الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية حول كيفية استخدام النظام لمجموعة واسعة من التطبيقات.

Cite this Article

Copy Citation

Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. وقد أظهرت هذه التقنية في معالجة التطبيقات المحتملة صعبة سابقا؛ بما في ذلك، والتسليم إلى الخلايا الأولية المناعي، وإعادة برمجة الخلية، وأنابيب الكربون، والكم نقطة التسليم. تعتمد هذه المنصة خالية من ناقلات ميكروفلويديك على اضطراب الميكانيكية للغشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد المستهدفة. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لاستخدام لهذه الأجهزة ميكروفلويديك بما في ذلك، والتجمع الجهاز، وإعداد الخلايا، وتشغيل النظام. هذا النهج يتطلب التسليم الأمثل موجزة عن نوع الجهاز وظروف التشغيل للتطبيقات يبلغ عنها سابقا. الإرشادات المتوفرة هي تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم وهذا النظام لا يتطلب مخازن المتخصصة أو خطوات التعديل الكيميائي / الاقتران. هذا العمل كما توفرق توصيات بشأن كيفية تحسين أداء الجهاز والمتاعب اطلاق النار على المشاكل المحتملة المتعلقة انسداد، الكفاءة تسليم منخفضة، وبقاء الخلية.

Introduction

تسليم الجزيئات إلى السيتوبلازم الخلية هو خطوة حاسمة في التطبيقات العلاجية والبحوث. جسيمات متناهية الصغر بوساطة التسليم، على سبيل المثال، أظهرت المحتملة في العلاج الجيني 1،2، بينما التسليم البروتين هو وسيلة واعدة لتؤثر على وظيفة الخلوية في كل من السريرية والمختبرية 3 4 الإعدادات. غيرها من المواد، مثل المخدرات جزيء صغير، نقاط الكم، أو جزيئات الذهب، هي ذات فائدة في تطبيقات تتراوح بين علاجات السرطان 5،6 إلى 7،8 وضع العلامات داخل الخلايا، وجزيء واحد تتبع 9.

غشاء الخلية غير منفذ إلى حد كبير الجزيئات. العديد من التقنيات القائمة استخدام الجسيمات النانوية البوليمرية 10،11، 12 الجسيمات الشحمية، أو التعديلات الكيميائية 13 لتسهيل اضطراب الغشاء أو تسليم endocytotic. في هذه الأساليب، وكفاءة التسليم وخلية حيوية تعتمد غالبا على هيكل اله الجزيء المستهدف ونوع من الخلايا. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون فعالة في إيصال المواد موحد هيكليا، مثل الأحماض النووية، ولكن في كثير من الأحيان غير ملائمة لإيصال أكثر تنوعا من الناحية الهيكلية المواد، مثل البروتينات والمواد النانوية 14،15 7. وعلاوة على ذلك، فإن آلية تعطيل جسيم داخلي أن معظم هذه الطرق تعتمد على كثير من الأحيان غير فعالة، وبالتالي ترك الكثير من المواد المحاصرين في الهياكل حويصلة 16. أخيرا، الأساليب التي غالبا ما يتم تطويرها للاستخدام مع خطوط الخلايا التي أنشئت لا تترجم بشكل جيد إلى الخلايا الأولية.

طرق غشاء poration، مثل التثقيب الكهربائي 17،18 وsonoporation 19، وبديلا جذابا في بعض التطبيقات، ولكن من المعروف أنها تسبب انخفاض بقاء الخلية، ويمكن أن تكون محدودة من قبل المسؤول عن تسليم المواد المستهدفة.

تشوه الميكانيكية السريع للخلايا، واتباع نهج ميكروفلويديك إلى التسليم، في الآونة الأخيرة demonstrated مزاياه أكثر التقنيات الحالية في سياق إعادة برمجة الخلية 20 وتسليم المواد متناهية الصغر 21. يعتمد هذا الأسلوب على تعطيل الميكانيكية س غشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد الموجودة في المخزن المؤقت المحيطة بها. وقد أثبت نظام تمكين المحتملة في تحدي سابقا أنواع الخلايا (مثل الخلايا المناعية الأولية والخلايا الجذعية) والمواد (مثل الأجسام المضادة وأنابيب الكربون النانوية). هنا، يتم وصف الإجراء عامة لاستخدام هذه الأجهزة للتسليم داخل الخلايا من الجزيئات المستهدفة. هذا الإجراء هو تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم، ومع ذلك، فمن المستحسن أن أحد إجراء التحسين وجيزة من الظروف، كما هو مفصل في المبادئ التوجيهية لدينا تصميم ذكرت سابقا 20، لأي طلبات غير المبلغ عنها سابقا. حتى الآن، تم استخدام النظام بنجاح لإيصال الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، وجزيئات الذهب، نقاط الكم، أنابيب الكربون النانوية، والبروتينق، والبوليمرات ديكستران 20،21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تخزين

  1. تخزين خزانات، وأصحاب والحلقات والأجهزة ميكروفلويديك في الايثانول 70٪. استخدام الحاويات (مثل جرة أو كوب) التي لديها غطاء لمنع التبخر وتلوث الغبار أو الجزيئات خارج. وضع الأجهزة في حاوية واحدة (1) والخزانات وO-حلقات في حاوية الثانية (2)، وأصحاب في الثالثة (3).

ملاحظة: استخدام الايثانول 70٪ للتخزين هو الحفاظ على العقم. إذا كانت مكونات فقط من الحل هي الايثانول والماء (أي لا وكلاء تغيير طبيعة)، وينبغي أن تكون جميع مكونات النظام متوافق تماما ولن تتحلل بمرور الوقت.

  1. تغيير الحل الايثانول في حاويات (2) و (3) قبل كل استعمال لمنع انتقال التلوث عبر التجارب والتقليل من وجود جزيئات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسبب انسداد.

2. تجربة إعداد

  1. حاويات المكان (2) و (3) في حمام بالموجات فوق الصوتية للص 5-10 دقيقة قبل كل استعمال. هذا يساعد على إزالة أي جزيئات الملوثة من التجارب السابقة.
  2. مساحة العمل نظيفة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع 70٪ محلول الإيثانول.
  3. رش جميع المواد (3 حاويات، وملاقط) بمحلول الإيثانول 70٪ قبل وضعها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.

3. جمعية

  1. المنصوص عليها 2-3 مناديل منخفضة من الوبر في منطقة العمل.
  2. إزالة خزانات البلاستيك من الحاويات مع ملاقط وتضعها على مناديل لتسهيل تبخر حل الإيثانول من الأسطح الداخلية. بلطف الاستفادة من الخزانات على السطح أو نفخ الهواء من خلالهم لتسهيل إزالة الحل الايثانول.
  3. إدراج O-حلقات في الفتحة المناسبة على الخزانات.
  4. إزالة حامل ورقائق من الحاويات منها والسماح لتتبخر الإيثانول (~ 1-2 دقيقة).
  5. استخدام ملاقط لوضع رقاقة المطلوب وجها حتى (أي الثقوب الوصول لأعلى) في حامل. رفع حاملمع رقاقة لeyelevel للتأكد من رقاقة والاستلقاء في حامل وتعديل إذا لزم الأمر مع ملاقط. هام: إذا لم يصلح الجهاز بشكل صحيح على حامله، هناك خطر في أن كسر أثناء الخطوات اللاحقة.
  6. المقبل، وضع بلطف الخزانات على حامل ومواءمتها مع لقطات. كن حذرا بأن الحلقات لا تسقط من فتحاتها أثناء هذه العملية.
  7. اضغط برفق لأسفل على الخزانات حتى ينقرون في مكانها. تأكد من أن كلا الجانبين من خزانات آمنة وأن رقاقة يبدو أن في الموضع الصحيح.

4. إعداد الخلية

  1. لخلايا ملتصقة (خطوط الأولية أو المنشأة): لوحة الخلايا 1-2 أيام قبل التجربة بحيث لا تزيد عن 80٪ متموجة في يوم التجربة.
  2. وضع الخلايا في التعليق (في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام ذات الصلة) وتهدف للتركيز التشغيل من 1.0 × 10 6 خلية / مل إلى 1.0 × 10 7 سلليرة سورية / مل. ملاحظة: إننا لم يلحظ تغييرات كبيرة في الأداء التسليم بسبب تركيز الخلية.
  3. مزج الخلايا والمواد تسليم المطلوب في أنبوب منفصلة للحصول على تركيز المواد المطلوبة للتجربة. هام: لأن طريقة التسليم وصفها يعتمد على نشرها لتسهيل التسليم، وتركيز المواد أعلى عائد أعلى التسليم. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام حل 1 ميكرومتر من المواد المطلوبة للمحاكمات الأولية. ويمكن بعد ذلك معاير هذا التركيز عليها في التجارب المستقبلية حسب الحاجة. تركيز أقل ذكرت المستخدمة مع هذا الجهاز هي 10 نانومتر 21.

5. عملية

  1. خليط من خلايا ماصة والمادية التسليم في خزان (التصميم الحالي لديه القدرة القصوى 150 ميكرولتر). ملاحظة: معظم التصاميم الجهاز هي عكسها تماما وبالتالي لا يهم اتجاه تدفق من خلال القنوات. قد يتم تحميل العينات في أي من الخزانات اثنين. إرفاق أنابيب الضغط إلى الخزان شغل وتشديد الجوز لضمان ختم الصحيح (ضيق الإصبع غالبا ما يكون كافيا).
  2. ضبط الضغط إلى المستوى المطلوب على منظم. هذا يتحكم في السرعة التي تنتقل عبر خلايا الجهاز. لاحظ أنه لا يبدأ تدفق الخلية حتى يتم الضغط على زر.

ملاحظة: في الأعمال السابقة، والنيتروجين أو الهواء المضغوط عملت بشكل جيد على قدم المساواة مع الغاز الناقل.

  1. رفع الجهاز إلى مستوى العين وتوجيهه بحيث السائل في الخزان مرئيا بسهولة. ملاحظة: تعقب العمود السائل لاغلاق النظام قبل أن يتم تفريغ الخزان.
  2. اضغط على زر للضغط الخزان ويبدأ تدفق الخلية.
  3. عندما يكون مستوى السائل حوالي 2 مم من قاع الخزان، سرعان ما تتحول المنظم ل0 رطل لوقف التدفق. هام: إذا كان واحد فشل في وقف تدفق قبل يتم إفراغ الخزان، واحد مخاطر إخراج عينة من collectioن الخزان. نلاحظ أيضا أنه إذا كان عمود السائل لا يتحرك بوتيرة ملحوظة، أو قد تباطأ نسبيا إلى حد كبير في معدل التدفق الأولي (مثل 3X أبطأ)، وربما انسداد الجهاز شنت ويحتاج إلى تبادلها. يمكن تشغيل الجهاز انسداد يؤدي إلى موت الخلايا أعلى.
  4. جمع الخلايا المعالجة من خزان المناسبة ووضعها في أنبوب جمع المطلوب / لوحة. هام: لا تمييع الخلايا التي تم جمعها في أي مخازن في هذه المرحلة، ذلك لأن الخلايا porated سوف تستمر في امتصاص المواد لمدة تصل إلى 10 دقيقة 20. بعد أن مرت هذه النافذة، وتمييع الخلايا في وسائل الاعلام المطلوب / العازلة.
  5. لجمع الخلايا المعالجة أكثر أو محاولة الظروف التجريبية البديلة، كرر الخطوات من 5،1-5،7 حسب الحاجة. نذكر بأن رقائق قابلة للعكس، وبالتالي عينات يمكن تركيبه في أي الخزان. ومن المؤكد أن تبادل رقائق حسب الحاجة إذا كانت تسد. تجاهل الأجهزة المسدودة.

6. التفكيك

  1. وضع كل جزء في حاوية التخزين المناسبة (المفصل في القسم 1).
  2. وضع الرقائق المستخدمة في وعاء منفصل للتخلص منها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يحتوي الشكل 1 تخطيطي وصفية للنظام التسليم ميكروفلويديك. أرقام 2A-B توضيح نتائج نموذجية من علاج خلايا هيلا مع تصاميم مختلفة في الجهاز وجود fluorescently مترافق 3 كيلو دالتون ديكستران 20. إذا تم اتباع الإجراء بشكل صحيح، سوف أداء النظام تكون حساسة لنوع الجهاز وسرعة التشغيل. لذلك، ينبغي للمرء أن تحسين هذه الظروف لتطبيق معين قبل الشروع في المزيد من التجارب المعقدة. في مجموعة من ظروف التشغيل موضح في الشكل، يبقى بقاء الخلية أعلى من 80٪، ومع ذلك، لا بد من ملاحظة أن المعلمات تسليم الأمثل (نوع المعالج على سبيل المثال غير مناسب) يمكن أن يؤدي إلى viabilities أقل من 30٪. وبالتالي يجب أن يكون الأمثل الجدوى والكفاءة في وقت واحد لتسليم أي نوع من الخلايا غير المبلغ عنها سابقا. إذا كان تصميم الجهاز غير مناسب لنوع الخلية المستهدفة، وسوف نرى النتائج واحدة بدءا من التسليم إلى أي عالية جالموت الذراع (على سبيل المثال 10٪ الجدوى). إذا كانت الظروف غير ملائمة التجريبية، على سبيل المثال المواد المستهدفة منضمة إلى سطح الخلية، واحد قد لا تكون قادرة على قياس تسليم بدقة بأنه إشارة ملزمة سطح يمكن أن تحجب إشارة حشوية.

أرقام 2C-د توضيح الأسلوب المفضل لدينا لقياس كفاءة التسليم في غضون السكان الخلية الحية. والمقصود حالة التحكم في الشكل 2C لتعكس كل سطح ملزمة والآثار endocytotic كما تتعرض الخلايا لتسليم المواد على الأقل طالما أن الحالات المعالجة. يتم تعريف السكان الخلية كما القى المنطقة غير المظللة بحيث 1-5٪ فقط من السكان السيطرة يندرج ضمن تلك المنطقة. نلاحظ أن أنشأت العمل السابقة التي تسليم في هذا النهج ليس بوساطة الإلتقام 20. توزيع المزدوج الذروة لاحظ في المثال تسليمها ليس هو من سمات النظام بالضرورة ونحن حلاحظ افي توزيعات أكثر وأقل موحدة لظروف تجريبية مختلفة.

الشكل 1
الشكل 1. chematic S من نظام كامل واجهة لأجهزة ميكروفلويديك. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. نتائج ممثلة مع خلايا هيلا 20 أ) كفاءة توصيل وب) بقاء الخلية من خلايا هيلا تعامل من قبل 3 تصاميم مختلفة في الجهاز وجود سلسلة الأزرق مترافق 3 كيلو دالتون ديكستران (0.2 ملغ / مل). في هذه التجارب، ليالي خليةكان olution بتركيز 10 6 خلايا لكل مليلتر في برنامج تلفزيوني يحتوي على 3٪ مصل بقري جنيني و 1٪ pluronics F68. وقد تم قياس الجدوى من قبل يوديد propidium تلطيخ من الخلايا الميتة والنتائج تظهر لتسليم الخلايا الحية فقط. تم تشغيل جميع نقاط البيانات في ثلاث نسخ، وتمثل أشرطة الخطأ 2 الانحرافات المعيارية. ج) ممثل الرسم البياني لعنصر تحكم التجريبية حيث تعرضت خلايا هيلا لتتالي الأزرق مترافق 3 كيلو دالتون ديكستران على الأقل على نفس القدر من الوقت كحالة جهاز المعالجة. د) حالة المقابلة حيث صدرت الخلايا من خلال الجهاز لتسهيل الولادة. يتم تعريف جزء من السكان الخلية الحية التي هي في المنطقة غير المظللة في الرسم البياني، والسكان 'تسليم'. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قد تحتاج بعض جوانب الإجراءات التجريبية وصفها (أي عوامل أخرى من تصميم رقاقة وسرعة التشغيل) ليكون الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا والمواد التسليم يتم تطبيق نظام ل. المناقشة التي يلي عناوين بعض العوامل الأكثر شيوعا التي يجب مراعاتها عند تصميم التجارب.

لتحسين إشارة لتسليم مركبات fluorescently المسمى، ويحتاج المرء لمعالجة مصادر مضان الخلفية. السطح ملزمة والإلتقام، على سبيل المثال، يمكن معالجتها عن طريق غسل الخلايا 5-10 دقيقة بعد الولادة لإزالة المواد الزائدة قبل الثقافة أو مزيد من المعالجة. إذا انتخاب للتخلي عن خطوة الغسيل، قد يكون من الأفضل لتمييع الخلايا المعالجة بنسبة 5-10X في وسائل الإعلام المطلوب لخفض تركيز المواد المستهدفة في حل المحيطة، وبالتالي خفض معدلات endocytotic. في بعض الحالات، للتسليم سبيل المثال البروتين، واحد قد تجد أنه من الضروري لمنع بنشاط المعال الخليةم (على سبيل المثال باستخدام أونلبلد ألبومين المصل البقري) لتقليل ملزم غير محددة من المواد التسليم. في تطبيق معين، وإذا كانت كثافة مضان القضية دون علاج، كما يقاس التدفق الخلوي، هو أقل من عقد واحد من أكثر سيطرة الإلتقام ثم السطحية قد تكون ملزمة / الإلتقام قضية. نلاحظ أن القضايا مع إشارة الخلفية ذات الصلة فقط للكشف الفلورسنت مباشرة من المواد التسليم، المقايسات الفنية (مثل إعادة برمجة الخلية) وعادة ما تكون غير متأثر كما endocytosed أو مواد ملزمة السطح غالبا ما تكون غير نشطة.

لتحسين قابلية الخلايا بعد العلاج، ويحتاج المرء لتقليل كمية من معالجة ما بعد التسليم. فمن المستحسن أن واحدا تجنب الطرد المركزي المفرط أو غسل الخطوات ونقل الخلايا إلى وسائل الإعلام المرجوة منها في حاضنة 5-10 دقيقة بعد الولادة كاملة. في خطوط ملتصقة، يتم الخلايا غالبا ما التزمت بالكامل وتقسيمها في غضون 24 ساعة بعد تلقي العلاج. كما ناقش السابقiously 20، ونحن لم يلاحظ أي على المدى الطويل آثار جانبية من استخدام هذه التقنية.

الأجهزة ميكروفلويديك المستخدمة في هذا النظام تسليم عرضة للانسداد مع مرور الوقت. السدادات غالبا ما تشكل في انقباض كما هو أضيق الميزة على الجهاز. يمكن أن يكون سبب انسداد بواسطة الخلايا التالفة أو الملوثات البيئية. تأثير هذا الأخير يمكن التقليل من خلال ضمان بيئة نظيفة، بيئة خالية من الغبار لتشغيل الأجهزة (مثل مجلس الوزراء بالاضافة الى الحفاظ على سلامة الأحيائية). للخطوط الخلايا، نوصي خلايا الركض 1-2 أيام قبل التسليم وذلك للحد من وجود حطام خلية في التعليق الناتجة عن ذلك. عند تشغيل الجهاز، يجب على المرء أن يضع في اعتباره معدل التدفق الحجمي السائل في الخزان. في حالة انخفاض معدل التدفق إلى أقل من ثلث سعره الأولي، الجهاز قد تسبب موت الخلايا المفرط، وينبغي أن يتم تبادل، أو عكس اتجاه تدفق. ويمكن أيضا أن القضايا انسداد المحتملة mitigated عن طريق تمرير تعليق الخلية من خلال 40 ميكرومتر شبكة مصفاة الخلية. هذه العملية تضمن تعليق خلية واحدة وبالتالي منع السدادات المحتملة من تشكيل في والأقسام معدل التدفق المنخفض على نطاق أوسع من الشريحة.

عند تصميم التجارب للمواد تسليم مختلفة، لا بد من حساب لحجم المواد المستهدفة وتركيزه. كما تعتمد هذه التكنولوجيا على نشر السلبي من المواد عبر غشاء الخلية تعطلت، فإن التدرج التركيز المولي ونصف قطرها الهيدروديناميكية من المواد تسليم تحكم معدل نقل الجماعي - على افتراض الاضطرابات غشاء هي كبيرة بما يكفي لاستيعاب المواد. بالتالي فمن المستحسن استخدام تركيزات عالية المولي (على سبيل المثال 1 ميكرومتر) من المواد المستهدفة كبيرة بالنسبة إلى أصغر أجزائها مضادة. وقد أثبتت هذه التقنية فعالة تسليم بتركيزات منخفضة تصل إلى 10 نانومتر في حالة الكم تسليم 21 نقطة. وعلاوة على ذلك، فإن الأسلوب هو نيعتقد التمديد لاتزال محدودة بسبب طبيعة المواد تسليم الهدف إلا في سياق حجم المواد وانتشارية (أي المواد انتشارية منخفضة سيكون أقل كفاءة وتسليم المواد أكبر من حجم الاضطرابات ربما لا يمكن أن يدخل السيتوبلازم).

وقد بينت الدراسات في إعادة برمجة الخلية وتسليم الكم نقطة من نقاط القوة النسبية للنهج الضغط الخلية إلى التثقيب الكهربائي. استنادا إلى الفهم الحالي للآليات التعطيل في غشاء هذه التقنيات اثنين، يبدو أن عصر الخلية لديه ميزة كبيرة في التطبيقات التي تنطوي على البروتينات والجزيئات الصغيرة، والمواد النانوية 20،21. التباين بين الطريقتين في التطبيقات التي تنطوي على الأحماض النووية (والتي اتهم غاية بالمقارنة مع المواد المذكورة أعلاه) غير واضح.

هذا النهج ميكروفلويديك لتسليم تعتمد على تعطيل الميكانيكية للغشاء الخلية لتسهيل نشر السلبي من المواد داخل الخلية، ولقد ثبت أن تكون قابلة للتطبيق لمجموعة من أنواع الخلايا 20. هذا النظام هو الآن في المناسبة الرئيسية لإيصال عصاري خلوي من أي مواد تقريبا إلى ما يقرب من أي نوع من الخلايا. نعتقد انهم أكثر وضوحا مزايا النظام في الحالات التي تنطوي على صعوبة تقليديا ل transfect الخلايا الأولية (مثل المناعة والخلايا الجذعية) والمواد تحديا تقليديا (مثل البروتينات، ونقاط الكم، أنابيب الكربون النانوية، والحمض النووي الريبي). وأكد المحتملة المذكورة آنفا في تطبيقات الخلايا المناعية وساق من قبل أوجه القصور في طرق التسليم التقليدية في معالجة هذه أنواع الخلايا. ومع ذلك، فإن النظام قد تحتاج إلى مزيد من التحسين لتسهيل توصيل الجينات عن طريق ناقلات البلازميد لأن هذه التطبيقات تتطلب تسليم إلى النواة. وباختصار، فإننا نعتقد أن النهج تشوه ميكروفلويديك لتسليم يحتمل أن معالجة العديد من التحديات القائمة لتسليم داخل الخلايا. التنفسيم الاستقلال من النواقل الكيميائية أو المجالات الكهربائية تمكن تطبيقه قوية لمجموعة من الدراسات. يجب أن الإرشادات المقدمة هنا تمكين أي الباحثين المهتمين للعمل هذا النظام بشكل مستقل وتكييفه لأغراض أبحاثهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفين أرمون Sharei، روبرت لانغر، وكلاوس ينسن F. هي مساهمي الشركة SQZ التكنولوجيات الحيوية التي تنتج الأجهزة ميكروفلويديك المستخدمة في هذه المقالة.

Acknowledgements

نشكر T. Shatova للمناقشة مفيدة على التصميم التجريبي وتحليل البيانات. المساعدة والخبرة من G. باراديس، واعترف أفراد التدفق الخلوي الأساسية في معهد كوخ، وموظفي مختبر التكنولوجيا مايكروسيستمز في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا بامتنان. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EB011187 RC1-02، DE013023، DE016516، EB000351، وجزئيا من قبل المركز الوطني للسرطان معهد السرطان دعم (كور) المنح P30-CA14051 وMPP-09Call-انجر-60.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27, (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats