Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Neuroscience

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Summary

Die Aktivität der einzelnen Neuronen aus erwachsenen Alters Mäusen kann durch distanziert Neuronen aus bestimmten Hirnregionen und unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff Membranpotential Bildgebung untersucht werden. Durch Prüfung Antworten auf Veränderungen in Glucose, kann diese Technik verwendet, um die Glucoseempfindlichkeit von Erwachsenen ventromedialen Hypothalamus-Neuronen zu untersuchen.

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Vazirani, R. P., Fioramonti, X., Routh, V. H. Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing. J. Vis. Exp. (81), e50861, doi:10.3791/50861 (2013).

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Abstract

Studium der neuronalen Aktivität werden oft unter Verwendung von Neuronen aus Nager weniger als 2 Monaten aufgrund der technischen Schwierigkeiten mit zunehmender Bindegewebe verbunden und verringerte neuronale Lebensfähigkeit, die mit dem Alter auftreten. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Dissoziation von gesunden Neuronen des Hypothalamus von Erwachsenen-Alter von Mäusen. Die Fähigkeit, Neuronen aus adulten Mäusen untersucht Alters erlaubt den Einsatz von Krankheitsmodellen, die in einem höheren Alter manifestieren und könnte für bestimmte Studien mehr entwicklungs genau sein. Fluoreszenz-Imaging von dissoziierten Neuronen verwendet werden, um die Aktivität einer Population von Neuronen zu untersuchen, im Gegensatz zur Verwendung der Elektrophysiologie an einem einzigen Neuron zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung eines heterogenen neuronalen Population in dem die gewünschte neuronale Aktivität ist selten wie Glucose Sensor-Neuronen des Hypothalamus. Wir verwendeten Membranpotential Farbstoff Bildgebung des ventromedialen Hypothalamus erwachsenen Neuronen, um ihre Reaktionen zu studieren changes in der extrazellulären Glucose. Glucose Sensing-Neuronen werden geglaubt, um eine Rolle in der zentralen Regulierung der Energiebilanz spielen. Die Fähigkeit, Glukose-Mess bei erwachsenen Nagetieren zu studieren, ist besonders nützlich, da die Dominanz von Krankheiten, die dysfunktionalen Energiebilanz (zB. Adipositas) nehmen mit dem Alter zusammen.

Introduction

Das Gehirn reguliert Energie-Homöostase durch die neuroendokrinen und autonomen Nervensystem. Ventromedialen Hypothalamus (VMH), des ventromedialen Nukleus (VMN) und dem bogenförmigen Kern (ARC) umfassen, ist für die zentrale Überwachung der Energie Homöostase. Specialized Glukosemess Neuronen im VMH, link neuronale Aktivität und peripheren Glukose-Homöostase ein. Es gibt zwei Arten von Glucose Sensor-Neuronen, Glucose angeregt (GE) Neuronen zu erhöhen, während Glukose gehemmt (GI) Neuronen ihre Aktivität verringern, wie extrazelluläre Glukose steigt. VMH Glucose Sensor-Neuronen sind in der Regel mit Hilfe der Elektrophysiologie oder Calcium / Membranpotential empfindlichen Farbstoff-Bildgebung untersucht.

Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik gilt als der Goldstandard in der Studie der ex vivo neuronalen Aktivität sein. Bei dieser Technik wird eine Glas-Mikropipette Elektrode an die Zellmembran über einen hohen Widerstand angeschlossen(GOhm) Siegel. Patch-Clamp-Elektroden ermöglichen Echtzeit-Aufzeichnung von Aktionspotentialfrequenz (Stromzange) oder Ionenleitfähigkeit (Spannungsklemme) innerhalb eines einzelnen Neurons verändert. Während der Patch-Clamp-Technik liefert detaillierte Informationen über Änderungen in bestimmten Ionenkanalleitfähigkeiten, ist ein großer Nachteil, dass nur ein Neuron in einer Zeit beobachtet. Es dauert ca. 30-45 min von Aufnahme zu beginnen, bevor auch nur eine bestimmte experimentelle Behandlung zu überprüfen, ob man die Aufnahme aus einer Glucose-Mess Neurons. Außerdem umfassen GI und GE Neuronen <20% der Gesamt VMH neuronalen Population. Compounding dieses Problem ist der Mangel, in vielen Fällen eine Identifizierung zellulärer Marker für diese Neuronen. So ist es klar, dass trotz wertvolle elektrische Informationen, die andere Techniken nicht, ist Patch-Clamp-Analyse mühsam, zeitaufwendig und geringe Ausbeute.

Die Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebungs dissoziierter VMH Neuronen ermöglicht die Untersuchung von hundreds von Neuronen gleichzeitig. Calcium-sensitiven Farbstoffen verwendet werden, um intrazellulären Calcium-Änderungen, die indirekt auf Veränderungen der neuronalen Aktivität korrelieren zu messen. Membranpotential empfindliche Farbstoffe verwendet werden, um Membranpotential Änderungen zu überwachen. Mess zellulären Membranpotentials ist ein direkter Index der neuronalen Aktivität im Vergleich zu Veränderungen der intrazellulären Kalziumspiegel. Außerdem Membranpotential-Farbstoff (MPD)-Bildgebung erfasst potenziell kleinere Änderungen des Membranpotentials, wo Aktionspotential Brenn nicht verändert wird und intrazellulären Kalziumspiegel nicht ändern könnten. Diese beiden Fluoreszenz-Bildgebungstechniken verwendet worden, um VMH Glucose erfassenden Neuronen von jungen Mäusen 2-7 studieren. Während die Ergebnisse sind weniger detailliert als die mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie erhalten, ist die Stärke des bildgebenden Experimenten, dass sie bewerten, gleichzeitig eine große Population von Zellen, die auf jeden Fall auch eine beträchtliche Anzahl von Glukosemess Neuronen. MPD Bild iist besonders nützlich für die Untersuchung GI Neuronen, die gleichmäßiger über den gesamten VMH lokalisiert sind, wodurch eine ausreichende Population in der dissoziierten VMH (~ 15% GI) zu studieren. Im Gegensatz dazu, während GE Neuronen sind dicht an den ventrolateralen VMN-und Zell armen Bereich zwischen der ARC und VMN lokalisiert, sie stellen keine signifikante Anzahl von Neuronen innerhalb des VMH (<1% GE). Darüber hinaus wird durch das Studium isoliert Neuronen, Astrozyten und präsynaptischen Effekte eliminiert werden. Dies kann ein Vorteil bei der Untersuchung ersten Neuron-Effekte, als auch ein Nachteil sein, da physiologischen Verbindungen und Prozesse verloren gehen.

Ein limitierender Faktor sowohl Patch-Clamp-Elektrophysiologie und MPD / Calcium-Farbstoff-Bildgebung ist die Notwendigkeit, jüngere Tiere (zB. Mäuse oder Ratten <8 Wochen alt) zu verwenden. Dies ist vor allem aufgrund der erhöhten Bindegewebe in Kombination mit einer verminderten neuronalen Lebensfähigkeit, die mit zunehmendem Alter auftritt. Im Gehirn-Slice-Elektrophysiologie Gestütn stellt erhöhte Bindegewebe es schwieriger, die Neuronen zu visualisieren. Vermehrter Bindegewebs macht es auch schwieriger, eine große Anzahl von gesunden Neuronen für Bildgebungsuntersuchungen dissoziieren. Außerdem Neuronen von jüngeren Tieren länger überleben entweder während der Aufnahme oder Patch-Clamp-Bildgebung. Jedoch kann die Verwendung von jungen Mäusen eine große Einschränkung sein. Neuronale Aktivität und / oder Antworten auf Neurotransmitter oder zirkulierenden Nährstoffen mit dem Alter verändern. Da beispielsweise die Energiebilanz ist eng mit reproduktiven Status gebunden, die Neuronen des Hypothalamus Regelenergiebilanz unterschiedlich in der Vor-vs postpubescent Tiere reagieren. Darüber hinaus haben viele Krankheiten erfordern eine langfristige Behandlung oder nicht erst im Erwachsenenalter manifestieren. Herausragende Beispiele für solche Erkrankungen sind Nahrungs Adipositas oder Typ-2-Diabetes mellitus. Da Glukose-Mess Neuronen werden vermutlich eine Rolle bei diesen Erkrankungen spielen wir eine Methode entwickelt, für die erfolgreiche Kultivierung von gesunden Erwachsenen VMH Neuronen für den Einsatz in Bild MPD experiments.

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Protocol

1. Tiere

  1. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität für Medizin und Zahnmedizin von New Jersey zugelassen.
  2. Gruppenhaus männlichen C57BL / 6 Mäuse auf einem 12-Stunden-Licht/12 hr dunklen Zeitplan und damit freien Zugang zu Wasser und Nahrung. Sacrifice bei 4-5 Monaten. Euthanasie der Mäuse wurde unter Verwendung der Operationsebene Anästhesie und eine sekundäre Form der Euthanasie (dh dringende Einschnitt in den Brustraum durch die Membran). Dies steht im Einklang mit den Richtlinien AVMA zur Euthanasie.

2. Vorbereitung der Perfusionslösung, Deckgläser, Glaspipetten und Medien

  1. Machen 1L Perfusionslösung aus 2,5 mM KCl, 7 mM MgCl 2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO 3, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM Glucose, 1 mM Ascorbat, und 3 mM Pyruvat in destilliertem dH 2 O. Stellen Sie die Osmolarität auf ~ 300 mOsm Verwendung von etwa 80 g / l Saccharose. Oxygenat unter Durchblasen mit 95% O 2/5% CO 2 und der pH-Wert auf 7,4. Jedes Experiment wird in etwa 200 ml Perfusionslösung erforderlich. Aliquots bei -20 ° C für bis zu 2 Monate gelagert werden.
  2. Stellen Sie 250 ml Neurobasal Lager enthält Neurobasal Medien ohne Glucose, 2,5 mM Glucose und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. Stellen Sie die Osmolarität der Neurobasal Lager bis 280 mOsm mit Saccharose. Stellen Sie 500 ml enthält Hibernate Hibernate Lager-A-Medium ohne Glucose, 2,5 mM Glucose und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
  3. Rühren Sie beide Aktien gut und Filter sterilisieren mit Stericup Vakuumfiltereinheiten. Seien Sie vorsichtig, nicht zu Glucose oder anderen Verunreinigungen durch die Glaswaren oder Rührstäbe einzuführen. Wickeln die Flaschen in Folie, die Medien vor Licht zu schützen und bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
  4. Flamme die Spitzen der vier autoklaviert Glaspipetten (9), so dass die Spitzen nicht longer scharf und der Öffnungsdurchmesser sind groß (~ 0,9 mm), mittelgroße (~ 0,7 mm), mittel (~ 0,5 mm) und kleine (~ 0,3 mm). Der größte ist kaum poliert werden und die kleinste sollte ungefähr ein Drittel dieses Durchmessers sein.
  5. Am Tag vor der Ernte Neuronen, sauber vier 25 mm Deckgläschen mit 70% Ethanol und das über eine Bunsenbrenner-Flamme. Legen Sie jedes Deckglas in einem sterilen 35 mm Kulturschale und 2 ml steriler 1% Poly-D-Lysin in dH 2 O. Legen Sie die Speisen in einem Brutschrank (37 ° C) über Nacht. Am nächsten Tag, mit sterilem dH 2 O 3x und ermöglichen Deck vollständig trocken.
  6. Machen Sie 75 ul Aliquots von 1 M Milchsäure und 200 ul Aliquots von Glutamax, bei -20 ° C Vollständig aufzutauen Aliquots von Milchsäure und Glutamax vor der Verwendung bis zur Homogenität zu gewährleisten.
  7. Am Tag der Ernte Neuronen, machen 30 ml frischem Kulturmedium, bestehend aus Hibernate-A Lager 1 mM Milchsäure, 0,5 mM Glutamax und 2% B27 ohne Insulin. VoRTEX und pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH.
  8. Setzen Sie 10 ml Kulturmedium in einer 60 mm Glaspetrischale auf Eis gelegt 2 ml in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis und die restlichen Medien halten bei Raumtemperatur.
  9. Am Tag der Ernte Neuronen, machen 25 ml frisches Wachstumsmedium, bestehend aus Neurobasal Lager, die 1 mM Milchsäure, 0,5 mM Glutamax und 2% B27 ohne Insulin. Wirbel-und pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. Den frischem Wachstumsmedium in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für mindestens 30 min äquilibrieren.

3. Herz Perfusion

  1. Vollständig aufzutauen 200 ml Perfusionslösung und Oxygenat mit 95% O 2/5% CO 2 auf Eis für mindestens 15 min.
  2. Waschen ein Vibratom Klinge mit Aceton, 70% Ethanol und dH 2 O. Positionieren Sie die Klinge in der Vibratom.
  3. Die Vibratom Kühlkammer und Infusionsschlauch mit dH 2 O spülen Füllen Sie den Kühlraum (4 ° C) Mit Perfusionslösung und weiterhin Sauerstoff zu versorgen.
  4. Betäuben eine Maus mit Pentobarbital-Natrium 50 mg / ml, verdünnt 1:1 mit sterilem Wasser, intraperitoneal injiziert. Überprüfen Sie, ob die Maus vollständig durch Einklemmen des Schwanzes und die Beobachtung keine Antwort betäubt.
  5. Gießen Sie kaltes Perfusionslösung in die Perfusion Reservoir-und Schlauch kurz vor Dissektion. Sparen Sie 20 bis 30 ml für Gehirn Dissektion und weiterhin auf Eis Sauerstoff zu versorgen. Schwerkraft von einem erhöhten 60-ml-Spritze durch den Schlauch und eine 20 G-Nadel bietet ausreichende Strömung. Anschließend Lösung laufen, bis keine Luftblasen heraus gewaschen. Fahren Sie mit Sauerstoff zu versorgen.
  6. Schnitt zurück Haut über dem Brustkorb der Maus. Heben Sie den Brustkorb und sorgfältig machen einen horizontalen Schnitt durch die Membran. Machen Sie zwei seitliche Schnitte durch den Brustkorb bis zu den Armen, um das Herz freizulegen. Verwenden einer Pinzette, um den Brustkorb zurückzuhalten.
  7. Machen Sie eine kleine 2 mm Schnitt in den rechten Vorhof, eine Austrittspunkt für Blut aus der Vascu gewaschen werden kannSolaranlage.
  8. Die Punktion des linken Ventrikels mit der Perfusion Nadel, gerade genug, um die Nadelöffnung einfügen. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle mit einer Hand und beginnen den Fluss der Perfusionslösung mit der anderen Hand. Nach 10-15 ml Perfusionslösung, sollte das Blut ausgewaschen und das Abwasser wird klar sein.

4. Gehirn-Slicing und Dissection

  1. Nach der Herzdurchblutung, die Übertragung mit Sauerstoff angereichert kalten Perfusion Lösung in eine Petrischale auf Eis kurz vor der Verwendung.
  2. Schnell enthaupten, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen das Gehirn in Perfusionslösung. Um das Gehirn zu entfernen: Ziehen Sie die Haut vor, einen Schnitt in der Mittellinie in Richtung Schädel der Augenhöhlen, machen zwei seitliche Schnitte zu jedem Auge, verwenden Sie Pinzette, um jede Seite des Schädels zurück zu ziehen, machen Sie einen koronalen Schnitt zwischen den Augenhöhlen, und verwenden Sie einen Spachtel, um sanft zu locken hinaus in das Gehirn Perfusionslösung. Mit einer Schere bei Bedarf die optischen Bahnen geschnitten. Tun Sie das nicht zu berühren Hypothalamic Bereich und nicht die optischen Bahnen ziehen, da dies macht zu viel Druck auf der Eminentia mediana und der zugrunde liegenden Hypothalamus Gewebe.
  3. Verwenden Sie eine Rasierklinge und Nadel seitlich schneiden das Hirngewebe ca. 3 mm hinteren und vorderen an den Hypothalamus, während das Gewebe eingetaucht ist (Bregma -3,52 mm). Es ist besonders wichtig für die vorderen Seiten Schnitt auf Ebene sein, so dass das Gehirn gerade auf dem Vibratom Futter zu sitzen.
  4. Entfernen Sie die restlichen Hirngewebe aus der Lösung und verwenden Filterpapier aus dem Gehirn montiert Abschnitt Docht entfernt Lösung.
  5. Setzen Sie einen Klecks Sekundenkleber auf einem Vibratom Spannfutter und verteilt den Kleber auf die Größe des Gehirns. Setzen das Hirngewebe über der Klebe mit der vorderen Seite nach unten und der Hypothalamus vor der Klinge. Wick entfernt überschüssigen Kleber und legen Sie das Futter in die Vibratom Kühlkammer. Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Kleber zu verlassen, wie es sprudeln rund um das Gehirn, wenn sie in Lösung gebracht.
  6. Mit der Vibratome zu einer langsamen Geschwindigkeit (Stufe 2) und hoher Amplitude (Stufe 9) eingestellt ist, machen 300-500 um Scheiben bis zum Erreichen der Hypothalamus-Bereich. Jetzt machen dünne Scheiben schneiden 100 um vom hinteren zum vorderen. Die visuelle Signale sind wie folgt. Hinter dem Hypothalamus der dritte Ventrikel wird sehr klein sein (Bregma -2,70 bis -2,30 mm). Bei Bregma -2.30 mm, wird der dritte Ventrikel in Rücken-und Bauchschnitte am koronalen Scheibe getrennt.
  7. Sobald Abschnitte des dritten Ventrikels Sicherung, machen zwei Scheiben, die 500 um die richtige Region des VMH (Bregma -2,18 bis -1,22 mm) enthalten wird. Anterior des VMH, das dritte Ventrikel nicht mehr reicht bis zur ventralen Boden des Gehirns (Bregma -1.06 bis -0.82) 8.
  8. Übertragen Sie diese Scheiben auf die Petrischale auf Eis haltigen Kulturmedien. Sezieren die VMH (VMN + ARC), wie in Fig. 1 gezeigt. Mit einer Pipette vorsichtig übertragen Sie die VMH Stücke in 2 ml Kulturmedium auf Eis.

5. Dissoziation und Kultur

  1. Entfernen Sie die VMH aus Eis und legen bei Raumtemperatur. Mit 20 U / ml Papain zu 4 ml Kulturmedium. Kehren Sie in einem 34 ° C Wasserbad mischen und Ort. Prüfen und mischen durch Umdrehen jede Minute, bis die Verdauung Medien ist nicht mehr trüb. Filter (0,22 um) in eine sterile Flasche und das Gewebe zu übertragen, um die Verdauung Medien.
  2. Verdauen das Gewebe durch Schütteln mit 100 Upm bei 34 ° C für 30 min.
  3. Herstellung von 1 ml Medium mit 8% Rinderserumalbumin (BSA) bei der Verdauung. Man löst 80 mg BSA in 1 ml Kulturmedien und Filter (0,22 &mgr; m) in einem konischen Röhrchen.
  4. Durch Übertragung von 5 ml Kulturmedium in einem konischen Röhrchen und langsam umdrehen, wenn das Gewebe zu waschen.
  5. In 30 ul Enzym DNase bis 6 ml Kulturmedien und mischen, um Verreiben Medien zu machen. Saugen Sie die Waschmedien und 3 ml Verreiben Medien.
  6. Verwenden Sie die Glaspipetten in der Größenordnung von l verreibenargest zum kleinsten. Sanft verreiben und dann warten, 10x 4 min für größere Stücke zu begleichen. Verwenden Sie die zweite Pipette, um die Top 2 ml, die eine dissoziierte Zellsuspension auf eine neue konische Röhrchen übertragen. 2 ml Verreiben Medien, verreiben 10x und 3 min warten. Verwenden Sie die dritte Pipette, um die Top 2 ml der Zellsuspension übertragen. 1 ml der Verreiben Medien, verreiben und warten 5x 2 min. Verwenden Sie die Pipette, um die vierte Top 2 ml der Zellsuspension übertragen.
  7. Schicht die dissoziierten Zellsuspension auf der 8% BSA, man aufpassen, nicht zu verwechseln. Zentrifugieren bei 1000 rpm für 5 min.
  8. Platzieren autoklaviert 6 mm x 8 mm Klonen Zylinder in der Mitte jedes Deckglas. Die Deckgläser müssen vollständig trocken sein. Verwerfen und das Pellet in 440 ul warmen Wachstumsmedien. Füllen Sie das Klonen Zylinder mit der neuronalen Suspension und in den Brutschrank für 20 min.
  9. Entfernen Sie die Klonierung Zylinder und sehr vorsichtig waschen weg Schmutz. Füllen Sie jedes Gericht with 2 ml Wachstumsmedium. Sodass die Zellen mindestens 1 Stunde zu erholen, bevor irgendwelche Tests werden durchgeführt.

6. Vorbereitung für MPD Imaging

  1. Machen Aufzeichnungslösung, bestehend aus 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 0,1 mM MgCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 0,97 mM K 2 HPO 4, 0,23 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3 und 25 mM HEPES. Den pH-Wert auf 7,4.
  2. In Glucose, um die gewünschte niedrige Glukose-Testlösung (0,1-2,0 mM Glukose) zu machen. Gründlich mischen und behalten 400 ml niedrige Glukose-Recording-Lösung. In Glukose zu den restlichen 600 ml bis 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung machen und gründlich mischen.
  3. Schützen Farbstoff aus Licht so viel wie möglich. 4 ml Puffer Raumtemperatur auf eine Blue MPD Fläschchen. Gründlich mischen und mit 5 ul Farbstoff pro ml Aufzeichnungslösung. Halten homogene Lösung durch Mischen mit Pipette zwischen den Lösungen. Der Farbstoff enthält fluoreszierende molecules, die Zellen mit Depolarisation eingeben und Quencher-Moleküle, welche die Zellmembran nicht durchqueren können. Aliquote können bei -20 ° C gelagert und innerhalb von 4 Tagen verwendet werden. Frost-Tau nicht mehr als einmal.
  4. Inkubieren Zellen in 2 ml 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung plus Farbstoff bei 34 ° C für 30 min. Ein trockener Heizungsblock verwendet werden kann. Vor Licht schützen.
  5. Bereiten Spritzenpumpen und Durchblutungssystem mit 2,5 mM und 0,1 mM Aufzeichnungslösungen sowie Farbstoff. Schlauch von 60 ml Spritzen sollte mit einem Verteiler verbunden sein.
  6. Nach Beendigung einer Pumpe, warten ~ 10 Sekunden vor Switching-Lösungen auf dem Verteiler zu Druckaufbau in der Spritze zu verhindern. Druckänderungen verändern Flüssigkeitszufuhr zu der geschlossenen Kammer, die die Neuronen, was zu Veränderungen in der Fokusmikroskop während des Experiments und Verzerrung der Bilder.
  7. Der Verteiler Ausgangsleitungen sollten auf eine In-line-Heizelement und Polyethylenschlauch, der in eine geschlossene Kammer verbindet, verbunden sein. Bubbles sollte gelöscht werden und die Durchblutung Rate sollte auf 0,5 ml / min eingestellt werden. Vor Licht schützen.
  8. Übertragen Sie 25 mm Deckglas mit anhaftender Neuronen in die geschlossene Kammer, man aufpassen, nicht zu erlauben, Deckglas zu trocknen und keine Luftblasen einzuführen. Der Schlupf wird in den Rillen der Bodenstück ausgerichtet ist, ein paar Tropfen des Aufzeichnungslösung an den Seiten platziert, und das Oberteil wird sanft ausgestattet, um das Deckglas in Position zu halten.
  9. Verwenden Sie eine Pipette, um die Kammer mit Aufzeichnungslösung zu füllen und dann ein 18 mm Deckglas auf. Passen Sie vorsichtig weißen Ring in die Kammer, um den kleineren Deckglas in Position zu halten. Drücken sehr langsam und leicht zu Luftblasen in die geschlossene Kammer eingeleitet wird.
  10. Starten Sie die Spritzenpumpe für die 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung, drücken Sie auf den weißen Ring, und eine Verbindung zu der geschlossenen Kammer. Langsam loslassen Druck von weißen Ring und eine Verbindung zum Schlauch führt zu einem Abfallbehälter.
e "> 7. MPD Imaging

  1. Zentrieren Sie die Neuronen mit niedrigen Hellfeld-Licht. Versuchen Sie, die Zeit, die Zellen, die dem Licht ausgesetzt zu minimieren.
  2. Damit das Perfusionssystem für 10 min durchgeführt, um zur Stabilisierung der Temperatur, Scharfstellung und Farbstoff Gleichgewicht.
  3. Während Grundierung, öffnen Sie das Programm MetaMorph und nehmen eine Hellfeld-Bild (10X) der Neuronen. Verwenden Sie die Auto-Fokus-Funktion zu 3 Stapel von Fluoreszenzbildern (150 ms, Enge Cy3-Filter, 10X) zu nehmen und festzustellen, den Fokus innerhalb 5 um. Am Ende der 10 Minuten Vorbereitungszeit, überprüfen Sie den Fokus noch einmal.
  4. Fangen Sie an, Fluoreszenzbilder für 40 Minuten alle 30 Sekunden aufzeichnen. Stellen Sie die Basislinie bei 2,5 mM Glukose für 10 min, dann verringern Glukose für 15 min und schließlich auf 2,5 mM Glucose für 15 min zurück. Lösungen werden durch Stoppen einer Spritzenpumpe, wartet 10 Sekunden, Drehen eines Anschlusses auf dem Verteiler, und man eine andere Spritzenpumpe verändert. Änderungen sollten vor der gewünschten Zeitpunkten auftreten baSed von der Verzögerung zwischen dem Verteiler und Zellen.
  5. Nach der Aufnahme aller Fluoreszenzbilder, nehmen Sie einen hellen Feldbild der Neuronen.

8. MPD Imaging Analysis

  1. Verwenden MetaMorph bis ovale Regionen um jede Zelle in der Hellfeld-Bild am Ende des Experiments genommen erstellen. Die Regionen sollten etwas größer als jedes Neuron sein und kann aus 1 Pixel außerhalb des dunklen Rand der Zelle werden. Wählen Sie keine Zellen, die ungesund, überlappend oder in der Nähe Trümmer sind. Ungesunde Zellen erscheinen oft dunkel. Schließlich erstellen 5 großen, ovalen Regionen in Bereichen ohne Zellen oder Fremdkörper für die Hintergrundmessungen.
  2. Übertragen Sie die Regionen für alle Fluoreszenzbilder und überprüfen, um zu überprüfen, dass keine Bewegung / Verschiebung stattgefunden hat. Verwenden Sie die Funktion Messen, um die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Region für alle Bilder in einer Excel-Datei aufzeichnen. Die Verwendung von Zeitschriften in Metamorph wird empfohlen.
  3. Erstellen Sie in Excel einen Durchschnitt der 5 Hintergrundbereiche für jede fluoreszierent Bild. Dies stellt den mittleren Hintergrundwert zu jedem Zeitpunkt. Für jedes Bild / Zeitpunkt, subtrahieren Sie den Hintergrund aus allen Region Messungen. Der Hintergrund-Fluoreszenzintensität subtrahiert wird als Intensität im Folgenden bezeichnet werden.
  4. Für jede Zelle, die Berechnung der durchschnittlichen Intensität während 2-8 Minuten der Aufnahme. Dies entspricht der Grundlinie der Zelle in 2,5 mM Glucose. A 2 Minuten Puffer an beiden Enden jeder Behandlung wird verwendet, um das Rauschen zu minimieren.
  5. Für jede Zelle, die Berechnung der prozentualen Veränderung vom Ausgangswert (Baseline-Intensity) / Baseline
  6. Erstellen Sie ein Liniendiagramm mit der prozentualen Veränderung vom Ausgangswert gegenüber der Zeit.
  7. Berechnen Sie die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangswert bei 18 bis 23 Minuten. Berechnen Sie die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangswert bei 35 bis 40 Minuten. Während der Bildverarbeitung verwendet wird, wird das Rauschen durch die Mittelung der Intensität innerhalb jeder Zellenbereich, Hintergrund-Subtraktion, und der Mittelung der Intensitätsbereich über 5 min o reduziertr mehr.
  8. Kontrollexperimente, in dem 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung mit 2,5 mM Glucose Aufzeichnungslösung ausgetauscht durchzuführen, um den Rauschen-Schwellenwert zu bestimmen. Berechnen Sie die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangswert bei 18 bis 23 Minuten für mindestens 6 Gerichte und drei Mäusen. Bestimmen Sie den Mittelwert und Standardabweichung dieser Werte.
  9. Die Schwelle für eine positive Antwort auf die Depolarisation Mittelwert plus 2 Standardabweichungen. Der Mittelwert plus 2 Standardabweichungen entspricht einer Differenz bei p <0,05. Unsere Kontrollversuche ergaben eine 10% Veränderung zum Ausgangswert als den geeigneten Schwellenwert.
  10. Für jede Zelle, beurteilen die reversible Reaktion Depolarisation basierend auf 2 Kriterien. Erstens muss die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangs während 18-23 Minuten mehr als 10%, das in dem vorhergehenden Schritt bestimmten Schwelle liegen. Zweitens muss die durchschnittliche prozentuale Veränderung vom Ausgangs während 35-40 Minuten weniger als die Hälfte der durchschnittlichen prozentualen Änderung von seinBaseline während 18-23 Minuten. Das zweite Kriterium wurde gewählt, weil es wurde festgestellt zu sein, die strenger sind als die Stimulation mit Glutamat oder KCl. Ungesunde Neuronen oft auf die Stimulation mit Glutamat oder KCl reagieren, obwohl ihre Antworten zu einer verminderten Glukose sind nicht reversibel.
  11. Für jedes Gericht, berechnen Sie die Verzehr% der Neuronen. Dieser Wert wird verwendet, um die GI% der Neuronen unter verschiedenen Behandlungsgruppen quantifizieren.

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Representative Results

Die genaue Präparation des VMH von anderen Bereichen des Hypothalamus ist wichtig, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Die Einbeziehung von anderen Bereichen könnte die VMH neuronalen Population zu verdünnen, die Änderung der Verzehr% der Neuronen berechnet. Weiterhin wurden Glucose erfassenden Neuronen im Hypothalamus anderen Regionen, wie beispielsweise die lateralen Hypothalamus, die funktionell und mechanistisch von VMH Glucosesensorneuronen abweichen identifiziert. Fig. 1 zeigt die korrekten anatomischen Orten für die richtige Präparation. Nach dem Protokoll oben können Hirngewebe, das die richtige Region VMH getrennt werden. Weitere Dissektion genau trennen VMN und ARC, während die Gesamtheit der Teilpopulation kann nicht möglich sein. Fig. 2 zeigt ein Beispiel für gesunde VMH dissoziierten Neuronen. Mit Immunzytochemie, wir bestätigt, dass unsere Vorbereitung ist> 90% neuronalen. Nur gesunde Nervenzellen sollten für die Datenanalysen verwendet werdensis und Geschirr mit zu vielen ungesunden Neuronen sollte verworfen werden. Neuronen, die ungesund sind, haben oft sehr dunkle Ränder, nehmen die MPD in einem größeren Ausmaß, und haben unregelmäßige Formen. Zusätzlich sollte Neuronen in einer solchen Dichte, dass die meisten Neuronen einander nicht während der Aufnahme berühren plattiert werden. Neuronen für die Analyse ausgewählt werden, sollten nicht berührt anderen Zellen oder Schutt.

Von Aufnahmen einer GI Neuron und einem Neuron nonGI erhaltenen Daten sind in Fig. 3 gezeigt. Nach Erhalt einer Grundlinie für 10 min, wurde die extrazelluläre Glucose 2,5 bis 0,1 mM verringert. Die GI-Neuron eine robuste reversible Reaktion größer als die vorbestimmte Schwelle von 10% Veränderung zum Ausgangswert. Der Anstieg der Fluoreszenz spiegelt Depolarisation. Während GE Neuron eine Hyperpolarisation Antworten werden ebenfalls nachgewiesen, ist die Frequenz für die erfolgreiche Anwendung dieser Technik auf diesem Subtyp von Glucoseerfassungs Neuron zu gering (<1% Neuronen). Eine Reihe von physiologischen glucose Abnahmen wurden getestet und der Prozentsatz der VMH Neuronen reversibel depolarisiert wurde jede Schale berechnet. Fig. 4 zeigt, daß eine positive Beziehung zwischen dem Ausmaß der Abnahme der Glucose und der Prozentsatz der depolarisierenden Neuronen besteht. Dies zeigt, dass eine erfolgreiche Primärkultur von adulten Neuronen in Verbindung mit Fluoreszenzabbildung verwendet werden, um für die Untersuchung von Erwachsenen VMH GI Neuronen zu ermöglichen.

Figur 1
Fig. 1 ist. Frontalschnitt mit Markierungen für die richtige VMH Dissektion. Seziert Das Gewebe enthält die VMN und ARC mit minimaler Kontamination aus anderen Bereichen des Hypothalamus. Schrägschnitte sollte von ~ 25-30% unter der Spitze des dritten Ventrikel gemacht werden, um ~ 25-30% zwischen dem Punkt, wo die Rinde trifft die Hypothalamus-Bereich (blau *), und den dritten Ventrikel(3 V). Von Bregma -2,8 mm Paxinos und Watson 1998 9, entsprechend Maus-Gehirn Bregma 1,7 mm. Angepasst Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
2. Hell Bild von gesunden VMH Neuronen aus einer erwachsenen Maus. Dieses Bild wurde 24 Stunden nach der Dissoziation genommen und für MPD-Bildgebung verwendet. Ein paar Beispiele von Neuronen, die sind markiert würde (blau *) oder nicht (rotes x) für die Analyse verwendet werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
Fild 3. Repräsentative MPD Fluoreszenz Spuren einer GI-Neuron (grüne Linie) und einer nonGI Neuron (orange Linie). Zellen wurden mit 2,5 mM Glukose (G) Recording-Lösung für 10 min, gefolgt von einer Abnahme um 0,1 mM G für 15 min und einer durchbluteten zurück auf 2,5 mM G für 15 min. In der GI-Neuron, die prozentuale Veränderung vom Ausgangswert erhöhte sich auf über 10% in der 0,1 mM G Perfusion Zeitraum (40% Durchschnitt 20 bis 25 min) und auf weniger als die Hälfte dieses Anstiegs in der 2,5 mM G Umkehrzeit (15 % durchschnittlich 35-40 min). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
4. Der Anteil der Erwachsenen, die reversibel VMH Neuronen in Reaktion auf verminderte Glukose erkannt unter Verwendung von fluoreszierenden MPD Bild depolarisieren. Apositive Beziehung besteht zwischen der Größe der Glucose Abnahme und der Prozentsatz der depolarisierenden Neuronen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Der Schlüssel zu der Möglichkeit, Aktivität von Nervenzellen aus adulten Mäusen untersucht werden, ist die Fähigkeit, gesunde Neuronen zu distanzieren. Die Dissoziation von Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen ist an mehreren wichtigen Schritte im Protokoll schwieriger im Vergleich zu Neuronen aus jungen Mäusen. Wir haben dieses Problem auf mehrere Arten zu überwinden. Machen 500 um dicken Hirnschnitten minimiert mechanische Schädigung von Neuronen im Vergleich zu den üblichen 250-350 um Scheiben für Hirngewebe von Mäusen verwendet jünger. Dickere Scheiben erfordern größere Aufmerksamkeit auf Herzdurchblutung und Papainverdau von Hirngewebe. Wenn Blut auf Hirngewebe zu sehen ist, auszuwerten und die Genauigkeit der Platzierung der Schnitt in den rechten Vorhof und die Nadel in den linken Ventrikel platziert. Die Strömungsgeschwindigkeit und Menge der Spüllösung kann auch eingestellt werden. Eine gründliche Durchblutung ist zwingend notwendig, da Blut ist giftig für die Nervenzellen und wird in einer geringeren Ausbeute von gesunden Nervenzellen führen. Papainverdau muss effizient genug sein,für die schonende und einfache Verreiben Freisetzung von Einzelzellen aus Gehirngewebe. Eine ineffiziente Papainverdau vermutet, wenn der VMH Gewebe sinkt schnell am Ende der Verdauung und wenn größere Gewebestücke in der zweiten Verreiben vorhanden sind. Mit guten Verdauung, Gewebestücke kaum mit dem bloßen Auge während des dritten Verreiben detektiert. Wenn das Verreiben ist nicht leicht, wird neuronalen Gesundheit leiden. Wenn eine ineffiziente Papainverdau vermutet wird, kann die Konzentration von Papain um 5 U / ml erhöht werden, oder ein neues Fläschchen Papain verwendet werden. Jedoch sollte die Konzentration Papain nicht über 30 U / ml erhöht werden, da dies neuronalen Gesundheit beeinträchtigen.

Das Engagement in BSA ist ein weiterer wichtiger Schritt in der Protokoll. Nach verrieben Zellen auf der BSA-Gradienten zentrifugiert, sowohl die Zeitdauer Neuronen an BSA ausgesetzt und die Menge an BSA erlaubt, mit dem Pellet verbleiben sollte minimiert werden. Der Überstand und die BSA-Gradientensollte sofort nach der Zentrifugation Zeitraum angesaugt werden. Vakuumsauger verwendet werden, um den Großteil der Überstand zu entfernen, aber die letzten ~ 100 &mgr; manuell mit einer Pipette entfernt werden, so dass das Zellpellet wird nicht gestört. Ein weiterer wichtiger Aspekt des Erhaltens gesunden Neuronen ist, um die Zelldichte zu optimieren. Neuronen zu dünn plattiert sind nicht so gesund. Da so wenige Neuronen werden aus jeder Mäusegehirn erhalten, ist es nicht praktisch, um Zellen vor dem Plattieren zu zählen. Während der Zeit, die ausgegeben würde, werden gezählt, würde eine beträchtliche Anzahl von Zellen in den Kunststoff haften und verloren gehen würde. Mit vier Gerichte pro Maus (~ 1 x 10 4 Zellen / ml) als Ausgangspunkt ist eine empirische Bestimmung der Anzahl der Gerichte die praktische Ansatz für eine optimale Neuronendichte. Die Ausbeute des VMH Neuronen von älteren Mäusen erwartet, dass etwa die Hälfte der Ausbeute von jungen Mäusen sein. Weitere Problemlösungen zu Neuron Ausbeute zu verbessern beinhaltet die Quantifizierung der verbleibenden Neuronenbei jedem Schritt der Dissoziation Protokoll, um Schritte von schweren neuronalen Abrieb genau zu bestimmen.

Mit unserem Protokoll, kann gesund dissoziiert Neuronen in Kultur bis zu 2-3 Tage überleben. Jedoch erlaubt die Verwendung von gefilterten Astrozyten Anlage Nährmedien Neuronen in Kultur überleben bis zu 2 Wochen. Wachstumsmedien können durch Inkubation auf konfluenten primären Astrozyten über Nacht konditioniert werden. Astrozyten aus derselben Nagetier Stamm, Geschlecht und Hirnbereich verwendet werden sollte. Während die Verwendung von Astrozyten-konditioniertem Medium stellt eine andere Variable kann diese Änderung erforderlich für alternative Versuche mehr Zeit in Kultur erfordern. Darüber hinaus aus Gründen, die nicht klar sind, haben wir gefunden, dass die Fähigkeit, Glucose zu erfassen ist leicht verloren mit suboptimalen neuronalen Gesundheit, trotz der Aufrechterhaltung der Reaktionen auf Stimuli, wie Glutamat. Somit müssen zusätzliche Vorsicht geboten. Um neuronale Reaktionen auf verminderte Glukose beobachten, ist es zwingend notwendig, um zu vermeiden contaminatiauf, die durch Bakterien, Schimmel, Salze, Seife, und Glucose. Alle Glaswaren und nicht sterile Kunststoff sollten gründlich mit dH 2 O gewaschen werden Neben Verunreinigungen leben, würden Reinigungsmittel und Salze neuronale Integrität und Aktivität beeinflussen. Kleine Mengen von Glukose könnte Glukosekonzentrationen erheblich ändern. Dies würde stören Ergebnisse seit Glukose erfassenden Neuronen reagieren sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der extrazellulären Glukose innerhalb der nonhyperglycemic physiologischen Bereich von 0,1 bis 2,5 mM 10,11.

Bei der Verwendung von MPD-Bildgebung, Konsistenz und Side-by-Side-Experimente zwischen den Behandlungsgruppen für aussagekräftige Ergebnisse wichtig. Behandlungsgruppen sollten am selben Tag getestet werden, wenn möglich, oder zumindest an abwechselnden Tagen. Dies minimiert mögliche Variationen in der Kultur Zubereitungen oder MPD Aliquots. Zusätzlich fanden wir die geringste Abweichung auftritt, wenn die Abbildung in 24 h von Neuronen Dissoziation oben genannten Gründen durchgeführt. Da die Ergebnissesind in% der depolarisierenden Neuronen, Genauigkeit und Konsistenz in der VMH-Dissektion und neuronalen Vorbereitung analysiert ist ebenfalls unerlässlich. Die Gesamt VMH neuronalen Population geerntet muss konstant sein und darf nicht von anderen Regionen Neuronen enthalten. So sollte das Protokoll oben eng und genau beachtet werden. Wenn jedoch alternative Versuche durchgeführt werden sollen und die Bevölkerung Wartung ist nicht ein Problem ist, können Gewebe Schläge, um VMN oder ARC Neuronen zu isolieren.

Die hier beschriebenen Methoden zu etablieren, wie man gesunde VMH Neuronen aus einer erwachsenen Maus und wie MPD-Bildgebung zu verwenden, um Glucose Sensor-Neuronen untersuchen zu ernten. Stattdessen könnten Experimente entworfen werden, um zu prüfen VMH neuronalen Antworten auf Reize von Glucose Veränderungen. Alternativ kann die Dissoziation Protokoll zur Ernte Neuronen von anderen Gehirnregionen, extrapoliert werden. Mit Neuronen aus erwachsenen Mäusen kann jetzt Studien unter Verwendung von Maus-Modelle, die Krankheit oder den Fortschritt mit dem Alter zu entwickeln. Moreover kann gesunden erwachsenen Neuronen weiter mit anderen als MPD-Bildgebungstechniken, wie Calcium-Bildgebung, Elektrophysiologie, Einzelzell-PCR, Immunzytochemie oder einer Kombination dieser Techniken untersucht werden.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal-A Medium (Custom) Invitrogen 0050128DJ custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom) BrainBits custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) Invitrogen 15140 other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) Millipore other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips Warner #1 25mm round
18 mm Glass coverslips Warner #1 18mm round
GlutaMAX Invitrogen 35050
B27 minus insulin (50x) Invitrogen 0050129SA
Razor blade VWR 55411
Vibratome & cooling chamber Vibratome Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades Polysciences 22370 injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension Worthington LS003124
BSA, suitable for cell culture Sigma other vendor acceptable
DNAse, for cell culture Invitrogen other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm Bellco Glass 2090-00608
Membrane Potential Dye (blue) Molecular Devices R8042
In-line heater Warner SF-28
Syringe pumps WPI sp100i other vendor acceptable
Closed chamber Warner RC-43C
Polyethylene tubing Warner PE-90
Metamorph Molecular Devices alternate image analysis software acceptable
Microscope Olympus BX61 WI

used with 10X objective

Camera Photometrics Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set Chroma 41007a
Illumination System Sutter Instruments Lambda DG-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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