电池挤压作为一种强大的,微流控细胞内传送平台

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
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Bioengineering

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Summary

细胞的快速机械变形已成为细胞内输送大分子和纳米材料的一种很有前途的,矢量-free方法。这个协议提供了关于如何使用该系统进行范围广泛的应用中的详细步骤。

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Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

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Abstract

细胞的快速机械变形已成为细胞内输送大分子和纳米材料的一种很有前途的,矢量-free方法。这种技术已经显示潜在解决先前具有挑战性的应用;包括,输送到初级免疫细胞,细胞重编程,碳纳米管,量子点传递。这个矢量的无微流体平台依赖于细胞膜的机械破坏,以促进胞内递送的靶材料制成的。本文中,我们描述了用于这些微流体装置,包括装置组件中,细胞制剂,和系统操作的详细方法。这种交付方式需要的设备类型和操作条件对以前未报告应用程序的简短优化。提供的说明书是一般化到大多数细胞类型和传递材料作为本系统不需要专门的缓冲器或化学修饰/共轭的步骤。这项工作也提供的建议,关于如何提高设备的性能和无故障的拍摄与堵塞,低输送效率和细胞活力的潜在问题。

Introduction

递送大分子到细胞的细胞质中的治疗和研究应用中的关键步骤。纳米颗粒介导的递送,例如,已经显示出在基因治疗1,2潜力,而蛋白质递送是在临床3和实验4的设置影响细胞功能的一个有希望的途径。其他材料,如小分子药物,量子点,或金的纳米粒子,是在应用范围从癌症治疗5,6至细胞内标记7,8,和单分子跟踪9的兴趣。

细胞膜主要是不可渗透的大分子。许多现有技术使用的聚合物纳米颗粒10,11,脂质体12,或化学修饰13,以促进膜破裂或内吞递送。在这些方法中,输送效率和细胞存活率通常是依赖于次结构Ë目标分子和细胞类型。这些方法可以在结构均匀的材料,例如核酸的递送是有效的,但通常不适合用于多结构不同的材料,如蛋白质14,15和纳米材料7的交付。而且,大多数这些方法依赖于核内体破坏机理是经常效率不高,因而留下被困在囊泡结构16多的材料。最后,往往与建立的细胞系使用而开发的方法并不很好的转化为原代细胞。

膜穿孔的方法,如电穿孔17,1819声孔效应,在某些应用中有吸引力的选择,但是,它们是已知会引起低细胞存活率,并且可以通过目标传递材料的电荷来限制。

细胞的快速机械变形,微流体方法来交付,最近有demonstrATED其优于目前的技 ​​术在细胞重编程20和纳米材料的输送管21的范围内。这种方法依赖于机械破碎Ø细胞膜,促进细胞内传递的存在于周围的缓冲材料。该系统已经证明使潜在的挑战先前的细胞类型( 原发性免疫细胞和干细胞)和材料( 抗体和碳纳米管)。本文中,用于细胞内递送的目标大分子的这些设备的一般操作进行说明。该过程推广到大多数细胞类型和交付的材料,但是,它是建议一所进行的条件一个简短的优化,详情载于我们先前报道的设计准则20,对任何以前未报告的应用程序。迄今为止,该系统已被​​成功地用于RNA,DNA,金纳米颗粒,量子点,碳纳米管,蛋白质的递送s和葡聚糖聚合物20,21。

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Protocol

1。存储

  1. 存储水库,持有人,O型圈和微流体装置中70%的乙醇。使用容器( 瓶子或烧杯中),有一个盖子,以防止蒸发和污染的灰尘或颗粒外。放置设备在一个容器(1),水库和O形环在第二容器(2),和持有者在第三(3)。

注意:对于存储的使用70%乙醇中的是保持无菌。如果溶液的唯一成分是乙醇和水( 没有变性剂),所有的系统组件应该是完全兼容的,并且不会随时间降解。

  1. 改变容器(2)乙醇溶液(3)每次使用,以避免交叉污染整个实验和最大限度地减少不必要的颗粒,可能会导致堵塞的面前。

2。实验准备

  1. 这里的容器(2)和(3)在超声浴中FO每次使用前ř5-10分钟。这有助于从以前的实验中去除任何污染颗粒。
  2. 干净的工作空间在生物安全柜中,用70%乙醇溶液。
  3. 将它们放置在生物安全柜内进行喷涂之前的所有材料(3容器和镊子),用70%乙醇溶液。

3。装配

  1. 在工作​​区设置下2-3低皮棉湿巾。
  2. 从他们用镊子取出容器塑料水库和设置他们的湿巾,方便的从内表面乙醇溶液蒸发。轻轻敲击表面上的储器或吹空气通过它们,以便除去乙醇溶液中。
  3. 将O形圈到他们对水库相应的插槽中。
  4. 从各自的容器中取出固定器和芯片,让乙醇挥发(约1-2分钟)。
  5. 使用镊子,将所需的芯片面朝上( 接入孔向上)的持有人。提高持有人与芯片眼平,以确保芯片平放在支架,必要时调整的镊子。重要提示:如果设备不在其持有人妥适,是有风险的,这将在随后的步骤中突破。
  6. 接着,轻轻地放在水库在支架上,并与剪辑对齐。要小心,O型圈在此过程中不属于他们的插槽。
  7. 轻轻向下按压水库,直到它们卡入到位。确保该储层的两侧是安全的,该芯片似乎是在正确的位置。

4。细胞的制备

  1. 对于贴壁细胞(初级或已建立的线):板的细胞在实验前1-2天,使得它们在实验的当天不超过80%汇合。
  2. 放置在悬浮细胞(在PBS中的或相关的媒体),和目标为1.0×10 6个细胞/ ml至1.0×10 7个CEL的操作浓度LS /毫升。注意:我们不是由于细胞浓度观察到交付绩效显著的变化。
  3. 混合单元和希望分娩材料在单独的管中,以获得所需的材料的浓度进行实验。重要提示:由于描述的传递方法依赖于扩散,以促进分娩,更高的材料浓度将产生更高的交付。如果可能的话,建议使用用于初始试验的所需材料的1μM的溶液。在今后的实验中根据需要这个浓度可以被滴定下来。与此设备使用的最低报浓度为10纳米21。

5。作业

  1. 细胞和交付材料的吸液管混合成一个水库(目前的设计有一个最大150微升的容量)。注:大多数设备的设计是完全可逆的,因此流过通道的方向并不重要。样品可装入任一两个水塘。 连接高压油管,以填充水库和拧紧螺母,以确保适当的密封(手指紧往往是足够了)。
  2. 调节压力以在调节器所需的水平。这个控制着细胞通过设备行进的速度。需要注意的是信元流不启动,直到按钮被按下。

注:在先前的工作中,氮气或压缩空气已制作同样作为载气。

  1. 提高设备到眼睛的高度和方向,使在储存器中的液体是很容易看见。注:追踪液柱切断系统的贮存器被排空之前。
  2. 按下按钮加压水库,并开始信元流。
  3. 当液面是从贮存器的底部大约为2毫米,迅速转动调节到0 psi至停止流动。重要提示:如果其中一个发生故障停止流动水库被清空之前,一是风险自收藏品弹出样品Ñ​​水库。还要注意的是,如果流体柱不动以可观的速度,或者减慢基本上相对于其初始流速( 例如,3倍慢)时,车载装置可能是堵塞并需要更换。经营堵塞设备可以带来更高的细胞死亡。
  4. 从适当的水库收集处理后的细胞,并将其放置在所需收集管/板。重要提示:不要稀释的细胞收集在任何缓冲区在这个阶段作为porated细胞会继续摄取材料长达10分钟20。在此之后的窗口已经过去了,淡化所需的介质/缓冲细胞。
  5. 根据需要5.7 - 收集更多的处理过的细胞,或尝试不同的实验条件下,重复步骤5.1。回想一下,这些芯片是可逆的,因此,样品可以安装在任一油箱。请务必根据需要,如果他们堵塞交换芯片。丢弃堵塞设备。

6。拆卸

  1. 将每个部分在适当的储存容器(第1节详述)。
  2. 将使用的芯片在处置一个单独的容器。

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Representative Results

图1包含微流体输送系统的一个说明性示意图。 图2A-B示出了从在荧光共轭3 kDa的葡聚糖20的存在下处理的HeLa细胞与不同设备设计的典型结果。如果程序正确执行,系统的性能将是设备类型和运行速度敏感。因此,人们必须在更复杂的实验之前,优化这些条件,对于给定的应用程序。在图中所示的操作条件的范围内,细胞活力保持在80%以上,但是,必须注意的是次优的输送参数( 例如不适当的芯片类型)可能导致低于30%的存活率。因此,可行性和交付效率必须同时优化了任何以前未报告的细胞类型。如果设备的设计是不恰当的靶细胞类型,一会看到结果轻则无法传递到高CELL死亡( 10%的可行性)。如果该实验条件不合适,例如结合至细胞表面上的靶材料,人们可能不能够测量准确递送作为表面结合信号可以掩盖胞质信号。

图2c-D示出了用于测量活细胞群内递送效率优选方法。控制的情况下在图2c是为了反映所有表面结合和内吞作用的细胞暴露于输送材料,至少只要治疗的病例。递送的细胞群被定义为无阴影区域,使得只有1-5%的对照群体的落在该区域内。请注意,以前的工作已经确定,交付这种做法是不通过内吞作用介导20。的在递送例如观察到双峰分布不一定是该系统的特征,因为我们ħ大街观察不同实验条件越来越少均匀分布。

图1
全系统及其接口的微流体装置如图1出来的,S电气原理。 点击这里查看大图

图2
图2。与HeLa细胞中有代表性的结果20。一个 )发送效率和b)细胞由3个不同的设备的设计中级联蓝共轭3 kDa的葡聚糖(0.2毫克/毫升)的存在下处理的HeLa细胞的生存能力。在这些实验中,单元S辨率是在每毫升10 6个细胞在PBS中含有3%胎牛血清和1%F68普流罗尼的浓度。生存能力是由死细胞和交付成果碘化丙啶染色法检测显示只活细胞。所有的数据点以一式三份运行,并且误差条表示2,SDS c)一个代表直方图的实验控制其中的HeLa细胞暴露于级联蓝共轭3 kDa的葡聚糖的时间至少相同量的装置处理的情况。 d)如该细胞通过设备以方便运送通过了相应的案例。活细胞群,是在直方图的非阴影区域的部分被定义为'交付'人口。 点击这里查看大图

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Discussion

所描述的实验程序( 因子大于芯片的设计和操作速度等)的某些方面,可能需要根据系统被应用到的细胞类型和传递材料进行优化。下面地址的一些设计实验时要考虑的最常见因素的讨论。

改善对荧光标记的化合物的输送信号,需要解决的背景荧光源。表面结合和内吞作用,例如,可以通过分娩后清洗细胞5-10分钟培养或进一步加工之前去除多余的材料解决。如果选出放弃一个洗涤步骤,这将是最好的由5至10倍于所需介质进行稀释处理后的细胞,以降低靶材料的浓度在周围的溶液中,从而减少细胞内吞率。在某些情况下,例如蛋白质递送,人们可能发现有必要积极地阻断细胞surfaCE( 例如,使用未标记的牛血清白蛋白),以尽量减少输送物质的非特异性结合。在一个给定的应用中,如果与未处理的情况下的荧光强度,如通过流式细胞术测定,比内吞控制一个十年低级然后面结合/内吞作用可能是一个问题。需要注意的是与背景信号问题只与直接荧光检测交付材料,功能性检测( 细胞重编程)通常是不受影响的内吞或表面结合的物质通常是无效的。

以改善细胞的治疗后存活,需要最小化处理后的输送量。我们建议,一个避免过度离心或冲洗的步骤和转移细胞进入自己理想的媒体在孵化器5〜10分钟后,即完成交货。在贴壁线,电池往往满粘,并在治疗后24小时分裂。如前所述上一页iously 20,我们没有观察到使用该技术的任何长期的副作用。

在这个传输系统中使用的微流体器件是容易堵塞随着时间的推移。木屐常形成于收缩部,因为它是在设备上的最窄特征。堵塞可通过受损细胞或环境污染物引起的。后者的效果可以通过确保清洁,无尘的环境中操作的设备( 例如,保持良好的生物安全柜中)被最小化。对于细胞系,我们来递送推荐传代细胞之前1-2天,以便最大限度地减少细胞碎片的所得悬浮液的存在。操作装置时,人们必须注意在储存器的流体的体积流率的。如果流速下降到下其初始速率的三分之一,该装置可能会导致过度的细胞死亡,并应被交换,或流动的方向相反。潜在的堵塞问题,也可以mitig通过将细胞悬液通过一个40微米的细胞过滤筛网ATED。这个过程确保单细胞悬浮液,从而防止潜在木屐从芯片的较宽,低流率部分在成形。

当设计实验对于不同的传送材料,一种必须考虑的目标材料的尺寸和它的浓度。作为这种技术横跨破坏的细胞膜依赖于物质的被动扩散时,摩尔浓度梯度和输送材料的流体动力学半径将管辖传质的速率 - 假设在膜的干扰足够大,以容纳材料。因此,这是建议使用的相对于其较小的计数器部分大型靶材高摩尔浓度( 1微米)。该技术已证明有效地提供在浓度低至10纳米的量子点递送21的情况。此外,该技术是正加时认为是由目标传递材料除在材料的大小和扩散的情况下的性质是有限的( 低扩散率的材料将具有较低的递送效率和材料比中断的大小可能不能进入细胞质)。

有研究细胞重编程和量子点传递出的细胞挤压的方法相对于电穿孔的优势。基于这两种技术的膜破裂机制的当前认识,它会出现细胞挤压具有显著优点在涉及蛋白质,小分子和纳米材料20,21的应用程序。这两种方法在应用中涉及的核酸(其高度带电相比,上述材料)之间的对比是不清楚的。

这种微流体方法递送依赖于细胞膜的机械干扰促进材料的被动扩散进入细胞,并已被证明是适用于各种细胞类型20。因此,该系统是主要适用于胞浆交付的几乎任何材料,几乎任何类型的细胞。我们相信该系统的优点最为显着,涉及传统上难以转染的原代细胞( 例如,免疫细胞和干细胞)和具有挑战性的常规材料( 例如蛋白,量子点,碳纳米管,和RNA)的情况。在免疫和干细胞应用的上述潜在是由在解决这些细胞类型的传统给药方法的缺点强调。然而,该系统可能需要进一步的改善通过质粒载体以促进基因递送,因为这些应用需要递送到细胞核。综上所述,我们认为微流体变形的方法来传递有可能解决到细胞内传递现有的许多挑战。该系统·M的独立化学载体或电场使得其强大的应用到一系列的研究。本文提供的说明,应使任何有兴趣的研究人员独立操作这样的系统,适应了他们的研究目的。

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Disclosures

作者阿蒙Sharei,罗伯特·兰格和Klavs F.詹森是SQZ生物技术公司,生产在这篇文章中所使用的微流体装置的股东。

Acknowledgements

我们感谢T. Shatova的实验设计和数据分析的有益讨论。 G.天堂的援助和专门知识,流式细胞仪核心在科赫研究所,并在麻省理工学院微系统技术实验室的工作人员的人员表示感谢。这项工作是由卫生部资助RC1 EB011187-02,DE013023,DE016516,EB000351国家机构的支持,部分由美国国家癌症研究所癌症研究中心支持(核心)补助P30-CA14051和MPP-09Call - 兰格-60。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

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References

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