मानव प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस के एक orthotopic murine मॉडल

Medicine
 

Summary

मानव प्रोस्टेट कैंसर के इस orthotopic मॉडल फेफड़ों के ट्यूमर कोशिकाओं, और अलग मेटास्टेसिस के गठन परिसंचारी, ट्यूमर के आकार की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. कोशिकाओं प्राथमिक अंग बच चाहिए के रूप में, रक्त प्रवाह में प्रवेश, और एक माध्यमिक साइट में समाविष्ट, इस मॉडल को प्रभावी ढंग से मानव में परिदृश्य स्मरण दिलाता है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (79), e50873, doi:10.3791/50873 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

हमारी प्रयोगशाला में मानव प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) के एक उपन्यास orthotopic आरोपण मॉडल विकसित किया है. पीसीए मौत प्राथमिक ट्यूमर की वजह से, बल्कि अलग मेटास्टेसिस का गठन नहीं है, प्रभावी रूप से पूर्व नैदानिक ​​इस प्रगति मॉडल करने की क्षमता उच्च मूल्य की है. इस मॉडल में, कोशिकाओं सीधे Balb / सी athymic चूहों में प्रोस्टेट के उदर पालि में प्रत्यारोपित, और 4-6 सप्ताह के लिए प्रगति के लिए अनुमति दी जाती है. प्रयोग समाप्ति पर, कई अलग endpoints के इस तरह के आकार और आणविक लक्षण वर्णन प्राथमिक ट्यूमर के, रक्त और अस्थि मज्जा में ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी की उपस्थिति और मात्रा का ठहराव, और फेफड़ों को मेटास्टेसिस के गठन के रूप में, मापा जा सकता है. Endpoints की एक किस्म के अलावा, इस मॉडल एक कोशिकाओं की क्षमता पर आक्रमण और भागने प्राथमिक अंग, भरिये और संचार प्रणाली में जीवित है, और प्रत्यारोपण और एक माध्यमिक साइट में विकसित करने के लिए की एक तस्वीर प्रदान करता है. इस मॉडल metastatic को मापने के लिए प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया हैप्रोटीन अभिव्यक्ति में दोनों में परिवर्तन करने के साथ ही एक छोटी वापसी समय में छोटे अणु चिकित्सा विज्ञान, के जवाब के जवाब.

Introduction

प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) पुरुषों में सबसे अधिक का निदान कैंसर, और संयुक्त राज्य अमेरिका 1 में कैंसर से मौत का दूसरा प्रमुख कारण है. पीसीए से मौत प्राथमिक ट्यूमर के गठन की वजह से नहीं है, लेकिन मेटास्टेसिस के गठन के बजाय. इसलिए, रोगियों में मेटास्टेसिस की रोकथाम उच्च महत्व का है. पीसीए के माउस मॉडल में इस रोग के बारे में महत्वपूर्ण जैविक जानकारी को उजागर करने के लिए विकल्पों की विविधता प्रदान करते हैं.

पीसीए के माउस मॉडल की एक किस्म निहित लाभ और सीमाओं के साथ, प्रत्येक मौजूद हैं. मानव में पीसीए की आवृत्ति उच्च है, स्वाभाविक रूप से होती पीसीए कैंसर से 3 समग्र चूहों के बराबर संवेदनशीलता के बावजूद, चूहों 2 में बेहद असामान्य है. एक कृंतक अपवाद methylnitrosourea और टेस्टोस्टेरोन 4 की प्रेरण के माध्यम से उम्र के 12 महीनों से 90% के पीसीए की दर को प्राप्त कर सकते हैं जो Lobund Wistar चूहों में पीसीए के विकास, है. इस कारण से, इस तरह के आवारा के रूप में मॉडल प्रणाली, प्रेरितमॉडल (माउस प्रोस्टेट की ट्रांसजेनिक ग्रंथिकर्कटता) आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं. आवारा मॉडल प्रोस्टेट में विशेष रूप से transgene अभिव्यक्ति प्रेरित, और hyperplasia से लसीका और फेफड़े मेटास्टेसिस 5-6 प्रोस्टेटिक अंतःउपकला रसौली (पिन) के लिए, पीसीए के सामान्य प्रगति से गुज़रता कर सकते हैं. इन मॉडलों को पूरा ट्यूमर प्रगति की सीमा है, साथ ही एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली को रोकने के उपाय करने में सक्षम होने का लाभ प्रदान करते हैं. हालांकि, पीसीए विकास अंतर्निहित आणविक घटनाओं चूहों और इंसानों के बीच अलग कर सकते हैं, और चूहों और मानव नैदानिक ​​अध्ययन के बीच सहसंबंध परिवर्तनशीलता से पता चला है. आवारा मॉडल मेटास्टेसिस विकसित करने के लिए लगभग 28 सप्ताह की आवश्यकता है एक उदाहरण के रूप में ही, इन मॉडलों के दोनों, समय लेने वाली हैं.

मेटास्टेसिस के अध्ययन में, अक्सर एक पूंछ नस या बाएं वेंट्रिकल इंजेक्शन मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है. इस मॉडल तेजी से बदलाव का समय से लाभ, और साथ ही हड्डी metastas की उपस्थिति उपाय कर सकते हैंविशेष सेल लाइनों और शर्तों का उपयोग है. यांग एट अल. GFP पॉजिटिव PC3 कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन व्यापक रूप से अस्थि मेटास्टेसिस 7 फैलाया पैदा कर सकता है और पूंछ नस और intercardiac इंजेक्शन भी हड्डी मेटास्टेसिस विकास 8-9 उत्पन्न किया है कि सूचना है. इन मॉडलों की प्रमुख सीमाओं प्रोस्टेट ग्रंथि के भीतर ही रहने वाले एक प्राथमिक ट्यूमर की कमी से संबंधित हैं. मॉडल संचलन में कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन पर निर्भर के लिए इसके अलावा, इस metastatic झरना के पूरे पहली छमाही नजरअंदाज. यह इस प्रकार जैविक रूप से metastatic परिवर्तन का महत्वपूर्ण उपाय कर रहे हैं, जो प्राथमिक अंग के माध्यम से आक्रमण सहित प्रारंभिक चरणों,, की परीक्षा अलग करता है. Metastatic परिवर्तन से कई नियामकों सीधे जल्दी सेल आक्रमण प्रभावित करते हैं. कैंसर कोशिकाओं के प्रसार में एक बार, प्रतिरूप भिन्नता जिससे जीवविज्ञान में वृद्धि, काफी के रूप में फैलता metastatic झरना में प्रारंभिक कदम, चिकित्सकीय लक्ष्यीकरण के लिए उच्च प्राथमिकता साइटों का गठनअल विविधता और प्रभावी उपचार लक्ष्यीकरण ह्रासमान.

इन मॉडलों की सीमाओं से कई का जवाब करने की कोशिश में, हमारी प्रयोगशाला मानव पीसीए PC3 एम सेल लाइन सीधे Balb / सी athymic चूहों की प्रोस्टेट में प्रत्यारोपित किया जाता है, जिसमें मानव पीसीए के एक orthotopic मॉडल विकसित किया है. 4-6 सप्ताह के बाद, फेफड़े और लिम्फ नोड्स में ट्यूमर का आकार, ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) परिसंचारी की उपस्थिति, और मेटास्टेसिस सभी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हम प्रभावी रूप से मानव पीसीए मेटास्टेसिस 10 को बाधित करने के लिए '4 की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के ,5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) इस मॉडल का इस्तेमाल किया है. Genistein के आहार खपत प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस और मौत 11-12 में कम हो जाती है से जोड़ा गया है, लेकिन पहले से कोई अध्ययन genistein के प्रशासन जानवरों या पुरुषों में पीसीए मेटास्टेसिस को बदल सकता है कि क्या निर्धारित किया था. इस अध्ययन में हम genistein साथ उपचार बहुत फेफड़ों मेटास्टेसिस की संख्या कम है कि प्रदर्शन किया. इसके अतिरिक्त, हम genistein अल निर्धारितफोकल आसंजन kinase (FAK), p38 mitogen सक्रिय प्रोटीन kinase (p38 MAPK), और गर्मी झटका प्रोटीन 27 (HSP27) सहित प्राथमिक ट्यूमर में कई महत्वपूर्ण समर्थक metastatic प्रोटीन, की सक्रियता और अभिव्यक्ति tered.

इन परिणामों के क्लिनिक में टिप्पणियों के साथ corresponded. चूहों से प्राप्त रक्त का उपयोग करना, हम सही genistein की रक्त सांद्रता उपाय करने में सक्षम थे और इन genistein की नियमित आहार की खपत के साथ मनुष्य में स्तरों के समान होने के लिए मनाया. साथ ही, हमारे समूह ने प्रदर्शन द्वितीय चरण अध्ययन genistein साथ इलाज पर निर्धारित किया है कि, सेलुलर आक्रमण और मेटास्टेसिस के साथ जुड़े जीन की प्रोस्टेट ऊतक mRNA अभिव्यक्ति में कम हो जाती है अनुभवी पुरुषों, विशेष रूप से metalloproteinase टाइप 2 (एमएमपी 2) 13 मैट्रिक्स.

हम भी मानव पीसीए मेटास्टेसिस 14 प्राथमिक ट्यूमर में बदल जीन उत्पाद अभिव्यक्ति के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया है. ट्यूमर supprESSOR endoglin TGFβ superfamily के एक सदस्य है और Smad 15 संकेत के परिवर्तन के माध्यम से इन विट्रो में मानव पीसीए सेलुलर आक्रमण को दबा. हम मानव पीसीए मेटास्टेसिस पर endoglin के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इन अध्ययनों बढ़ाया. स्थिर endoglin पछाड़ना, अभिव्यक्ति सेल लाइनों पर वेक्टर नियंत्रण या endoglin चूहों में प्रत्यारोपित किया गया. Endoglin पछाड़ना कोशिकाओं चूहों के 38% में उच्चतम फेफड़ों मेटास्टेसिस की संख्या है, साथ ही CTCs दिखाया. नियंत्रण वेक्टर साथ प्रत्यारोपित चूहे चूहों के केवल 18% में कम फेफड़ों माउस प्रति मेटास्टेसिस, और CTCs के साथ, एक मध्यम प्रतिक्रिया दिखाई. उच्च endoglin प्रत्यारोपित चूहों फेफड़ों मेटास्टेसिस के लगभग पूर्ण दमन, और CTCs की पूरी दमन दिखाया.

ये इस तकनीक है अनुप्रयोगों के विभिन्न प्रकार के सिर्फ दो उदाहरण हैं. दवाओं की खोज से, आणविक जीव विज्ञान में मॉडलिंग परिवर्तन करने के लिए, इस मॉडल ट्यूमर के विकास और तिल पर विभिन्न कार्यों के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए एक उच्च throughput विधि प्रदान करता हैcular परिवर्तन, CTCs की मौजूदगी, और फेफड़ों और लिम्फ नोड्स में अलग मेटास्टेसिस के गठन.

Protocol

जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं के लिए, प्रोटोकॉल नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया. सर्जिकल तकनीक और जानवरों की देखभाल स्थितियों पशु चिकित्सा कर्मचारियों द्वारा मनाया और पशु तनाव या मृत्यु दर को कम करने के लिए संशोधित किया गया है. व्यक्तिगत संस्थानों विभिन्न आवश्यकताओं को हो सकता है और इसे विकसित करने और इस शल्य चिकित्सा तकनीक को क्रियान्वित जब IACUC और पशु कर्मचारियों के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है.

1. इंजेक्शन के लिए कक्षों की तैयारी

  1. यह कदम सर्जरी शुरू करने के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में किया जाना चाहिए. प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा Trypsinize कोशिकाओं, थाली से दूर है, और मीडिया के साथ बेअसर. Stably GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट PC3-M मानव पीसीए सेल लाइन सफलतापूर्वक कारण PC3-M कोशिकाओं का तेजी से विकास की स्थिति के लिए, इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है. GFP फेफड़े के ऊतकों के नमूने, और तेजी से दृढ़ संकल्प के फेफड़ों मेटास्टेसिस का पता लगाने के अतिरिक्त आसानी के लिए जोड़ा गया हैरक्त और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए अस्थि मज्जा से प्राप्त संस्कृतियों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना में कैंसर की कोशिकाओं. ब्याज की एक विशेष जीन संशोधित, तो यह जीन परिवर्तन के साथ स्थिर सेल लाइनों का निर्माण GFP के साथ अभिकर्मक, जिसके बाद पहली बार प्रदर्शन किया है. GFP ब्याज की इस जीन के समारोह में बदल जाएगा, GFP इसे छोड़ा जा सकता है. यह फेफड़ों मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए और अधिक कठिन है, लेकिन अभी भी प्राप्त कर देगा. ऐसे luciferase आधारित IVIS के रूप में फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर विशिष्ट इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर ही, यदि अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. 225 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  3. 225 x जी पर 5 मिनट के लिए 2.5 x 10 5 कोशिकाओं, और अपकेंद्रित्र अलग.
  4. बाँझ खारा की 20 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें.
  5. एक स्थायी 28 के साथ एक 0.5 मिलीलीटर सिरिंज में महाप्राण सेल निलंबन साढ़े जी सुई (अनुशंसित: अन्य ब्रांडों के मुद्दों के कारण होता है के रूप में केंडल Monojet,), कोई हवा सुनिश्चित करने सुई अल में प्रवेश करती हैनिलंबन के साथ ओंग.
  6. बाँझ पन्नी में सिरिंज लपेटें और इस्तेमाल किया जब तक बर्फ पर दुकान.

2. मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं की Orthotopic आरोपण

  1. नर 6-8 सप्ताह पुराने / Balb सी athymic चूहों का इस्तेमाल कर रहे हैं. शल्य चिकित्सा के लिए आदर्श माउस शरीर का वजन 19-21 ग्राम होता है, और चूहों सर्जरी से पहले कम से कम 18 ग्राम को विकसित करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए. छोटे जानवरों को तकनीकी रूप से अधिक कठिन पर संचालित करने के लिए कर रहे हैं. बड़े जानवरों ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस की धीमी कैनेटीक्स का अनुभव करते हैं. पशु जानवरों की सुविधा कम से कम एक सप्ताह पूर्व पशु तनाव कम करने के लिए सर्जरी करने में रखा जाना चाहिए. प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, नशीली दवाओं के उपचार सर्जरी से पहले एक सप्ताह शुरू हो सकता है.
  2. जानवरों की सुविधा के निर्देशों के अनुसार पूर्व सर्जरी दर्द दवा इंजेक्षन. 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 30 साढ़े जी सुई का उपयोग 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन चमड़े के नीचे Buprenex सुझाव दिया है.
  3. Isoflurane कक्ष में पशुओं प्लेस और जानवरों को पूरी तरह से एक रहे हैं जब तक इंतजारnesthetized. मांसपेशियों टोन का कोई पैर की अंगुली पलटा इस बिंदु पर मौजूद होना चाहिए. इस विधि की सिफारिश की है, लेकिन अनुपलब्ध हैं, संज्ञाहरण के अन्य तरीकों जानवरों की सुविधा के निर्देशों के अनुसार किया जा सकता है.
  4. एक बाँझ प्रक्रिया हुड में isoflurane चैंबर के बाहर जानवर ले जाएँ. नाक शंकु तंत्र में पशु रखें, और उस पशु आगे बढ़ने से पहले पूरा anesthetization के अधीन है फिर से किया जाता है.
  5. , बाँझ कपास गेंदों के साथ एक Betadine हाथ धोने के साथ निचले उदर क्षेत्र कीटाणुरहित पोंछ शराब के साथ पोंछे, और betadine समाधान के साथ अंतिम स्प्रे. सूखे की अनुमति दें.
  6. एक बाँझ स्केलपेल या तेज बाँझ शल्य कैंची, लगभग 3-4 मिमी की एक कम midline पेट चीरा या तो उपयोग किया जाता है. धीरे संदंश का उपयोग मूत्राशय उठा और प्रोस्टेट के उदर पालि की पहचान. इन दो पालियों सीधे मूत्राशय के नीचे स्थित हैं. कुछ चूहों धीरे एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर एक तरफ ले जाया जा सकता है जो प्रोस्टेट को कवर वसा की एक छोटी परत होगा. Minimizई सभी अंगों का आंदोलन और मांसलता यदि संभव हो तो.
  7. रिसाव को कम करने और एक छोटा बुलबुला मनाया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोस्टेट ग्रंथि में 20 उल मात्रा सेल समाधान इंजेक्षन.
  8. मूत्राशय की जगह और एक सरल बाधित पैटर्न में 4.0 absorbable Vicryl monofilament टांके का उपयोग मांसपेशी परत बंद करें.
  9. बाँझ 9 मिमी स्टेपल का उपयोग त्वचा की परत को बंद करें.
  10. जाग और सामान्य रूप से आगे बढ़ जब तक isoflurane संज्ञाहरण से पशु निकालें और निगरानी. वसूली की अवधि के दौरान हीटिंग पैड पर रखें.
  11. एकाधिक सर्जरी 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी, स्वच्छ सभी उपकरणों के बीच, प्रदर्शन किया, और एक गिलास मनका अजीवाणु का उपयोग बाँझ की जा रही है. उपकरण अगले पशु से पहले पूरी तरह से शांत करने के लिए अनुमति दें. टांके, कपास गेंदों, या बाँझ swabs पुन: उपयोग न करें.

3. पशु निगरानी

  1. जानवरों की सुविधा के निर्देशों के आधार पर दर्द दवा प्रशासन. 1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन यू में चमड़े के नीचे meloxicam की एक खुराक के 4 घंटे के बाद सर्जरी प्रशासन1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 30 साढ़े जी सुई गाना, सुझाव एक अतिरिक्त खुराक से अगले 48 घंटे के लिए हर 12-24 घंटे बाद है.
  2. घाव चंगा किया है एक बार स्टेपल्स जानवरों 7-10 दिनों के बाद सर्जरी से हटाया जा सकता है.
  3. पशु वजन, भोजन की खपत की निगरानी, ​​और प्रयोग की समाप्ति तक दो बार एक सप्ताह के ट्यूमर के लिए चूहों टटोलना. ट्यूमर महत्वपूर्ण ट्यूमर बोझ या दबाव के तहत जानवरों के लिए जाँच करने के लिए दिखाई देने लगते हैं, जब हर दूसरे दिन तक आवृत्ति बढ़ाएँ. प्राथमिक ट्यूमर मूत्र प्रवाह को ब्लॉक कर सकते हैं के रूप में इस मॉडल से जल्दी मौत, बड़े प्राथमिक ट्यूमर बोझ की वजह से है, इसलिए अधिक से अधिक 15% से शरीर के वजन या 1.5 सेमी की एक व्यास तक पहुँचने के एक प्राथमिक ट्यूमर के नुकसान के साथ किसी भी पशुओं के लिए तुरंत necropsied किया जाना चाहिए मूत्र रुकावट और पशु मौत को रोकने के.
  4. पशु पर्यावरण के अतिरिक्त संवर्धन के लिए जरूरत के लिए मॉनिटर. सर्जरी के तनाव पशु अंदरूनी कलह बढ़ जाती है. बजाय एक और अतिरिक्त व्यवहार के पिंजरे प्रति दो प्लास्टिक झोपड़ियों के अलावाअल संवर्धन इन घटनाओं को कम कर सकते हैं. जानवरों पर रखे जाते हैं सुविधा पर उपलब्ध पशु चिकित्सा स्टाफ विकल्पों के साथ चर्चा करें. वे आंखों में जलन पैदा कर सकते हैं के रूप में चूहों के इस तनाव पर eyelashes की कमी को देखते हुए, झोपड़ियां और कागज के बने संवर्धन की सिफारिश नहीं कर रहे हैं.

4. पोस्टमार्टम प्रक्रियाएं

  1. 4-6 सप्ताह के बाद, ट्यूमर पूरी तरह से स्पष्ट कर रहे हैं और पशुओं के कारण बढ़ ट्यूमर बोझ को अपना वजन कम करने के लिए शुरू. ट्यूमर आमतौर palpated और / या नेत्रहीन स्पष्ट कर रहे हैं किया जा सकता है. पोस्टमार्टम में इस बिंदु पर किया जाना चाहिए. 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 30 साढ़े गेज सुई का उपयोग करते हुए 260 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन पर Nembutal की intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन, और जानवरों कोई पैर की अंगुली पलटा या मांसपेशियों टोन वर्तमान के साथ, पूरी तरह से बेहोश बनने के लिए अनुमति.
  2. पशु बाँझ शल्य कैंची या एक स्केलपेल का उपयोग, anesthetized है एक बार, पशु के पक्ष के साथ बगल के लिए खड़ी है तो, क्षैतिज सीधे रिब पिंजरे के तहत पशु के धड़ में कटौती, दिल बेनकाब. पशु से जितना संभव हो उतना रक्त प्राप्त करने, जमावट को रोकने के लिए DPBS में 4% सोडियम साइट्रेट साथ प्लावित 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 30 साढ़े जी सुई का उपयोग कर एक टर्मिनल हृदय पंचर प्रदर्शन करना.
  3. शल्य कैंची या एक स्केलपेल के साथ ट्रेकिआ काटने से पशु से फेफड़ों निकालें और तुरंत एक टिशू कल्चर कैसेट में और 10% formalin में जगह है.
  4. व्यक्तिगत रूप से ट्यूमर से जुड़ी किसी भी रक्त वाहिकाओं को काटने और ऐसे वीएएस deferens या लाभदायक vesicles के रूप में कोई अतिरिक्त अंगों सुनिश्चित करने के द्वारा पशु से प्राथमिक प्रोस्टेट ट्यूमर निकालने जुड़े होते हैं.
  5. ट्यूमर का वजन और आकार रिकार्ड. एक प्रयोगशाला पैमाने पर ग्राम में ट्यूमर का वजन को मापने. नली का व्यास का प्रयोग, सेंटीमीटर में ट्यूमर की सबसे लंबी व्यास की लंबाई, और इसी सीधा अक्ष उपाय. ट्यूमर का आकार प्राप्त करने के लिए इन मूल्यों को गुणा करें. इरादा उपयोग पर निर्भर करता है, तुरंत तरल नाइट्रोजन, और / या जगह में फ्रीज तस्वीर10% formalin में एक ऊतक कैसेट को.
  6. बरकरार फीमर रखने के लिए सावधान किया जा रहा है, शल्य कैंची या एक छुरी, और काट पैर के जोड़ों के साथ कूल्हे और घुटने के जोड़ों का खुलासा. पशु से femurs निकालें और बाँझ खारा में जगह है.
  7. किसी भी अन्य अंगों या ब्याज की सामग्री प्राप्त करने, और अपने संस्थान के निर्देशों के अनुसार पशु के निपटान के. विशेष रूप से, क्षेत्रीय लिम्फ नोड्स, मेटास्टेसिस हो जाते हैं उन्हें शरण अगर बढ़े हुए हो जाते हैं, और काटा जा सकता है. इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की वजह से हीड्रास्टाटिक दबाव में परिवर्तन से प्रभावित हो सकता है लेकिन, जैसा कि ध्यान रखा जाना चाहिए.

5. प्रसंस्करण और फेफड़े के ऊतकों के नमूनों के immunostaining

  1. पीबीएस में 10% formalin में ऊतक रखने के 24-48 घंटे के भीतर, आयल में फेफड़ों एम्बेड.
  2. धारा 2-3 आसन्न 4 माइक्रोन फेफड़े के ऊतकों वर्गों लेने के 45 माइक्रोन कदम वर्गों में फेफड़ों,.
  3. GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया है (अनुशंसित), immunostaining प्रदर्शनGFP के लिए. यदि नहीं, तो मानक hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला प्रदर्शन करते हैं.

नोट: Invitrogen से GFP एंटीबॉडी के साथ संयुक्त Dako कल्पना + किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह किसी भी immunohistochemistry प्रक्रिया को संशोधित किया जा सकता है.

  1. एक अंधा फैशन में मेटास्टेसिस स्कोर. GFP पॉजिटिव हैं, ट्यूमर कोशिकाओं बड़े और विशिष्ट नाभिक होने के अलावा में भूरे रंग के दाग होगा. पहले स्कोरिंग मेटास्टेसिस, सही स्कोरिंग सुनिश्चित करने, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि, और नहीं करने के लिए एच ई कलंकित फेफड़े के ऊतकों का उपयोग करने के लिए एक रोगविज्ञानी से परामर्श करते हैं.

6. रक्त और अस्थि मज्जा से ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी की पहचान

  1. एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब शव - परीक्षा से एकत्र सभी रक्त जोड़ें. 800 x जी पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट.
  2. प्लाज्मा निकालें और 1 मिलीलीटर ACK lysis बफर (154.95 मिमी अमोनियम क्लोराइड, 9.99 मिमी पोटेशियम Bicarbo जोड़नैट, 0.0995 मिमी EDTA,). रक्त कमरे के तापमान 3-5 मिनट में बैठने की अनुमति.
  3. 800 x जी पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट.
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल संस्कृति मीडिया एंटीबायोटिक दवाओं युक्त के 1 मिलीलीटर जोड़ें. सेल संस्कृति मीडिया के 9 मिलीलीटर युक्त एक T75 फ्लास्क कोशिकाओं जोड़ें.
  5. हर दिन 2-3 CTCs की उपस्थिति के लिए जाँच, 10 दिनों के लिए 5% सीओ 2 युक्त एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं.
  6. अस्थि मज्जा के लिए, कैंची की एक जोड़ी, एक रेजर ब्लेड, या स्केलपेल का उपयोग femurs से सभी मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें. करीब के रूप में संभव के रूप में समाप्त होता है, हड्डी के सिरों निकालें.
  7. एक 23 ¾ जी सुई का प्रयोग, धीरे से एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में फीमर से अस्थि मज्जा बाहर निकालें.
  8. सेल संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण को अच्छी तरह से विंदुक.
  9. सेल संस्कृति मीडिया के 9 मिलीलीटर युक्त एक T75 फ्लास्क कोशिकाओं जोड़ें.

7. ट्यूमर के आणविक विशेषता

  1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) परख के लिएएस, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्नैप थे कि ट्यूमर के नमूनों पहले सूखी बर्फ पर चूर्णित और फिर 1 मिलीलीटर TRIzol साथ 3-5 मिनट के लिए एक ऊतक homogenizer का उपयोग homogenized हैं. TRIzol निकासी निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है. निर्माता के निर्देशों के अनुसार RNeasy आरएनए अलगाव किट का उपयोग आरएनए शुद्ध. सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन और मात्रात्मक वास्तविक समय निर्माता के निर्देशों के अनुसार TaqMan अभिकर्मकों का उपयोग पीसीआर (qRT / पीसीआर) की सिफारिश की है, लेकिन वर्तमान में कार्यरत किसी भी पीसीआर विधि के लिए संशोधित किया जा सकता है.
  2. , पीबीएस (137 मिमी NaCl, 10 मिमी ना फॉस्फेट, 2.7 मिमी KCl), 0.5% ट्राइटन X-100, 1 मिमी EDTA: पश्चिमी धब्बा assays के लिए, lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 3-5 मिनट के लिए एक ऊतक homogenizer का उपयोग ऊतकों homogenize 2.5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, protease अवरोध कॉकटेल, फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल 2 और 3, 10 मिमी सोडियम फ्लोराइड, और 1 मिमी सोडियम orthovanadate के अलावा के साथ 1 मिमी β-glycerophosphate,. सेल lysate मिश्रण एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा गया है.
  3. शत13,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए rifuge सेल lysate मिश्रण.
  4. एक नया 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और जगह निकालें और 13,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए फिर centrifuged. सेल मलबे में अभी भी मौजूद है, तो एक अतिरिक्त centrifugation कदम प्रदर्शन किया जा सकता है.
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सामान्य प्रयोगशाला परिस्थितियों के अनुसार एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन करते हैं.

Representative Results

इस प्रयोग के लिए, हम इन शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं के दौरान प्राप्त चूहों के एक प्रतिनिधि समूह दिखा. पांच चूहों एक नियंत्रण वेक्टर युक्त GFP पॉजिटिव PC3-M कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया. ट्यूमर छह सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई थी, और उसके बाद कई मापदंडों का मूल्यांकन किया गया. आंकड़े 1 ए और 1 बी में, हम क्रमशः, शरीर के वजन और चूहों के भोजन की खपत में परिवर्तन दिखा. कारण संज्ञाहरण के लिए शरीर के वजन और सर्जरी की तारीख के आसपास भोजन की खपत में एक छोटी सी कमी आई है. प्रयोग के दौरान, शरीर के वजन धीरे - धीरे बाद सर्जरी बढ़ जाती है, और फिर ट्यूमर बोझ एक महत्वपूर्ण स्तर तक पहुँच जाता है के रूप में प्रयोग के अंत में गिरावट शुरू होता है. यह इन चूहों में भोजन की खपत के अनुरूप है.

आंकड़े 2A और 2 बी में प्राप्त की प्रतिनिधि ट्यूमर के आकार से पता चला रहे हैं. व्यक्तिगत ट्यूमर के आकार में भिन्नता है, लेकिन औसत पर हम लगभग 1 ग्राम का ट्यूमर को प्राप्त है, के साथ0.5-1.5 2 सेमी का एक सामान्य विचरण साथ 0.5-1.5 जी, और 1 सेमी 2 के एक ट्यूमर के आकार के बीच सामान्य विचरण,. ट्यूमर का आकार बदलता है, हालांकि इन इस पत्र में और हमारे पहले प्रकाशित काम करता है 10 दोनों दिखाया परिणामी मेटास्टेसिस की संख्या, के साथ संबद्ध हों. हालांकि, इस मॉडल से, एक दवा उपचार या ट्यूमर वजन और आकार पर आणविक परिवर्तन के प्रभाव को निर्धारित कर सकते हैं. प्रयोग के लिए उपयुक्त समापन बिंदु है जब इस मॉडल में एक महत्वपूर्ण विचार है. आंकड़े -2 सी और 2 डी में, हम stably 4 सप्ताह में GFP और एक नियंत्रण वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट एक विशेष PC3 एम सेल लाइन में और 6 सप्ताह में ट्यूमर वजन और ट्यूमर के आकार में परिवर्तन दिखा. पिछले दो हफ्तों में, औसत ट्यूमर वजन 2.7 गुना, और ट्यूमर के आकार में 1.9 गुना वृद्धि हुई है. इस प्रयोग पर 1-2 अतिरिक्त सप्ताह के अलावा नाटकीय रूप से परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं दिखाता है. कारकों की एक भीड़ सहित ट्यूमर के विकास को बदल सकते हैंदिखाई ट्यूमर चूहों के बहुमत में मनाया जाता है जब तक की उम्र और आदि चूहों के आकार, कोशिकाओं के मार्ग की संख्या, हम प्रयोगों समाप्त नहीं करने की सलाह देते.

आंकड़े 3 ए -3 सी में, मेटास्टेसिस की संख्या तीन अलग अलग तरीकों मात्रा निर्धारित है. चित्रा 3 में, GFP पॉजिटिव मानव पीसीए कोशिकाओं की कुल संख्या प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. चित्रा 3 बी में, सेल लोकी, या metastatic जमा मौजूद हैं जहां स्थानों की संख्या, दिखाया गया है. अंत में, चित्रा -3 सी में, अलग मेटास्टेसिस की संख्या, 5 या अधिक GFP पॉजिटिव मानव पीसीए कोशिकाओं दिखा कोशिकाओं का एक स्पष्ट रूप से बाध्य समूह द्वारा परिभाषित के रूप में प्रदर्शित किया जाता है. इन अलग अलग परिस्थितियों के प्रतिनिधि चित्रों आंकड़े 4A-4D में दिखाया गया. चित्रा -4 ए में, 40x परिमाण में एक व्यक्ति के सेल एक तीर के साथ प्रकाश डाला है. भूरे रंग धुंधला हो जाना और बड़े अलग नाभिक नोट. एच एंड ई धुंधला का उपयोग दाग पड़ोस के फेफड़ों अनुभागGFP बिना पुष्टि है कि, चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, कैंसर की कोशिकाओं का पता लगाने अभी भी आसानी से प्राप्त किया है. यह फोटो 40x परिमाण में लिया जाता है और सेल एक तीर के साथ प्रकाश डाला है. चित्रा 4C में, 10x परिमाण में सेल संख्या बदलती के कई स्थलों प्रदर्शित कर रहे हैं और प्रत्येक लोकस एक तीर के साथ प्रकाश डाला. . अन्त में, चित्रा 4D में, 10 कोशिकाओं के एक metastatic जमा दिखाया गया है. इन तरीकों को कैसे प्रभावित करती डेटा माउस 1 और माउस 3 में अंतर से दिखाया गया है. माउस 1 फेफड़ों अनुभाग प्रति 700 कोशिकाओं के एक औसत है जो माउस 3 की तुलना में फेफड़ों के प्रति खंड 21.5 कोशिकाओं के एक औसत के साथ फेफड़ों में कुल कोशिकाओं की एक कम संख्या है. हालांकि, माउस 3 कम लोकी, या कोशिकाओं माउस 1 से मौजूद हैं, जहां स्थानों पर है. माउस 3 मेटास्टेसिस के अपेक्षाकृत कुछ साइटों की है, लेकिन क्षेत्र के प्रति कोशिकाओं की संख्या की वजह से कई बहुत बड़े सेल नंबर मेटास्टेसिस को loci प्रति 82 कोशिकाओं में बहुत अधिक है. इसके विपरीत, माउस 1 और अद्वितीय लोकी, लेकिन काफी चस्थान के अनुसार दो कक्षों का केवल एक औसत पर स्थान प्रति सुराही कोशिकाओं. ये विभिन्न मापदंडों फेफड़ों और बढ़ने और पैदा करना शुरू करने के लिए उनकी क्षमता को तस्करी कोशिकाओं के कैनेटीक्स पर प्रकाश डाला सकता है.

इसके अतिरिक्त, चित्रा 3 डी में, हम चार से छह बनाम सप्ताह में necropsied चूहों में फेफड़ों के अनुसार कुल metastatic कोशिकाओं में परिवर्तन दिखा. आंकड़े -2 सी और 2 डी में वर्णित है, महत्वपूर्ण परिवर्तन एक प्रयोग के अंतिम दो सप्ताह में ट्यूमर वजन और आकार में मनाया जाता है. यह आंकड़ा 3 डी में recapitulated है. 6 सप्ताह में चूहों का मूल्यांकन सभी चूहों में metastatic कोशिकाओं से पता चला है, जबकि चार सप्ताह में necropsied चूहे, कोई metastatic विकास दिखाया. यह आगे चूहों necropsies मेटास्टेसिस के गठन में हुई है यह सुनिश्चित करने के लिए एक देर चरण समापन बिंदु पर प्रदर्शन कर रहे हैं सुनिश्चित करने के महत्व को दर्शाता है.

इस मॉडल में एक जोड़ा माप के अंदर होने वाली आणविक परिवर्तन है प्राथमिक ट्यूमर. आंकड़े 5A-5C में हम तीन उदाहरण qRT / पीसीआर प्रयोगों metastatic प्रगति में रुचि के तीन जीनों को मापने दिखाने, मैट्रिक्स metalloproteinase टाइप 2 (एमएमपी 2), मैट्रिक्स metalloproteinase प्रकार 9 (एमएमपी 9), और गर्मी झटका प्रोटीन 27 (HSP27) क्रमशः. QRT / पीसीआर के माध्यम से मापा हित के किसी भी जीन इस तकनीक का उपयोग कर पाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन का स्तर पश्चिमी धब्बा प्रक्रियाओं का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. मनाया शरीर के वजन और जानवरों में भोजन की खपत. ग्राम में एबी) शरीर के वजन, या ग्राम में प्रति दिन माउस प्रति औसत भोजन की खपत, प्रयोग के दौरान दर्ज की गई और एक में दिखाया गया है) और बी) क्रमशः है.

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg "/>
चित्रा 2. व्यक्तिगत और चूहों के समूह में ट्यूमर के आकार और ट्यूमर वजन. पांच प्रतिनिधि नियंत्रण चूहों और छह सप्ताह के अंत में पांच चूहों की औसत से चुकता सेंटीमीटर में ग्राम और ट्यूमर के आकार में एबी) ट्यूमर वजन में दिखाया गया है) और बी) क्रमशः. सीडी) ग्राम में ट्यूमर वजन की तुलना और चूहों के समूह के बीच चुकता सेंटीमीटर में ट्यूमर का आकार चार और छह सप्ताह में necropsied. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. Metastatic व्यक्ति में फैला है और चूहों के समूह. एसी) औसत metastatic spreaडी पांच व्यक्ति चूहों और में 5 + कोशिकाओं द्वारा परिभाषित के रूप में कोशिकाओं की कुल संख्या (ए), metastatic कोशिकाओं के स्थानों (बी), या अलग मेटास्टेसिस या तो के रूप में प्रतिनिधित्व छह सप्ताह के अंत में पांच चूहों की औसत के लिए फेफड़ों अनुभाग प्रति एक स्पष्ट रूप से परिभाषित क्लस्टर (सी). डी) चूहों के बीच माउस प्रति फेफड़ों अनुभाग प्रति metastatic कोशिकाओं की औसत संख्या की तुलना में चार और छह सप्ताह में necropsied. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. फेफड़ों metastases के प्रतिनिधि छवियाँ. ए) 40x उद्देश्य में एक व्यक्ति GFP सकारात्मक फेफड़ों सेल) एक तीर. बी के साथ प्रकाश डाला है एक आसन्न फेफड़ोंएच एंड ई धुंधला. सी के तहत एक ही सेल दिखाते हुए एक से खंड), सेल). डी की बदलती संख्या) स्पष्ट रूप से एक समूह के रूप में परिभाषित 10 कैंसर कोशिकाओं से युक्त 10X उद्देश्य पर एक अलग मेटास्टेसिस युक्त सात व्यक्ति लोकी के साथ 10X उद्देश्य पर एक फेफड़े खंड.

चित्रा 5
चित्रा 5. ब्याज की तीन metastatic जीन का पीसीआर विश्लेषण. QRT / पीसीआर छह सप्ताह में चूहों से एकत्र व्यक्तिगत ट्यूमर के नमूनों पर प्रदर्शन किया गया था. एमएमपी 2 (ए) के सापेक्ष mRNA प्रतिलेख के स्तर, एमएमपी 9 (बी), और HSP27 (सी), GAPDH के लिए सामान्यीकृत मापा जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

इस पत्र में हम मानव पीसीए मेटास्टेसिस के एक उपन्यास murine मॉडल प्रदान करते हैं. इस मॉडल में, मानव पीसीए सेल लाइनों PC3-M orthotopically 4-6 सप्ताह के लिए विकसित करने की अनुमति / Balb सी athymic चूहों और ट्यूमर के प्रोस्टेट में सीधे प्रत्यारोपित किया जाता है. प्रतिनिधि परिणाम खंड में, हम माउस वजन और आहार खपत, ट्यूमर के आकार और वजन के ट्यूमर का आणविक विशेषताओं, और फेफड़ों के लिए अलग मेटास्टेसिस के गठन सहित एकत्र किया जा सकता है कि डेटा, के उदाहरण दिखाते हैं. इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त outputs की एक विस्तृत विविधता विशेष अनुसंधान के हितों के आधार पर अध्ययन किया जा सकता है. एक उदाहरण के रक्त और अस्थि मज्जा को CTCs की उपस्थिति है. CTCs एक अपेक्षाकृत विरल घटना (हम नियंत्रण जानवरों के लगभग 5-20% में CTCs का निरीक्षण कर रहे हैं) के रूप में, हम इन प्रयोगों में पांच चूहों में से कोई भी CTCs विकसित हैरान नहीं थे. हमारी प्रयोगशाला में भी परमाणु सेल आकारिकी को मापने के द्वारा सेलुलर आसंजन में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया गया हैप्रोस्टेट ऊतक 10. हम भी Ki67 और प्रोस्टेट ट्यूमर 14 की TUNEL के धुंधला का उपयोग प्राथमिक ट्यूमर प्रसार और apoptosis स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया है.

प्राप्त की जा सकती है कि डेटा outputs की व्यापक विविधता के अलावा, इस मॉडल दोनों प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ ही छोटे अणु चिकित्सा विज्ञान के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव पीसीए मेटास्टेसिस के कई सहज और प्रेरित मॉडल की तुलना में केवल 4-6 सप्ताह के एक उच्च बदलाव का समय है. ऐसे पूंछ नस या intercardiac इंजेक्शन मॉडल के रूप में एक उच्च वापसी समय के साथ अन्य मॉडल,, इस प्रकार पूरी तरह क्लिनिक metastatic झरना recapitulating नहीं, कोई प्राथमिक ट्यूमर की सीमाएं हैं. हमारे मॉडल में, ट्यूमर कोशिकाओं, मूल के प्राथमिक साइट से बच भरिये और संचार प्रणाली जीवित है, और एक माध्यमिक साइट में समाविष्ट करना चाहिए. इस प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप या परिवर्तन एक प्रभाव पहुंचा सकता है, जिस पर अतिरिक्त कदम प्रदान करता है. Additionally, प्राथमिक ट्यूमर की उपस्थिति में इस तरह luciferase आधारित IVIS 16-17 के रूप में नई इमेजिंग तकनीक के लिए इस मॉडल का आसान आवेदन के लिए अनुमति चाहिए.

इस मॉडल के लाभों का विस्तृत विविधता के बावजूद, विचार करने के लिए कई सीमाएं भी हैं. पढ़ाई के एक बढ़ती हुई संख्या ट्यूमर microenvironment और मेटास्टेसिस 18 के विकास में प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्व को दिखाते हैं. इस मॉडल में, कारण एक athymic कृंतक का उपयोग करने के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रभाव का आकलन करने की क्षमता संभव नहीं है. एक दूसरी सीमा PC3-M कोशिकाओं में एण्ड्रोजन जवाबदेही का अभाव है. पीसीए के प्रारंभिक निदान पर, मरीज अक्सर एक पहली पंक्ति के इलाज के रूप में एण्ड्रोजन चिकित्सा से गुजरना होगा. हालांकि, रोगियों को अंततः एण्ड्रोजन प्रतिरोधी और ट्यूमर फिर से बढ़ने शुरू हो जाएगा हो जाएगा. PC3-M कोशिकाओं एण्ड्रोजन रिसेप्टर कमी के रूप में, इस मॉडल ही बाद एण्ड्रोजन प्रतिरोधी सी पर दवा उपचार या प्रोटीन मॉडुलन के प्रभाव के उपायancer. यह एक सीमा है, एण्ड्रोजन उत्तरदायी पीसीए वर्तमान में अच्छी तरह से प्रबंधनीय है और प्रभावी उपचार के विकल्प की एक किस्म है, और इस प्रकार एण्ड्रोजन प्रतिरोधी कैंसर अध्ययन अधिक प्रमुखता से बन गया है. यह मॉडल भी विशेष रूप से माउस परिवर्तनशीलता के लिए माउस को कम करता है जो चूहों की एक जन्मजात तनाव का उपयोग करता है. हालांकि, इस तनाव क्लिनिक के लिए इस डेटा extrapolating किया जाना चाहिए जब इस तरह से देखभाल, विशेष प्रोटीन या छोटे अणुओं के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हो सकता है.

इस मॉडल को 4-6 हफ्तों की एक तेजी से वापसी समय में दवा प्रभावकारिता की एक प्रभावी माप प्रदान करता है, हालांकि, यह ध्यान में लंबे समय तक दवा dosing प्रभाव नहीं ले सकता है. कई वर्तमान में उपलब्ध उपचार के लिए लंबे समय तक निवेश के बाद, रोगियों को दवा प्रतिरोधी कैंसर कई सालों के बाद इलाज के साथ वापस आ सकते हैं. इस तकनीक के तेजी से बदलाव के लिए एक उपचार के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं एक ट्यूमर की क्षमता का प्रभावी मॉडलिंग के लिए अनुमति नहीं है. बहरहाल, यह पूर्व के मॉडुलन के साथperiment, उपचार प्रतिरोधी मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जा सकता है, और पीसीए ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस को रोकने में एक दूसरी पीढ़ी के चिकित्सीय की प्रभावशीलता मॉडलिंग की जा सकती. एक समूह को समय के साथ एक प्राथमिक ट्यूमर में आणविक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रयास कर रहा था साथ ही, यदि ऐसे आवारा मॉडल के रूप में एक लंबी अवधि के मॉडल करने के लिए उन के अध्ययन के लिए और अधिक प्रभावी हो जाएगा.

इस मॉडल की एक और सीमा केवल लिम्फ नोड्स और जानवरों के फेफड़ों के लिए अलग मेटास्टेसिस का प्रसार है. मानव गर्म ऑटोप्सी पढ़ाई 19 के द्वारा प्रदर्शन के रूप में इन साइटों के दोनों, मेटास्टेसिस के लगातार और नैदानिक ​​प्रासंगिक साइटों रहे हैं. हालांकि, चिकित्सकीय हड्डी मेटास्टेसिस मानव पीसीए की एक प्रमुख विशेषता का गठन किया है, और इस प्रकार इस recapitulating मॉडल रुचि के हैं. दुर्भाग्य से, इन पूंछ नस, intercardial इंजेक्शन, या में प्रत्यक्ष आरोपण बिना हड्डी मेटास्टेसिस दिखा बहुत कुछ मॉडलों के साथ, एक माउस मॉडल में पुनरावृत्ति करना मुश्किल हो जाता हैहड्डी से 20. हड्डी को लक्षित कुंजी प्रयोगात्मक महत्व का है इस प्रकार है, एक और मॉडल अधिक प्रभावी हो सकता है. हालांकि, इस मॉडल अस्थि मज्जा ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी के रूप में हड्डी को यातायात के कुछ उपाय प्रदान करता है.

इन सीमाओं के बावजूद, इस तकनीक को मानव पीसीए के एक शक्तिशाली मॉडल है. एक छोटी वापसी समय में प्राथमिक ट्यूमर के साथ ही metastatic गठन दोनों पर प्रभाव को मापने की क्षमता आवेदनों की एक विस्तृत विविधता प्रदान करता है. इस मॉडल में, सेल, प्राथमिक अंग बच भरिये और खून में जीवित है, और एक माध्यमिक साइट में प्रत्यारोपण, मानव में प्रक्रिया recapitulating चाहिए. प्राथमिक ट्यूमर के आणविक विशेषताओं के अतिरिक्त माप, सेल आकारिकी में परिवर्तन, और ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी की उपस्थिति एक मॉडल से जानकारी की एक विस्तृत सांस प्रदान करता है. यह प्रक्रिया दवाओं की खोज के संदर्भ में और साथ ही ट्यूमर जीव विज्ञान में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए दोनों का उपयोग किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

इस काम RCB, CA122985 और प्रोस्टेट बीजाणु CA90386, करने के लिए और जेएमपी, एनआईएच T32 AG000260 "उम्र से संबंधित विकारों में ड्रग डिस्कवरी प्रशिक्षण" करने के लिए, और वाल्टर एस और Lucienne द्वारा स्वास्थ्य (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में लाइफ साइंसेज में Driskill ग्रेजुएट प्रोग्राम. हम भी नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में माउस phenotyping और प्रोटोकॉल प्रयोगशाला और पैथोलॉजी कोर सुविधा को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip Becton Dickinson 309659
23 G 3/4 Precison Glide Needle Becton Dickinson 305143
30 G 1/2 Precision Glide Needle Becton Dickinson 305106
Alcohol Wipes Triad 10-3001
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel Becton Dickinson 427630
Clips, 9mm VWR 15431-673
Convertors Polyline Towel (Sterile) Cardinal Health 3520
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft Fisher 23-400-125
Curad Sterile Cotton Balls VWR 500043-544
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4") VWR 95039-192
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PN70
Germinator 500 Cell Point Scientific SN 7030
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle Tyco 1180528012
Medium Heating Pad VWR 100229-094
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2") VWR 94000-000
Metric/English Vernier Caliper VWR 19155-057
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27" Ethicon Z304H
VetEquip Inhalation Anesthesia System Contact Your Animal Facility for Availability
VWR Premium Tissue Cassettes VWR 18000-010
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2") VWR 82027-440
Reagents
Betadine Surgical Scrub Fisher Healthcare 19-027132
Buprenex Controlled Substance - Obtain from Animal Facility
Dako DAB + Chromagen Dako K3468
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit Dako K4003
Dako Envision Kit Protein Block Dako X0909
Formalin VWR 95042-908
GFP Antibody Invitrogen A11122
Hematoxylin Mayer MH580-2.5L
Meloxican Obtain from Animal Facility
Nembutal Controlled Substance - Obtain from Animal Facility
Rneasy RNA Isolation Kit Qiagen 74104
Sterile Saline Obtain from Animal Facility
Taqman Reverse Transcription Reagents Life Technologies N8080234
TaqMan Universal PCR Master Mix Life Technologies 4304437
Trizol Invitrogen 10296

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 61, 69-90 (2011).
  2. Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).
  3. Rangarajan, A., Weinberg, R. A. Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice. Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).
  4. Pollard, M. Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man. Prostate. 37, 1-4 (1998).
  5. Gingrich, J. R., et al. Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model. Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).
  6. Gingrich, J. R., et al. Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse. Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).
  7. Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, 781-786 (1999).
  8. Wu, T. T., et al. Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines. Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).
  9. Dolman, C. S., et al. Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy. Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).
  10. Lakshman, M., et al. Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice. Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).
  11. Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).
  12. Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men. Lancet. 342, 1209-1210 (1993).
  13. Xu, L., et al. MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).
  14. Lakshman, M., et al. Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).
  15. Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway. Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).
  16. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. e1210 (2009).
  17. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. J. Vis. Exp. e2125 (2010).
  18. Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Osteotropic cancers: from primary tumor to bone. Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).
  19. Rubin, M. A., et al. Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer. Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).
  20. Singh, A. S., Figg, W. D. In vivo models of prostate cancer metastasis to bone. J. Urol. 174, 820-826 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics