
  4. Konstruera ett ingångs / utgångskurvan med de genomsnittliga amplituden för det stimulerade svaret kontra stimulus intensitet. Från denna kurva bestämma stimulusintensitet vilket motsvarar 50% av den maximala amplituden mäts. Använd 50% intensitet under återstoden av experimentet.
  5. Därefter genom att använda 50% stimulusintensitet, erhålla en baslinje genom att spela in den genomsnittliga amplituden för 5 evoked potential varje minut under 15 min. Återigen se till att åtminstone 10 sekunder förflyta mellan stimuli.
  6. Därefter leverera tetanic stimulering bestående av 10 skurar av 10 pulser som levereras vid 400 Hz med en burst hastighet av 5 Hz till den mediala perforanta vägen. Övervaka djuret noga för tecken på anfall, inklusive våt hund skakar. Om djuret har ett anfall på experiment bör avslutas och alla data från detta djur bör undantas från studieresultaten.
  7. Därefter fortsätta att registrera den genomsnittliga amplituden för 5 evoked potential varje minut under 30 min posttetanization. Efter det, jämföra denna amplitud till baslinjen amplitud som erhållits i steg 2,5 genom att beräkna den procentuella förändringen från baseline (Figur 2).
  8. Efter avslutningen av experiment, är djuret avlivas genom inhalation av isofluran-en metod som är förenlig med riktlinjerna för eutanasi av American Veterinary Medical Association.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabell 1 visar koordinaterna för GD och MPP som används i detta protokoll Figur 1A visar markeringarna för målstrukturer på skallen,.. Också visat är placeringen av mark-och referenselektroder Figur 1B illustrerar representativa kallat svar spårar både pre- och posttetanization i samma djur. Observera att posttetanization framkallade svaret är större än den pretetanization respons som är indikativ för LTP-induktion 2. Figur 1C illustrerar metoden som används för att kvantifiera responsen amplitud. Indeed, Figur 2 visar procentuell förändring i respons amplitud över ett tidsförlopp som sträcker sig över både pre-och posttetanization tidsperioder. Det skall noteras att topp LTP värden översteg 100%. Dessa resultat av förbättrad respons amplitud efter tetanization tyder på att detta protokoll är framgångsrik och därför tillförlitlig för att studera LTPi fritt beter musmodell.

Tabell 1
Tabell 1. Koordinater för målstrukturer. Anterior-posterior (AP) koordinater för gyrus gyrus (GD) och REF ges i förhållande till bregma medan de för medial perforanta väg (MPP) och GND är relativt Lambda. Alla DV-koordinaterna är i förhållande till den kortikala ytan nedanför dura.

Figur
Figur 1. Elektrod plats och representativa spår av den framkallat svar. A) Schematisk illustration av den relativa placeringen av elektroder på musen skull. B) Typiska spår av det framkallade svaret både pre-och posttetanization. C) algoritm för att kvantifiera amplituden för det stimulerade svaret.

Figur 2
Figur 2. LTP i den mediala perforanta väg-gyrus dentatus synaps. Representativa resultat av LTP induktion i MPP-GD synaps i ett fritt bete mus. Observera posttetanic stimulering förbättring av framkallade svaret amplituden tyder på LTP induktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll har vi visat en tillförlitlig och enkel metod för att studera LTP i GD i fritt beter möss. Medan många studier av LTP i vakna råttor har utförts 3,4, har mycket få genomförts i vakna möss främst på grund av den tekniska komplexiteten utgörs av den begränsade cranial fastigheter i möss och vikten av elektrod headstages i förhållande till den genomsnittliga vikten för möss 5. De få studier som har visat LTP i GD i fritt beter möss används antingen Microdrive elektrodsystem eller skiktfälteffekttransistor (JFET) förförstärkare integrerade i huvudsteg som nödvändigtvis bidrar till elektrodnyttolast bördan till djuret 6-10. Betydelsen av det nuvarande protokollet är att det innebär en förbättring jämfört med befintliga metoder för att framkalla LTP i GD i fritt beter möss eftersom det undviker användning av Microdrive elektrodsystem eller ett huvudsteg JFET-talet.

Det är viktigttigt att lyfta fram de kritiska stegen i detta protokoll. Dessa inkluderar: 1) montering av musens huvud i stereotaktisk ram så att det är bilateralt stel (detta steg kan vara den svåraste eftersom det kräver övning och förtrogenhet med den teknik), 2) optimal placering av elektroder för att maximera svars magnitud kan ökas genom att tillförsäkra att bregma och lambda är i samma plan som vanligen kan uppnås genom justering av stereotaktisk ram tand bar så att skillnaden i dorsoventral positionering av bregma och lambda inte är större än 0,1 mm, 3) under inspelningsfasen för experimentet, rekommenderas att djur ska få tid att vänja till inspelningsmiljön, eftersom det nya i inspelningsmiljön kan insinuera fluktuationer i det stimulerade svaret data som samlas in, 4) lämpliga val av elektroder förbättrar signalkvaliteten och trohet: bipolära elektroder ( rostfritt stål injektions slang med 0,2 mm rostfritt ståltrådinsats med en spets separation av 0,5 mm) föredras för stimulering medan monopolära elektroder (epoxylite isolerad enkelsträngad volfram tråd) används för inspelning i nervvävnad, och 5) möss kan bedövas med användning av en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) och acepromazin (0,5 mg / ml). Denna anestetisk blandning bör därefter administreras vid en dosering av 1ml/kg som vanligtvis är effektiv i ca 20 min kompletterat med 0,2 ml / kg var 45 min för att upprätthålla en stabil anestesidjupet.

Det finns några begränsningar i detta protokoll som bär nämna. Detta protokoll ger ingen insikt om jonkanal mekanismer eller receptorproteinsyntes som kan subserve LTP. Därför knapphändig information finns tillgänglig om det faktiska antalet nervceller i befolkningen som spelas in. En annan begränsning är att eftersom evoked potential håller på att samlas i vakna djur är det svårt att ascertain och dissekera ut effekten av faktorer som stress, hantering, eller kontaminering av den inspelade signalen genom falska sensomotoriska aktivitet. Dessa begränsningar kan övervinnas genom att säkerställa att framkallat svar registreras endast när djuret är inaktivt men alert tillstånd, annars känd som den tysta vakna vaksamhet tillstånd.

Icke desto mindre, de metoder som beskrivs i detta protokoll ger den mest fysiologiskt relevant plattform för att undersöka hjärnans elektriska aktivitet underliggande beteende. Efter de åtgärder som beskrivs i detta protokoll, kan någon hjärnans struktur riktas med hjälp av de rätta koordinaterna som ges av en atlas av musen hjärnan 1. Det är viktigt att notera att den vuxna råttan stereotaktisk ram kan användas i möss, under förutsättning att lämplig spädbarn råtta öron manschetter används i stället för de vanliga öron barer. Öron manschetter kommer att immobilisera huvudet utan att skada mus öron. Slutligen kan de metoder som presenteras här vara readily översatt till elektrofysiologiska undersökningar i transgena och modeller knockout mus av en rad neurologiska sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill bekräfta följande: Dr Joseph Bronzino, Dr Khamis Abu-Hassaballah, Mr RJ Austin-LaFrance, och Ms Jessica Koranda.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (100 mg/ml) Henry Schein 10177
Xylazine (20 mg/ml) Henry Schein 33197
Acepromazine (10 mg/ml) Henry Schein 2177
Dental acrylic powder Lang Dental Manufacturing Co. 1330CLR
Dental acrylic liquid Lang Dental Manufacturing Co. 1306CLR
Tungsten wire (0.127 mm) World Precision Instruments TGW0515
Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) World Precision Instruments 832400
Flunixin (50 mg/ml) Henry Schein 14165
Epoxilyte Superior Essex EP 6001-M
Stainless steel wire insert (0.2 mm) World Precision Instruments 792900
Stereotaxic frame apparatus Kopf Instruments Model 902
Ear cuffs (ear cups) Kopf Instruments Model 921
Electrophysiological stimulator Astro-Med, Inc. S88
Digital oscilloscope B K Precision Corp. 2542
Current isolation unit Astro-Med, Inc. PSIU-6
Differential amplifier World Precision Instruments, Inc. DAM-50
Commutator Plastics One SLC6
Dental drill Stoelting 58650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
  2. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
  3. Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
  4. Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
  5. Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
  6. Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
  7. Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
  8. Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
  9. Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
  10. Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics