코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

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Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. J. Vis. Exp. (91), e51057, doi:10.3791/51057 (2014).

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Abstract

곤충의 생존 (예를 들면, 음식, 동료, 위협)에 대한 중요한 사건으로 그 자극을 연관의 경험을 통해 자극에 자신의 응답을 수정합니다. 곤충 두드러진 연결을 배우고이 사건에 관련이되는 여러 가지 행동 메커니즘이 있습니다. 그것은 농업을위한 유용 곤충을 지원하기위한 프로그램으로이 행동 가소성을 이해하는 것이 중요합니다. 이러한 이해는 질병 벡터와 해충의 역할을 곤충에 의해 만들어진 생물 의학 및 농업 문제에 대한 해결책을 발견하기 위해 사용될 수있다. 코 확장 응답 (PER) 조절 프로토콜은 그들이 인식하는 방법을 연구하고 꿀과 꽃가루 자원에게 생존을위한 식민지 요구 신호 꽃 냄새에 대해 배우고 50 년 이상 꿀벌 (아피스 mellifera이)를 위해 개발되었다. PER 절차는 여러 가지 중요한 생태 학적 엄청 연구를위한 강력하고 편리한 프레임 워크를 제공 채용행동 가소성의 nisms. 그것은 여러 가지 다른 곤충 종과 다른 행동 반사와 함께 사용하기위한 쉽게 적응할 수있다. 이러한 프로토콜들은 용이하게하거나 타겟 neuromodulatory 경로를 조작하기위한 전기 생리학 또는 영상화 통해 CNS에서 신경 활동을 모니터링하기위한 다양한 방법과 함께 사용될 수있다. 이 급속히 환경 스트레스, 독소 또는 농약으로 인한 동작에 치사량 효과를 검출하기위한 강력한 분석이다.

우리는 PER 프로토콜이이 절차를 사용하여 구현하는 간단 방법을 보여줍니다. 하나는 학생들을위한 또는 실험적인 치료의 효과의 빠른 분석을위한 실험실 운동으로 적합하다. 다른 하나는 행동 조절의 연구에 중요한 변수의보다 철저한 제어를 제공합니다. 우리는 hypothese 테스트하는 데 사용할 수있는 바이너리 예에서 / 아니오 대기 시간과 코 연장 기간 등 자세한 연속 변수에 이르기까지 행동 응답하는 방법을 몇 가지 조치를 보여의. 그리고, 우리는 그들이 처음 절차를 사용할 때 일반적으로 발생하는 연구자 일부 함정을 논의한다.

Introduction

많은 곤충 생태 학적으로 중요한 자극에 대해 배우고, 그들은 그들의 환경에서 새로운 예측 관계에 적응하기 위해 그 자극에 자신의 행동 반응을 변경합니다. 몇 가지 다른 메커니즘이 행동 가소성의 기초 (예, 비 연관, 연관 / 파블로프 및 조건화 / 1 악기). 소성 이러한 유형의 자극이나 행동이 식품의 발생, 친구, 또는 위험과 같은 중요 이벤트와 관련된 방법에 차이가 있습니다. 가소성이 양식을 이해하는 것은 신경계가 새로운 기억이를 인코딩 변경하는 방법에 대한 기초 연구에 매우 중요합니다. 그것은 작물 생산 (꿀벌) 또는 해충으로 하나, 또한 농업 적으로 중요한 중요한 질병의 벡터 (예를 들면, 체체 파리와 모기) 및 곤충 곤충의 적응 행동을 이해하는 것이 중요합니다.

어떤 ANIM에서 행동 가소성을 공부Al을 1 필드에서 달성 아닌 다수의 변수 위에 실험 제어 레벨을 요구한다. 그것은 더 제어 된 조건 하에서 사용될 수 있으며, 아직은 천연 조건 하에서 동작에 관련되는 강력한 에어컨 프로토콜의 개발을 필요로한다. 꿀벌 (아피스 mellifera이는) 행동 소성 3,4의 제어 분석을 수행하기위한 프로토콜을 개발하는 방법에 대한 훌륭한 모델입니다. 꿀벌의 코 확장 응답 (PER)은 꿀벌은 설탕 용액과 더듬이 자극에 대한 응답으로는 코를 확장하는 자연스러운 행동 반사입니다. 꿀벌은 꽃에서 꿀을 발견하면 정상적인 먹이를 찾아 다니는 행동을하는 동안, PER가 발생합니다. 다행히 꿀벌은 쉽게 실험실에서이 간단하고 쉽게 정량화 할 수있는 동작을 전시 할 예정이다. 이 제어 된 분위기에서, 연구하는 것이 가능하게,이 생태 학적으로 중요한 행동 5 영향 메커니즘. PER의 캘리포니아N 또한 소성 (6)을 기초 행동 및 신경 메커니즘을 나타 내기 위해 설계된 다양한 처리 조건 하에서 자극 인식과 학습과 기억을 조사하기 위해 에어컨 프로토콜 내에서 사용 될 수있다.

Kuwabara 7에 의해 처음 연구하기 때문에, PER 조절 널리 비 연관, 연관 및 꿀벌 팔에 행동 가소성의 기초 조작 적 메커니즘을 나타 내기 위해 사용되었다. 이러한 메커니즘은 자유롭게 비행하는 꿀벌 (9)의 연구에서 밝혀 동일합니다. 자유롭게 비행 꿀벌의 연구 달리 PER 컨디셔닝 프로토콜은 전기 생리학 10,11 또는 뇌의 살아있는 세포 형광 이미징 12-14과 결합 될 수있다. 또한 PER 프로토콜은 neur 같은 네트워크의 특정 구성 요소의 역할에 대한 가설을 테스트하기 위해 분자 유전 학적 또는 약리학 적 치료를 통한 신경 경로의 실험 조작을 허용omodulators (15, 16). PER 프로토콜은 또한 환경 조건뿐만 아니라 건강에 독소와 꿀벌 (17)의 꼴을 효율성의 치사 효과를 평가하는 중요한 방법을 제공하고 있습니다.

이 절차는 병렬이 악취 전달 방법을 설명한다. 방법 1 냄새와 크로스 보상을 제시 저렴하고 기술적으로 간단한 방법을 제공하는 냄새와 무조건 자극 (자당) 배달의 버전입니다. 이 방법은 기본 교육에 대한 좋은 및 자동화가 가능하지 않을 때. 그것은 교실이나 교육 기관에이 기술을 소개 할 수있는 좋은 방법입니다. 더욱 어려운 작업과 악취 인식, 학습, 또는 메모리의 결합을 포함하는 생리 학적 평가 실험 컨디셔닝 동안, 정확하고 정밀하게 자극의 개시, 지속 전달의 타이밍을 조절하는 것이 매우 중요하다. 가장 신뢰할 수있는 자극 납기, 악취 전달을 자동화하는 방법을 사용ND 보상 전달의 정확한 방법. 방법 2 악취 전달 및 더 정확한 크로스 전달을 자동화 사용한다. 이것은 기술적으로 더 복잡하고 방법 1보다 더 초기 설정이 필요하지만 크게 조절에 사용 자극의 타이밍과 양의 일관성을 증가시키고, 가능한 한 사용되어야한다.

Protocol

1 냄새 (조건 자극) 카트리지 설치

  1. 컨디셔닝 시험에 필요한 모든 다른 냄새에 대한 실험 셋업 여러 냄새 카트리지의 시작 부분.
    1. 악취 희석 냄새 카트리지 준비를위한 흄 후드를 사용합니다. 냄새가 실험실에 걸쳐 빠르게 확산하고 잠재적으로 조절하기 전에 냄새로 꿀벌을 노출하기 때문에 그 흄 후드의 외부 냄새 절대로 열지 병. 냄새 카트리지를 설정하는 동안 또한, 장갑을 착용하고이를 처리하는 동안 냄새로 꿀벌을 노출하지 않도록 철저하게 후에 씻는다.
    2. 각각의 냄새 카트리지가 명확하게 먼저 사용되는 냄새의 색상 코드 레이블이 표시되어 있는지 확인합니다. 카트리지에 남아있는 냄새가있을 수 있기 때문에 절대로 하나 이상의 악취 냄새 카트리지 (주사기 배럴 또는 플런저)를 사용하지 않습니다.
  2. 준비 악취 및 냄새 혼합물
    1. D로 헥산 또는 광유 중의 냄새를 희석esired 농도.
      NOTE : 냄새의 농도를 변경 또는 꿀벌 냄새를 감지하고 조절 관계를 알아 방법의 추가적인 측면의 조사를 허용 할 수있는 두 개 이상의 냄새 물질의 혼합물을 제시. 냄새 혼합물은 자연 후각 자극을 모방 여러 가지 냄새가 나는 등의 50:50 이진 혼합물처럼 간단하거나 복잡 할 수 있습니다. 악취의 농도를 감소시키는 것은 또한 작업의 어려움을 증가시킨다.
      1. 냄새는 카트리지의 재사용 (그림 2)와 고갈 될 것입니다. 고갈의 문제는 모든 10 ~ 12가 사용하는 새 카트리지로 전환 할 수 있도록 충분한 카트리지를 확인하지 않도록합니다.
  3. 냄새 카트리지 준비
    1. 방법 1
      1. 이 방법의 경우, 악취 카트리지 플런저의 고무 단부에 고정 된 여과지의 15mm 직경의 원이 20 ㎖ 플라스틱 주사기를 사용한다.
      2. 주사기에서 플런저를 제거하고 filte의 조각을 연결하는 고정 핀을 사용상기 플런저의 단부에 R 용지.
      3. 필터 종이에 악취의 10 μl를 놓고 주사기 배럴로 플런저를 다시 삽입 마이크로 피펫을 사용합니다. 주사기 배럴에 15 ㎖의 표시로 플런저를 밀어 넣습니다.
    2. 방법 2
      1. 이 방법의 경우, 1 공통 유리나 플라스틱 투베르쿨린 주사기 (또는 유사한 부피와 모양의 변성 피펫) 내부 여과지 스트립 및 악취 카트리지 주사기 배럴의 폭 단부에 고무 또는 실리콘 릭터와를 사용한다.
      2. 한 CC 투베르쿨린 주사기 배럴에서 플런저를 제거합니다. 주사기 배럴 냄새 카트리지의 몸이 될 것입니다.
      3. 주사기 플런저의 검은 색 고무 팁을 제거하고 고무 팁의 폐쇄 끝을 잘라.
        참고 :이 고무 링이 중간에 카트리지에서 그리고 절제된 꿀벌을 통해 냄새를 그릴 것입니다 분야에서 공기에서 흡입을 줄이기 위해 제한 역할을합니다. 다른 방법으로, 실리콘 튜브 (4.8 mm의 oute5mm 섹션으로 절단 R 직경) 릭터로 작동한다.
    3. 주사기 배럴 및 70 % 에탄올로 고무 / 실리콘 제한의 내부를 씻어 (이전 사용의 잔류 냄새의 많은 부분을 제거하는) 그들에게 자연 건조를 할 수 있습니다.
    4. 용지가 입구보다 1-2cm을 확장하도록 배럴의 넓은 구멍에 필터 종이 0.2 × 4cm 스트립을 놓습니다.
    5. 냄새는 주사기 배럴의 단부를 만지지 않고시키는 여과지 상 악취 3-10 μL를 배치하는 마이크로 피펫을 사용한다. 피펫 팁은 같은 냄새 재사용하지만 다음 냄새를 설정하는 신선한 팁을 사용할 수 있는지 확인 할 수있다.
    6. 여과지 튜브 내로 미끄러지도록 급격하게 상방 시린지 외통의 개구 폭을 돌려. 주사기 배럴의 넓은 구멍에 제한을 삽입합니다.
      1. 각각의 냄새 카트리지가 분명 처음에 사용되는 냄새의 색상 코드 레이블이 표시되어 있는지 확인합니다. 냄새 카트리지 (주사기 배럴 또는 restr를 사용하지 마십시오ictor) 하나 이상의 냄새를 들어, 이후에 잔류 냄새가있을 수 있습니다.
    7. 보풀이없는 조직의 단부까지 공, 70 % 에탄올에 담가, 철저히 카트리지의 외부에 잔류 악취를 제거하기 위해 카트리지의 외부 표면을 닦아 사용.

2 수집, 금지하고, 꿀벌 먹이

  1. 꿀벌 금지 마구 준비
    1. (모든 내부 직경 약 0.9 cm이며 1-2밀리미터 벽 두께가) 플라스틱 소다 빨대, 하드 플라스틱 튜브, 또는 가공 된 금속 튜브에서 꿀벌에 대한 간단한 접근 금지 하네스를 확인합니다. 수술을 포함하는 절차 건장한 하네스를 사용합니다.
    2. 튜브의 3cm 부분을 잘라. 그런 다음 부분적으로 하네스를 고정하는 동안 쉽게 장소에 꿀벌을 보유 할 수 있도록 하네스의 상단 1cm의 거리에 약 절반을 잘라.
    3. 덕트 테이프 0.2 × 6cm 스트립을 잘라 꿀벌 하네스, 복도의 한쪽면의 한쪽 끝에 부착무료 다른 쪽 끝을 ving.
  2. 일벌 수집
    1. 그들은 식민지에서 출발하기 전에 일시 정지로 식민지 입구에서 근로자를 수집 또는 그들이 구하고에서 복귀있다.
      참고 : 일벌 통해 크롤링하는 입구가 아래로 반환 노동자가 느려 그들은 식민지를 입력하기 전에 더 쉽게 캡처 할 수 있습니다 통해, 필요한 크기 구멍 와이어 메쉬의 조각을 배치.
    2. 그것으로 날아 때까지 꿀벌을 통해 섬광 유리 병을 놓습니다. 꿀벌이 병의 밖으로 비행하지 않도록 개관 수평 또는 뚜껑을 고정하는 동안 아래로 향하도록 유리 병을 잡습니다. 각 유리 병에 하나의 꿀벌을 놓습니다. 뚜껑을 적절한 가스 교환이 가능하도록 그 안에 구멍이 있는지 확인합니다.
    3. 그들은 병에서 보내는 시간을 최소화하기 위해 신속하게 벌을 수집합니다. 그늘에있는 작은 박스에 꿀벌과 유리 병을 보관하십시오.
    4. 실험실에 튜브 및 꿀벌 상자를 전송하고, 얼음 - 물 SL에 유리 병을 배치urry는 꿀벌까지 이동 중지합니다. 꿀벌이 움직이지되면 감기에 과다 노출을 방지하기 위해 즉시 얼음에서 병을 제거하고 금지 하네스에 꿀벌을 배치합니다.
      참고 : 꿀벌이 추위에 과도한 노출의 결과로, 움직이지 될 때 모니터 어렵 기 때문에 우리는 냉장고 나 냉동고에 꿀벌을 배치하지 않는 것이 좋습니다. 10 개 이상의 꿀벌를 활용하면 한 번에 얼음 - 물 슬러리에 단지 몇 꿀벌 옮긴다.
  3. 꿀벌을 제지
    1. 그냥 튜브의 맨 위의 절개 튜브의 부분과 머리를 향하도록 지느러미 흉부와 하네스에 꿀벌을 놓습니다. 그 입 부분이 튜브보다 클 수 있도록 조심스럽게 튜브에 가까운 벌을 누릅니다. 머리와 꿀벌의 등 쪽의 가슴 사이에 덕트 테이프의 스트립을 밀어 단단히 하네스의 측면으로 끝을 연결합니다.
      1. 확인 하네스에 테이프가 부드럽고 팽팽하게 확인하십시오. 더를 NotI이 없어야합니다꿀벌 하니스의 전면 및 테이프 및 테이프 사이에 간극이 ceable 하네스의 위에 눕혀한다. 차이가있는 경우 벌은 제대로의 코를 확장 할 수 없게되거나 탈출 할 수 있습니다. 또한, 꿀벌의 전면 다리 하네스의 전면과 덕트 테이프 사이에 돌출되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
  4. 컨디셔닝 간격으로 꿀벌과 먹이를 먹이
    1. 하네스 다음 약 30 분 - 꿀벌은 초기 설정에서 회복 한 후 - 꿀벌 (물에) 3-4 μl의 0.5 M 슈 크로스를 공급. 이 금액은 3 ~ 4 시간의 수유 - 투 - 컨디셔닝 간격으로 충분합니다.
      1. 일반적으로, 꿀벌 아직 간격을 생존 조건 관계를 배울 동기를 부여하기 위해 에어컨의 시작 부분에 충분히 배고픈 보장하기 위해 공급 및 공기 사이의 대기 시간 약 시간당 1 ㎕의 0.5 M 슈 크로스를 공급. 실험실에서 따뜻한 온도에서 또는 u 경우 유지슈 크로스의 농도가 다른 노래, 먹이 양 또는 그에 따라 시간 간격을 조정한다.
        참고 : 24 시간의 조절 간격 공급으로 조절이 시작하기 전에 모든 꿀벌이 0.5 일 M 자당 적어도 24 시간과 포만에 공급되어 있는지 확인합니다. 그들은 조절 프로토콜에 잘 반응하기에 충분한 동기를 부여하기 전에 실온에서 꿀벌은 약 24 시간이 필요합니다.
        참고 : 학습 성능 (18)을 줄일 수 조절시 사용 자당의 농도에 덜 민감 해지는 꿀벌을 방지하기 위해 조절시 보상으로 사용되는 농도보다 꿀벌 먹이를 자당 용액의 낮은 농도를 사용합니다.
      2. 멀리 떨어져 훈련 지역에서 지역에 꿀벌을 공급. 조절하기 전에 조절 상황에서 무조건 자극 (자당)에 노출되면 냄새에 후속 조절에 영향을 미칠 수 있습니다.
    2. 수유와 C 사이의 간격 동안onditioning 불필요한 교란을 방지하기 위해 실험실의 조용한 지역에 수조에 꿀벌을 배치합니다. 기관이 낮은 습도를 갖는 경우, 시간 간격 동안 젖은 종이 타월로 플라스틱 용기에 꿀벌 배치. 그들은 오랜 기간 낮은 습도에 노출 될 경우 벌들이 죽을 수 있기 때문에 이것은, 탈수를 방지 할 수 있습니다.
      참고 : 실험 내에서 하네스 및 공급 프로토콜을 변경하지 마십시오! 설정 및 꿀벌 먹이 꿀벌이 모두 정확히 같은 방식으로 처리 될 수 있도록 각 실험에 대한 조절을 시작하는 사이에 하나의 특정 시간 간격을 사용합니다.

3 컨디셔닝

  1. 자당 감도 테스트
    1. 조절을 시작하기 전에 몇 분, 0.5 M 자당 용액 (수유시 사용되는 것과 동일한 농도)의 작은 방울로 자신의 안테나를 터치하여 공급하는 꿀벌 '의욕을 테스트합니다. 그 테스트 중에 먹이를 허용하지 마십시오. 그들은 exte하여 응답 할 경우그들의 코 찾아내는 이들은 아마 배울 충분히 동기 및 프로토콜을 사용할 수있다.
  2. 실험 디자인
    참고 :이 프로토콜은 꿀벌 '학습과 기억 기능의 여러 측면을 조사하기 위해 학습 프로토콜의 광대 한 배열에 맞게 수정할 수 있습니다. 간 시험 간격, 간 자극 간격, 유형 및 농도와 냄새, 유형과 무조건 자극의 농도, 수와 시퀀스의 수를 주어진 시간에 훈련 된 꿀벌의 번호 : 조정할 수 많은 매개 변수 중입니다 시험 (그림 1, 표 1) 19 ~ 21. 각 조화 재판 정확한 프로토콜을 설계 할 때, 개인 일관성 간 재판 간격을 유지하는 것이 매우 중요하다. 꿀벌의 성능에 악영향을 줄 것이다 너무 길거나 일치, 너무 짧은 간 재판 간격입니다. 이 항목의 전체 치료에 대한 설명을 참조하십시오.
    참고 : 비의 더 신속하게 따뜻한 환경에있는 경우 작업을 배우게됩니다. 따라서, 교육 환경의 온도를 일관 따뜻한 (29 ~ 30 ° C 가능한 경우)를 유지한다.
  3. 냄새를 전달 (자극, 주방)
    1. 방법 1
      1. 냄새 전달 시스템 설정
        1. 그것은 안정적이고 작은 쪽이 꿀벌의 안테나에 직접 향하도록 악취 처리 필터에 용지 플라스틱 20 ML의 주사기를 탑재합니다. 15 ml의 시점에서 플런저를 설정하고 플런저가 쉽게 접근 할 수 있도록 주사기를 놓습니다.
      2. 냄새 자극을 제시
        1. 더듬이는 냄새 카트리지 정면으로 지적 각 시험의 시작 부분에서, 에어컨 분야에서 말뚝에 하네스에서 꿀벌을 배치합니다. 꿀벌은 냄새 자극하는 동안 시각적 환경에서 급격한 변화로 인한 혼란을 줄이기 위해 냄새 자극을 시작하기 전에 15 ~ 25 초 동안 경기장에 적응하자.
          1. 꿀벌이 조절 분야에 배치 된 직후의 냄새 카트리지에 응답하기 시작하면, 카트리지의 선단부에 냄새가있을 수있다. 70 % 에탄올에 적신 보풀이없는 티슈로 카트리지를 세척하여 오염 냄새를 제거합니다. 그래도 문제가 해결되지 않으면 카트리지를 교체합니다.
        2. 플런저가 완전히 4 초 이내에 우울되도록 일정한 속도로 주사기의 플런저를 누르십시오. 무조건 자극을 제시하기 전에 냄새로 꿀벌의 반응을 모니터링합니다.
        3. 각 시험 후, 꿀벌이 다른 15 ~ 25 초 동안 에어컨 분야에서 휴식 할 수 있습니다. 재판 다음 너무 빨리 꿀벌을 이동하면 크게 각 조절 재판의 효율성을 줄일 수 있습니다.
    2. 방법 2
      1. 냄새 전달 시스템 설정
        1. 공기 흐름 소스 및 유량
          1. 냄새 전달을위한 소스의 공기 흐름연구소가 함께 장착 된 경우, 수족관 폭기 펌프 또는 실험실 벤치 압축 공기 공급 장치를 사용합니다.
            NOTE : 전형적인 수족관 폭기 펌프는 400 ㎖ / 분에 가까운 풍량 (7 ㎖ / 초)을 가질 것; 4 초 냄새 자극을 통해, 공기의 28 ㎖를 1 ㎖의 카트리지를 통해 흐를 것이다.
          2. 공기 공급 유량을 조절하는 공기 공급 장치의 배관 라인에 유량계를 사용한다. 유속은 400 ml / 분까지 인 유량계를 조정. 별도 유량계와 악취 카트리지의 개방시의 유량을 확인한다.
          3. 플라스틱 배관 및 밸브의 시스템을 통해 냄새 카트리지로의 공기 흐름을 연결합니다.
            주 : 후술 타이밍 장치는 시험에서 적절한 시간에 밸브를 연다. 플라스틱 커넥터는 카트리지의 시린지 외통에 루어 타입 부착을 통해 악취 카트리지 기류 시스템을 연결.
          4. 기류에 관계없이 소스, MA 주기적 유량을 확인KE 확실히 줄은 그대로이고 유량은 원하는 속도로 유지된다.
      2. 자동화 냄새 배달
        1. 악취의 전달을 자동화하는 프로그래머블 로직 컨트롤러 (PLC)를 사용한다.
          참고 : PLC는 소형 스피커를 통해, (버튼을 눌러 시작) 프로그램을 시작 후 냄새 배달 공기 흐름을 6 초에 밸브를 열고 4 초 동안 개방 밸브를 유지하고, 소리 먹이 신호를 사운드 프로그래밍 냄새 자극 발병 후 3 초 자당을 제공하는 실험을 알리기 위해.
        2. 각각의 시험 중에 악취 자극 타이밍을 나타내는 작은 LED를 사용한다. 그들이 잘 볼 수 있도록 꿀벌 '광 수용체가 짧은 [자외선] 파장 이상 [레드] 파장에서와 향해 멀리 이동하기 때문에 가능하면 빨간색 LED를 사용합니다. 빛이 부주의 조건 자극이 될하지 않도록, 자신의 시야 밖에서, 뒤에 벌 아래에 LED 놓습니다.
          참고 : LIGHT 또한 PLC가 제대로 작동하는지 확인하는 데 도움이 테스트 시험 동안 꿀벌의 반응의 비디오 녹화를 분석하는 데 유용합니다.
      3. 배기계
        1. 꿀벌 과거의 공기를 끌어와 냄새의 각 프레젠테이션에 대해 별도의 기간을 유지하기 위해 에어컨 분야에서 악취 함유 공기를 대피하는 데 도움이 꿀벌 뒤에 배기 시스템을 설정합니다.
          NOTE : 실험실 진공 시스템이있는 경우, 진공 포트를 수정하고 컨디셔닝 경기장 피난에 필요한 공기를 공급하는 건조 튜브를 연결 도관. 진공 시스템이 없으면, 건조 튜브를 가진 라인에 수납 작은 전동 팬은 흄 후드 또는 윈도우를 통해 충분했다.
      4. 하루의 시작시, 악취 전달 시스템 및 배출 시스템의 전기적 및 공기 연결을 확인하십시오. 악취 전달 시스템에 스타트 버튼을 누르면 가압을 사이의 시간을 추적버튼을 열어 밸브 (조용한 클릭 한 후 LED 표시등이 켜집니다)와 큐는 무조건 자극을 제시 할 때 (신호음)이 소리를 할 때. 악취 카트리지에 부착 될 커넥터의 앞에 촉촉한 손가락을 배치하여 공기 공급을 확인한다. 밸브가 열려 만 강한 기류가 있어야한다. 확인 공기 흐름이 제대로 조절 경기장에서 공기를 대피 할 정도로 강력하게 배기 시스템의 개통에 보풀이없는 조직을 잡고 의해 배기 시스템을 확인합니다.
    3. 냄새 카트리지를 장착
      1. 배기 시스템의 바로 앞에 꿀벌과 냄새 카트리지의 위치를​​ 스탠드 수조에 또는 작은 유리 야에 하나 일부 점토를 놓습니다. 점토에 유리 냄새 주사기를 놓고 넓은 결국 개구가 꿀벌의 머리에서 지적되도록 조정합니다. 주사기의 끝은 꿀벌에서 1-2센티미터해야합니다. 이 범위 내에서 거리를 선택하고 일정.
      2. 안전하게 주사기의 좁은 간 유리 단부 위에 에어 배관 및 밸브 시스템에 카트리지를 연결하는 피팅을 배치.
    4. 냄새 자극을 제시
      1. 더듬이는 냄새 카트리지 정면으로 지적 각 시험의 시작 부분에서, 에어컨 분야에서 말뚝에 마구 벌을 배치합니다. 그것의 새로운 환경에 익숙해 질 수 있도록 냄새 자극을 시작하기 전에 15 ~ 25 초 동안 무대에서 꿀벌의 나머지 부분을 보자.
        참고 : 꿀벌 즉시 조절 경기장에 배치 된 후 냄새 카트리지에 대응하기 시작하면, 카트리지의 끝에 냄새가있을 수 있습니다. 70 % 에탄올에 적신 보풀이없는 티슈로 카트리지를 세척하여 오염 냄새를 제거합니다. 그래도 문제가 해결되지 않으면 카트리지를 교체합니다.
      2. 냄새 전달을위한 타이밍 메커니즘을 시작하려면 시작 버튼을 누릅니다. 자극 후 냄새로 꿀벌의 반응을 모니터링발병과 무조건 자극을 제시하기 전에.
      3. 각 시험 후, 꿀벌 초기 기억 형성을 허용하는 또 다른 15 ~ 25 초 동안 에어컨 분야에서 휴식 할 수 있습니다. 재판 다음 너무 빨리 꿀벌을 이동하면 크게 각 조절 재판의 효율성을 줄일 수 있습니다.
  4. 제공하는 자당 (무조건 자극)
    1. 방법 1
      1. 이 방법의 경우, 자당을 제공하기 위해 이쑤시개를 사용합니다.
        참고 : 나무 이쑤시개는 조건 자극에 꿀벌의 반응에 영향을 미칠 것이다 냄새가 수 있기 때문에 플라스틱 이쑤시개를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다.
      2. 자당 용액에 이쑤시개의 끝을 찍어, 그리고, 그것은 무조건 자극을 제시하는 시간이있을 때, 꿀벌의 앞에 이쑤시개를 잡고 벌 약 1 초 동안 이쑤시개에서 크로스를 핥아 할 수 있습니다.
      3. 스와의 발생을 방지하기 위해 정기적으로 이쑤시개를 교체crose.
    2. 방법 2
      1. 자당 전달 시스템
        참고 : 무조건 자극을 제공하는보다 정확한 방법은 정확하게 소량의 자당 보상 (마이크로 리터 10 분의 1)를 제공 할 수 마이크로 미터 주사기의 사용을 통해이다.
        1. 다시 최대한 주사기의 마이크로 바람. 자당 용액으로 마이크로 미터 주사기 배럴을로드합니다. 반드시 유리 부분에 기포가 없음을 확인하고 주사기를 조립한다. 시린지 외통의 좁은 단부에 배치하기 전에 수크로오스 용액과 바늘의 허브를 채운다. 반드시 바늘의 바늘 유체 세척 물 수크로오스 아니라 실제로 만들기 위해, 실험을 시작하기 전에 순방향 1-2 μl를 마이크로 미터 바​​람.
    3. 자당 프리젠 테이션
      1. 냄새가 제시되는 동안 약 2cm 벌에서 바늘의 끝을 잡고. 방지 교육 분야의 에지를 사용운동으로 주사기를 떨고 벌을 방해 할 수 있습니다. 그 또한 중간에 자당 냄새에서 꿀벌의 관심을 이동하기 때문에, 공급 신호의 기대에 너무 가까이 바늘을하지 마십시오.
      2. 꿀벌의 코를 확장 할 때까지 즉시 공급 신호가 소리로 가볍게 안테나를 터치 한 후 꿀벌에게 먹이를. 이 안테나 만 매우 가벼운 터치 또는 두를 필요로한다.
        1. 0.2 및 0.8 ㎕의 사이에 보상 금액을 사용합니다. 꿀벌 쉽게 무조건 자극 (초 ~ 1-2)에 할당 된 시간 내에 전체 방울을 소모한다. 꿀벌은 몇 초에 공급하지만, 완전히 소비 할 수없는 큰 방울에서 먹이를 "광고 무제한으로"사용하지 마십시오.
        2. 보상의 후속 프리젠 테이션 꿀벌의 반응을 줄일 수 안테나에서 생성 된 자당 살펴보십시오. 이 경우 공급 절차를 수정합니다.
        3. 악취의 정확한 페어링을 보장하기 위해큐 및 자당 보상 톤 후 가능한 빨리 꿀벌에 자당 용액의 방울을 제시해야합니다.
          참고 : CS (냄새)과 미국 (자당)의 발병 사이의 타이밍이 중요합니다. 이상적으로, 냄새 발표 및 자당의 발표는 간단히 중복해야합니다. 몇 초 이상은 CS의 끝과 미국의 전달 사이에 경과하면 에어컨 성능이 감소됩니다.

4 테스트

  1. 에어컨 사용 비 강화 테스트 시험에 이어 꿀벌 배운 얼마나 잘 평가 및 / 또는 조절 된 연결을 기억합니다.
    참고 : 조절 시험에서 성능 및 테스트 시련과 시험 냄새의 수의 목적에 대한 설명은 '꿀벌뿐만 아니라 비 강화 테스트 시험에 대한 응답'꿀벌 분석의 중요성에 대한 자세한 설명은 설명을 참조하십시오.
  2. 통합 시간
    1. 다음에어컨, 즉시 테스트 시험을 관리하거나 꿀벌 통합 기간 동안 휴식 할 수 있도록 중.
      NOTE : 통합 기간의 길이 조절과 테스트 사이의 시간 간격은, 실험의 목적에 의존 할 것이다. 목적은 학습의 차이 또는 단기 기억을 조사하는 경우, 테스트 시험에 꿀벌의 성능은 즉시 다음과 같은 컨디셔닝 후 몇 시간이 평가 될 수있다. 실험은 장기 기억 조사 참여하는 경우, 시험 시험은 에어컨의 끝 다음 최소 24 시간이 주어져야한다.
    2. 테스트 시험이 조화를 다음과 같은 이상 24 시간 인 경우, 시험 시험 전에 12 ~ 24 시간까지 이후 하루에 한 번 이상 에어컨을 다음 0.5 M 자당과 포만에 꿀벌을 공급합니다.
      1. 자신의 안테나를 감동에 더 이상 응답으로 자신의 코를 연장하지 않을 때까지 각각 여러 번 먹이 꿀벌 포만에 도달했는지 확인하려면자당과 전자. 그들은 포만에 도달하는만큼 40 μl를 소모 할 수 있습니다.
    3. 통합 기간 동안 자신의 desiccating 죽어을 방지하기 위해 가습 용기에 꿀벌을 유지합니다.
  3. 테스트 시험
    1. 테스트 용으로 만 새로 준비 악취 카트리지를 사용합니다.
      참고 : 테스트 자극 따라서, 시험, 냄새 및 개별 꿀벌 일관하고하지 않도록 인수에 사용되는 카트리지는 서로 다르게 상당히 결과의 일관성과 안정성에 영향을 미칠 수, 소모되었을 수 있습니다.
    2. 실험의 컨디셔닝 단계에서 사용되는 바와 같이 시험 동안, 동일한 시험 간 간격 및 다른 매개 변수를 유지한다.
    3. 보상의 존재, 조건 자극에 꿀벌의 반응을 변경 잠재적으로 조절 프로토콜 또는 치료의 미묘한 효과를 마스킹하기 때문에, 테스트 시험 동안 무조건 자극을 제시하지 마십시오.
    4. 모두의 비디오를 녹화하여 오테스트 시험 f를 나중에 냄새 (들)에 여러 측면에게 꿀벌의 반응을 측정 할 수 있습니다.

5 꿀벌의 반응을 기록

  1. PER의 진 (존재 / 부재) 점수
    1. 컨디셔닝 시험 중 및 테스트 시험 중 PER의 진 채점 시스템을 사용합니다. (+) 또는 (-) 등의 응답 점수; 이 처리 군 당 20-40 꿀벌의 샘플 크기와 분석의 많은 종류를 만족. 응답의 정확한 토폴로지는 22 복잡 할 수 있습니다. 그것은보고 긍정적 인 응답을 기준으로 점수를하기 쉬운을 설정하는 것이 중요합니다.
      1. 꿀벌 열린 턱의 끝을 연결하여 만든 선을 넘어 그 코를 확장 할 때 양 (+)으로 꿀벌의 응답 점수. 꿀벌이 냄새 발병 후와 오프셋 냄새 전에 코를 확장 경우에만 긍정적 인 반응을 이끌어 냈습니다.
      2. 네거티브 같은 벌의 응답 점수 (-)에는 전자가 없을 때코는 냄새 물질의 오프셋 (offset) 이후에 연장 된 경우에는 재판 중에 코의 xtension.
      3. 부분적인 응답을 점수를 시도하지 마십시오. 꿀벌의 행동에 미세한 차이를 확인하려면, 아래에 설명 된 영상 분석 기술을 사용합니다.
  2. 추가 PER 측정의 비디오 분석 (동영상 1)
    1. 냄새로 꿀벌 님의 답변 동영상을 분석하여 행동 테스트에서 추가 정보를 수집합니다.
      NOTE : 치료군 간의 PER의 존재 / 부재 점수에 차이가없는 경우에 특히 이러한 측정도, 냄새에 꿀벌 '응답 시험을 위해 더 높은 시간 해상도를 제공 할 수있다.
    2. 동영상을 녹화
      1. 항상 비디오 레코딩을위한 비 강화 테스트 또는 멸종 시험을 사용합니다. 보상의 존재는 코 확장의 지속 시간을 수정, 냄새로 꿀벌의 반응을 변경합니다.
      2. 교육 경기장 위의 삼각대에 비디오 카메라를 설정하고 꿀벌의 머리의 전면에 초점을 맞 춥니 때문에 안테나와 코 날카로운 초점입니다.
      3. 악취 발생 및 분석 중에 오프셋을 식별하는 데 사용하기 위해 비디오를 볼 수있는 꿀벌 뒤 영역에서 악취 자극 프레젠테이션을 나타내는 작은 LED 광을, 위치.
      4. 악취 발생하기 전에 20 초를 기록 시작과 냄새가 벌을 방해하기 전에 오프셋 후 최소 20 초 동안 녹음을 계속합니다.
    3. 비디오 분석
      1. 비디오의 특정 프레임 사이의 시간 간격을 측정하는 능력, iMovie와 나 파이널 컷 프로와 같은 비디오 편집 소프트웨어에 비디오를 업로드합니다.
      2. 악취 자극 (예를 들면, 10 또는 20 초)의 개시에서 시작하여 이산 시간 동안 냄새로 꿀벌의 반응을 분석한다.
      3. PER을 평가하기위한 다음과 같은 일반적인 측정을 사용하여
        1. 측정코가 (전술) 하악 - 투 - 하악 라인을 넘어 확장 된 총 시간입니다 코 확장의 기간.
          참고 : 꿀벌 확장하고 10 ~ 20 초 시간 창 동안의 코를 여러 번 철회 할 수 있습니다. 개별적으로 각각의 코 확장을 측정하고, 총 지속 시간을 계산합니다. 각 코 연장 번호와 지속 시간을 분석하는 것은 또한 귀중한 정보를 제공 할 수있다.
        2. LED 표시등이 때, 악취 발생 사이의 시간입니다 코 확장하고, 제 1 코 확장의 대기 시간을 측정한다.
        3. 개수 및 취제의 개시, 연장 제, 또는 다른 타이밍 파라미터에 대한 상대 시간 Glossal 확장자.
        4. 또한 특이한 냄새 중심의 변화를 보여 더듬이 운동 (23)를 추적 할 수 있습니다.
          NOTE : 영화 1에서 더듬이 더듬이 움직임은 움직임의 변화를 설명하기 위해 비디오 추적 소프트웨어를 추적 된 I냄새 자극에 N 응답.

Representative Results

우리는 상술 PER 프로토콜의 사용이 예를 제시한다. 방법 2의 첫 번째 예를 만들어 사용은 꿀벌이 CS 5,24,25으로 사용까지 냄새 분자 유사성의 기능으로 다른 냄새를 인식하는 방법을 공부합니다. 두 번째 방법은도 1 및 연구 실험실에서 실험 컨디셔닝 PER 사용하기 시작해야 할 때 취해주의 일부의 사용의 일례이다.

이와 같은 한 연구는 13 또는 전기 생리가 26를 분석하여 영상화와 함께 꿀벌과 나방의 후각 '지각 공간'을 설명하는 데 사용되어왔다. 꿀벌은 (N = 20) (12) 앞으로 페어링 조절 시험 (그림 3A)을 통해 자당 보강 취제 데카을 연결하는 조절되었다. 꿀벌의 약 10 %는 정상 1 심에 '자발적으로'반응했다. 후 그 responde 비율꿀벌의 100 % 다섯째 시행 이후의 모든 재판에 응답 할 때까지 다음 몇 가지 실험을 통해 증가 거라고. 몇몇 연구는 응답의 증가는 몇 가지 중요한 관리 절차 3에 앞으로 페어링 상태 (그림 1) 상대에 고유 한 것으로 나타났습니다. 취득 단계 후, 각 꿀벌은 냄새 CS에 체계적으로 분자 구조에 CS 달랐다 여러 가지 다른 냄새 물질에 대한 노출을 포함 비 강화 테스트 일련의 실험 (그림 3B)을 실시 하였다. 꿀벌은 CS에 가장 강하게 반응했다. 기타 방향제 그들의 응답은 CS와 같은 적어도 취기에 낮은 반응으로, 구조 체계적인 변화의 함수로 감소 하였다.

도 4에서, 학생들은 처음으로 알게되는 최근의 공방 결과로부터, 어떻게 예시되어 사용 방법 1 꿀벌을 컨디셔닝하도록. 학생 전나무 t 자당 보강 (그림 4A)와 앞으로 페어링 methycyclohexanone (MCH) 또는 옥탄 올 (10 월)에 의해 꿀벌을 조절. 퍼센트 응답은 1 심에서 낮았다과 꿀벌 냄새 크로스 연결을 배운 것을 나타내는, 이후 시험에 증가했다. 꿀벌 학생들의 서로 다른 그룹에서 컨디셔닝 연결을 배운 정도의 차이가 있었다. 우리의 경험에 의하면, 이러한 종류의 차이는 방법 (방법 1)에서 부정확 한 요소 또는 실험자의 교육 수준, CS로서 사용 하였다 냄새에 기인 할 수있다. 세번째 경우, 성능은 빠르게 실험자 '증가 경험보다 일관된다. 에어컨 후 각 꿀벌은 각각의 냄새로 두 번 테스트되었습니다. 10월 또는 MCH의 앞으로 페어링을 조절했다 꿀벌의 그룹에서, 응답으로, 에어컨 냄새 (그림 4B)에 대한 강한 기대했다.

천만에 "> 10월에 페어링을 앞으로 경험 꿀벌의 두 번째 그룹은 냄새 OCT를 이전 버전과의 크로스와 결합 된 다른 그룹에 병렬로 조절되었다. 이전 버전과의 페어링이 입증하는 관리 절차의 여러 종류 중 하나입니다 해당 응답의 증가 이전 버전과의 페어링, 자당 미국과 냄새 CS는 그림 1에 나타낸 것과 반대 순서로 제시 등의 과민 반응에서 비특이적 자극으로 페어링을 전달할 특정하고 다른 프로세스로 인해되지 않습니다.. 취득 데이터를 이전 버전과의 페어링에서 아르 CR은 수크로오스 테이션 후의 냄새 CS의 프리젠 테이션을 부여 획득 할 수 없기 때문에 도시되지. 연관 컨디셔닝 예측되는 바와 같이, 10월에 응답 수준은 후방 기 (도 4C)에 순방향 페어링 그룹 상대적으로 높았다.

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그림 조절을위한 실험 설계의 1 다이어그램을 앞으로 페어링을 사용.보기이 그림에서 사용하는 용어의 정의는 표 1을 참조하십시오. (A) CS (냄새) 앞에 미국 (크로스 / 수용액)와 겹칩니다. 표시된 CS와 미국의 관계는 조화 꿀벌과 나방에 최적입니다. 그러나 최적의 ISI는 조절 프로토콜과 동물의 종 하나에 따라 달라질 수 있습니다. (B) 고장 및 CS, CR, 미국, UR의 상대 타이밍을. 미국의 발표 이전 또는 비 강화 '시험'시험 중 하나를 발생하는 CR 실험 프로토콜에 따라 측정 한 것입니다.

그림이
도 2의 카트리지 재사용 냄새 고갈. 이들 데이터의 경우, 악취 카트리지이었다셋업 헥산으로 텍스트에 기술 된 바와 같이. 헥산 일반적 PER 연구에서 CS로 사용된다; 그러나, 고갈의 실제 속도는 냄새와 용매에 따라 달라집니다. 카트리지는 4 초 (40 용도와 동일 할 표준 실험에서 5 꿀벌 / 재판 가정) 8 시험을 통해 모든 분에 대해 한 번 사용되었다. PER 실험에 대한 상대적 표준이었다 표시된 용제에 희석, 2.0 M (A) 및 0.2 M (B)이었다. (A는, B) 악취 제 고상 위에 흡착 여덟째 시험 후에 채취 다음, 가스 크로마토 그래피에 탈착 된 마이크로 추출 (SPME) 섬유. 피크에서 상대 지역은 모두 용매에 대한 여덟째에 대한 첫 번째 시험 상대 후 모두 농도에 대한 더 높았다 (윌 콕슨이 일치하는 쌍으로 서명 순위 테스트 P <0.05 [*] 이상), 적은 냄새를 카트리지에서 전달 된 것을 알 수있는 카트리지 횟수. (C, D) 단지 여덟째 TR 보여주는 동일한 데이터를 사용되었던 후에 확장 y 축으로 IAL. 이는 공핍 광유 헥산 상대적인 약간 큰, 오직 낮은 농도의 것을 나타낸다.

그림 3
그림 3 수집 및 테스트 CS 및 공기에 대한 방법이 아니라 데카 사용. (A) 시험 별 시험 12 앞으로 페어링 시험 (그림 1) 이상 반응 (CR). 데이터는 5 꿀벌 각각의 네 그룹으로 조절 N = 20 꿀벌에서 있습니다. ISI는 3 초이고 ITI은 6 분이었다. (B)의 탄소 사슬 길이 및 / 또는 카르 보닐 탄소의 위치에 의해 다르다 데카 악취를 이용한 비 강화 테스트. 냄새는 네 그룹에 걸쳐 무작위 직렬로 제시하고, CR의 소멸을 방지하기 위해 데카 날 (매 시험 2-3)로 보강 산재 시험 하였다.

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워크숍에서 그림 4 데이터는이 기간 동안 학생들은 (각각 23 명 및 15 GPS를 1과 2) 옥탄 올 단련 꿀벌의 세 그룹에서 방법 PER 1 (A) 취득 데이터를 사용하여 꿀벌을 컨디셔닝하는 훈련을받은 졸업 및 아세토 닐 (N = 10) (B) 모두 냄새와 비 강화 테스트 동안의 CR.; 네 그룹에서 무작위 시리즈에 제시된 시험. (C) 꿀벌 앞으로 쌍 한 두 그룹에서 모두 냄새와 비 강화 테스트 (GP 1, N = 23)와 한 뒤로 (N = 25) 짝.

용어 (약어) 정의 관련 예
조건 자극 (CS) 처음에 거의 또는 전혀 반응을 이끌어 미국을 신호 자극 냄새
조건 반응 (CR) 미국과의 관계 후 CS에 대한 응답 코 EXTENSION
무조건 자극 (US) 반응을 유도하는 중요한 생물학적 자극 자당 / 물 솔루션
무조건 반응 (UR) 미국에 대한 응답 코 EXTENSION
간 자극 간격 (ISI) 미국의 CS의 발병과 발병 사이의 시간 자당 간격 냄새
간 시험 간격 (ITI) 하나의 동물에 대한 연속 CS-US 상대 팀 사이의 시간 냄새에 냄새 (시험 N) (시험 N + 1) 간격

표 1 임으로 중요 용어. 협회의 다른 유형 있지만, CR과 UR이 같은 에어컨 PER은. 이러한 용어의 그림 1을 참조하고, CR과 UR이 다를 수 있습니다 반사.

영화 1. 이 냄새에 반응하도록 조정했다 후 PER을 수행하는 꿀벌의 비디오. 약 1.5 초 악취 발생 다음 꿀벌의 PER 응답을합니다. 추적 소프트웨어는 악취의 프리젠 테이션에 응답하여 더듬이 움직임을 매핑. 영상의 상부 우측 코너에 플롯 라인 더듬이 실제 움직임을 묘사한다. X (왼쪽)와 Y의 화면 표시 더듬이 움직임 아래쪽의 두 그래프 (오른쪽)의 좌표. 비디오에 표시된 그래프의 수직 라인이, 오른쪽, 조명 ON, PER 왼쪽, 표시 소등 및 후퇴 코끼리 코.

Discussion

이 프로토콜은 PER의 절차를 사용하여 조절을 위해이 신뢰할 수있는 방법을 제시했다. 다음은 성공적으로 27, 21을 사용되어왔다 여러 가지 방법이 있습니다. 우리는 지속적으로 신뢰성으로도 다른 실험자에 걸쳐, PER를 사용하는 모든 실험 연구에 대한 방법이 사용한다.

동일한 기본 절차는 다른 조절 자극과 다른 행동 반사의 사용을 포함하여 꿀벌과 연구의 많은 다른 종류에 적응하고있다. 또한 28, 29, 13,14,30 뇌에서 후각 인식과 기억의 생리 학적 상관 관계를 학습 차이의 유전 적 기초의 조사에 연결하고 한 행동 15,16,31의 조절 성 및 분자 유전 학적 기초 . 때문에 100 년 전 칼 폰 프리쉬에 의해 처음 연구를 시작 꿀벌에 후각 학습의 생태 학적 관련성의 고급 지식의 (17)의 치사 행동 미치는 영향을 조사하기 위해 농업 연구에 적용되고있다.

기본 절차는 또한 다른 종류의 문제를 조사하기 위해 적용 할 수 있다는 점에서 강력하다. 두 나방 종, 만두 카의 sexta스포 도프 테라 리토 랄은 냄새 식별 및 각 종의 후각 학습 기능 (32, 33)의 신경 기초를 조사하기 위해 PER 연구에 사용되어왔다. 초파리와 PER 실험은 chemosensation과 34 학습과 관련된 분자 신호 폭포에 많은 통찰력을 제공하고 있습니다. 그리고 PER은 최근 벼룩 (Rhodnius의 prolixus)의 습관화 35 중요한 질병 벡터를 연구하는 데 사용되었습니다.

일반적으로, 절차는 방법의 변화에​​ 강하다; (D)의 사용ifferent 방법은 처리 군 간의 차이를 동일 상대적인 가능성을 생성한다. 비교적 간단한 절차에도 불구하고, 몇 가지 문제는 시간은 냄새 자당 협회 학습에서 꿀벌을 방지 할 수 있습니다에서. 다음 항목에서는 프로토콜과 PER 조절하는 동안 발생할 수있는 일반적인 문제들을 가능한 변화입니다.

컨디셔닝 프로토콜의 수에 대한 고려 사항 및 시험의 종류

어떤 학습 프로토콜 취득 단계에서 시험 번호 꿀벌의 노출을 필요로 할 것이다. 이 숫자는 크게 작업의 난이도에 따라 달라집니다. 꿀벌 한 번의 시험 후 간단한 작업을 알 수 있지만, 장기 기억 형성을 유도하는 적어도 세 개의 실험이 필요하다. 예상대로, 꿀벌은 적절하게 어려운 작업을 배우고 훨씬 더 많은 실험이 필요합니다. 일반적으로 꿀벌이 더 이상 크게 개선하지 않는 이상 시험의 최대 수는있다적외선 성능을 제공합니다. 이 최대 값은 특정 태스크, 악취 유형 및 농도, 및 수크로오스 농도에 의존한다.

다른 냄새와 시험의 하나 이상의 유형을 사용하는 경우, 악취 프레젠테이션 간단한 시퀀스를 기억하는 대신 취기 (36) 사이의 차이를 학습에서 꿀벌 유지 의사 랜덤 시퀀스에 다른 시험 유형을 제시한다. 이러한 의사 랜덤 시퀀스에서, 악취 유형 각각에 대한 시험이 동일한 수 있어야한다. 또한, 한 종류의 냄새 시험의 확률은 선행과 같은 냄새이어서, 또는 임의의 다른 냄새는 모든 악취위한 같아야된다. ABBABAAB :이 냄새를 들어 - - A와 B 다음 순서를 사용합니다. 여덟 시험 동안 각 냄새는 네 번 표시됩니다. 각 실험에 대한 악취 원하는 수에 도달하기 위해 동일한 서열을 연결.

에 관계없이 실험 설계, 유지해야합니다 몇 가지 매개 변수가학습을 최적화하기 위해 정수입니다. CS와 미국 사이의 중복 효과적인 조절에 중요​​합니다. 간 재판 간격 (도 1, 표 1)를 일정하게하고 불규칙하거나 너무 짧거나 너무 긴 간 재판 간격이 크게 조절 프로토콜 1의 효과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 최적화 될 필요가있다.

행동 테스트 시험의 중요성 및 디자인에 대한 고려 사항

CS와 US가 함께 제공됩니다 실험의 '취득 단계'동안 기록 응답은 유용 할 수 있습니다. 그러나, 냄새 제시 조건이 재판의 한 유형에서 다른 다를 수 있음을주의하십시오. 강화 시험 중에 수크로오스 다음 냄새 꿀벌의 응답에 영향을 미칠 수있는 시각적 자극 (수크로오스 액 적을 전달하기위한 장치의 이동)과 함께 제공된다. 그리고 꿀벌은 삼초가s는 응답 (; 그림 한 네 냄새 자극의 초 마이너스 크로스 프레 젠 테이션으로 한 초 오버랩)을 표시합니다. 실험이 냄새를 구별하는 학습 꿀벌을 포함하는 경우 (예를 들어, 강화 및 비 강화), 대체 시험에 소개 된 비 강화 냄새 보상 프레젠테이션의 시각적 자극없이 발생하고 꿀벌 응답 할 수있는 전체 사초 있습니다. 따라서,이 냄새에 대한 반응은 취득시 완전히 비교할 수 없습니다. 모든 조절 프로토콜로, 인수 곡선 일에만 의존하지 않습니다. 더 나은 꿀벌 학습 한 내용을 확인하기 위해 모든 자극의 시험이 동일한 조건에서 발생하는 것을 보장도 냄새가 강화되는 동안 비 강화 테스트 일련의 실험을, 소개합니다.

실험의 특정 목적에 따라 테스트 조건 악취 나 에어컨 OD와 시험 시리즈의 단일 테스트 실험 구성 될 수나 또는 조절 및 신규 냄새의 조합. 에어컨 냄새의 단일 테스트 시험은 꿀벌 '에어컨 냄새를 기억하는지 여부의 간단한 분석을 제공합니다. 그러나, 첫 번째 테스트 재판 응답은 꿀벌 '동기 레벨뿐만 아니라 냄새 조절들의 회수를 반영 할 수있다. 시험 시험 시리즈, 에어컨 냄새 또는 컨디셔닝 및 하나 이상의 신규 한 냄새의 단일 일련의 테스트의 흡광 시험 시리즈 중 하나는 또한 메모리를 평가하기 위해 사용될 수있다. 멸종 시험의 시리즈는 꿀벌 '조건 협회 기억의 강도를 평가할 수 있습니다. 조건 반응을 소화하는 데 필요한 시험의 더 많은 수의 리콜 강한. 컨디셔닝 및 신규 냄새의 단일 일련의 테스트는 특이에게 에어컨 냄새의 꿀벌 '메모리를 평가할 수 있습니다.

이는 제어 및 상태와 같은 시점에서 처리 군 모두를 테스트하는 것이 필수적이다. 비교 예곧 긴 시간 동안 개최 꿀벌로 조절 한 후 꿀벌의 성능을 보내고 이유로 인해 포만에 꿀벌을 공급하여 자당 미국에 대한 노출의 문제가있다. 예를 들어, 긴 간격 후의 성능 저하는 메모리 붕괴에 기인 될 수 또는 그 결과가 모호하기 때문에 비 강화 US에 노출에 의해 유도 동기 상태 및 / 또는 학습의 변화 일 수있다. 따라서, 처리 군의 성능이 항상 조건과 동일한 시점에서 테스트 대조군에 대하여 판단한다.

악취 농도 및 무결성

냄새 (CS)의 농도 및 무결성이 손상 될 수있는 몇 가지 방법이 있습니다. 악취 전달에 가장 널리 퍼진 문제는 남용에서 냄새 카트리지의 고갈 (그림 2)입니다. 이 함정을 피하기 위해 카트리지 10-12 사용 (5 꿀벌의 그룹과 매 2 또는 3 시험)를 교체합니다. 또한 사용하는 것이 중요합니다폐 카트리지가 차별적으로 고갈 될 수 있기 때문에 시험 시험에 대한 신선한 카트리지, 따라서 현재 불평등 한 냄새 자극. 또 다른 일반적인 문제는 완전히 세정하지 않고 하나 이상의 악취 카트리지를 사용으로 인한 악취 오염 카트리지이다. 오염이나 오염 된 공기 흐름은 또한 실수 부가 후각을 자극 (활성탄 필터 배경 오염을 방지 할 수있다) 도입 할 수있다. 냄새에 생리적 반응의 측정과 컨디셔닝 PER 결합 할 때 특히 문제가된다. 꿀벌이 재판이 냄새 자극의 돌출을 감소시킨다 시작하기 전에 악취에 노출되어 있기 때문에 새는 냄새 카트리지 문제를 제시한다. 밸브가 인위적으로 의도 된 냄새로 꿀벌의 반응을 감소 열 때 냄새 전달을위한 공기 공급 장치에 넉넉한 거의 또는 전혀 냄새가 전달 될 수 있습니다.

자당 솔루션과 무조건 자극 (보상)

마운트는, US로서 사용 자당 용액의 농도 및 무결성이 실험의 성공에 필수적이다. 컨디셔닝은 US 37로 사용 양과 자당 수용액의 농도의 함수이다. 방법 2에 사용되는 마이크로 미터 주사기 US 전달의 매우 정밀한 (0.2 μL로) 제어를 허용하고, 우리는 기술 두 가지 방법을 위해 그들을 사용하는 것이 좋습니다. 이쑤시개 (방법 1)의 사용, 또는 저급 예산 분야에서 큰 학생 그룹, 작업 훈련에서와 같은 고가의 주사기가 사용될 수없는 상황에 적합하다. 타이밍이 자당의 축적 (및 배달 농도)를 방지하기 위해 이쑤시개의 정기 교환으로 유지되는 방법 하나주의 깊게 구현 한 괜찮습니다. 그러나, 이쑤시개를 이용하여 정확하게 제어하고 조절 연구 중요 양과 US 전달의 크기를 추정하기 어렵다. 필요에 수크로오스 농도작업의 어려움과 꿀벌의 내부 상태 또는 년의 시간에 따라 달라질 수 있습니다 조건 관계를 배울 동기 꿀벌을 유지하기 위해 충분한 보상을 제공합니다. 더 어려운 작업은 꿀벌 '작업을 성공적으로 배울 수있는 더 높은 자당 솔루션을 필요로합니다. 실험 기간 동안 꿀벌의 건강과 보상의 인식에 영향을 미치는, 솔루션의 무결성이 손상 될 수도 5 ° C에서 자당 솔루션의 금형 수 축적. 그것은 며칠마다 솔루션을 교체하는 것이 가장 좋습니다.

정밀, 타이밍 및 CS와 US 배달의 일관성

적절한 PER 절차의 구현, 또는 그 문제에 대한 조절 절차에 대한 가장 중요한 문제는 정밀도 타이밍과 CS의 일관성과 미국의 배달 (그림 1)를 포함한다. 절차에 새로운 연구자들은 자주 하나 또는 두 자극의 전달에 대한 부정확하다. ISI의즉, CS 오버랩을 허용하는 실패 US 불량 컨디셔닝 성능을 초래한다. PLC는 실험 악취 전달의 발병 후 자당 3 초를 제공하기위한 소리 신호를 자동화합니다. 연구자들은 신호 후 신속한 배달을 위해 꿀벌에 가까운 크로스 / 물방울을 보유해야한다. 이러한 절차는 일관성있는 ISI를 혼입 도움이됩니다. 에어컨 분야에서 스톱워치를 배치하는 것은 이전과 자극의 전달 후 두 분야에서 꿀벌의 시간을 모니터링뿐만 아니라 재판의 편리한 시간에 배치 할 수 있습니다. 그 방법은 ITI 년대는 상대적으로 일관성이 있어야하고 전체 절차는 제어 된 속도로 실행할 수 있습니다. 너무 짧은 ITI의, 너무 오래 예를 들어보다 1 분, 또는 가난한 에어컨 성능 1로 이어질 수 있습니다.

꿀 꿀벌 성능에, 계절, 환경, 상황에 맞는 효과

꿀벌의 성능이 크게 주변 환경에 의해 영향을받을 수있다이전 및 컨디셔닝 동안 모두. 자주, 계절의 변화와 함께 온도와 음식 가용성의 변동은 배울 수있는 꿀벌 '의욕을 변경합니다. 꽃이 피어있을 때, 꿀벌 '동기는 실험실에서 조절 협회 (38)을 감소 배울 수 있습니다. 식민지가 강조 될 때 - 온도가 너무 높거나 낮은 곳, 식량 부족, 질병 관련 스트레스 - 꿀벌 '내 자신의 학습 성능의 감소를 보여줍니다. 꿀벌은 잠시 동안 잘 배울 수있는 비행 방에 보관하지만,이 역시 질병의 스트레스와 시간이 지남에 따라 자신의 학습 성능을 저하 노화. 에어컨 동안 컨텍스트는 또한 꿀벌의 성능을 줄일 수 있습니다. 불필요한 냄새, 운동 및 기타 자극 실험 자극에서 꿀벌을 방해 할 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면, 합리적으로 일관, 단순화 된 시각적 컨텍스트를 유지한다.

유전자형과 경험 PER 성능에 영향을

<P 클래스 = "jove_content"> 꿀 꿀벌 노동자 인해 작업의 전문화, 유전자형, 또는 다른 환경 적 요인 20 모든 조절 절차에 성능이 상당히 다를 수 있습니다. 따라서, 가능한 한 많이, 표준화하기 위하여 실험에 사용 된 동물의 종류 개인간 편차를 줄이는 것이 중요하다. 그녀는 많은 다른 드론과 성관계를 의미 오픈 성관계 여왕이 이끄는 식민지에서 노동자들은 아버지의 유전자형과 다를 수 있습니다. 유전 적 배경 극적인 감각 응답 39의 차이 및 성능 (29) 학습으로 이어질 수 있습니다. 도구 적 단일 드론 28에서 정자 인공 수정 왕비가 이끄는 식민지를 사용하면이 간 개인차를 줄일 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 둥지 입구에서 꿀벌 근로자를 수집하는 방법을 포함한다. 그러나 이러한 꿀벌은 연령이나 행동 작업에 관해서는 서로 다릅니다. 그들은 (inexperien 젊은 될 수있다CED) 또는 그 이상 (경험) 기계. 그들은 그들의 첫번째 방향의 항공편을 만드는 젊은 꿀벌 수 있습니다. 아니면 가드 벌 수있다. 변동성을 줄이기 위해, 빠른 건조 에나멜 페인트 또는 표시 태그 꿀벌을 표시하거나 그들은 성인 (나이를 통제하는)과 같은 등장으로 / 또는 그들은 (경험을 제어하는​​) 꼴을 시작으로. 그 후, 몇 일 후, 컨디셔닝 표시된 꿀벌를 수집합니다. 간호 행위에 종사하는 근로자는 하이브 내의 프레임에서 수집 할 수 있습니다. 그들은 내부의 유충에 대한 공급 및 관리하는 브루 셀에 머리를 삽입 할 때 간호사가 긍정적으로 식별 할 수 있습니다.

PER 컨디셔닝 버진 퀸 또는 드론을 사용하여

작업자 꿀벌뿐만 아니라, 처녀 꿀벌 여왕과 드론 쉽게 성능 28 학습에 차이가 꿀벌의 유전 라인을 개발하기위한 연구에 PER 절차에서 조절 될 수있다. 버진 퀸 번째 직후 수집해야어이가 번데기에서 등장하고 마취없이 금지 하네스에 직접 배치했다. 식민지 내부의 골똘히 빗에서 수집 한 젊은, 미숙 한 무인 항공기는 일반적으로 배울 동기를 부여하지 않습니다. 그들이 항공편 짝짓기 시작 후 드론 쉽게 PER 작업 28을 배웁니다. 그들은 여왕을 양육하는 데 사용되는 식민지에 작은 새장에 하룻밤 상대 비행에서 돌아가 압도하면서 그들은 수집해야합니다. 그들에게 에어컨 전에 일을 활용하지 마십시오; 그들은 마구 하룻밤 잘 생존하지 않습니다. 에어컨 이전 시간 드론은 케이지에서 수집 마취없이 금지 하네스에 배치 할 수있는 몇입니다.

결론

PER이 절차는, 방법의 방식으로, PER 실험 설계를위한 시작점에 도달한다. 대부분 PER 프로토콜은 어떤 방식으로 변경 될 설명한 절차는 실험과 accommodat의 특정 목표를 구현하는 것이 필요전자 여러 치료 그룹. 그것은 쉽게 구현할 수있다. 그러나 적절한 구현 세부 사항과 실천에 대한 관심이 필요합니다. 일단은 다른 곤충 종의 여러 기초 및 응용 연구 프로그램에 대한 연구 도구로 추가 할 수있는 강력한 절차가 될 수 마스터.

Acknowledgements

(; BH 스미스 공동 PI J Trumble PI)와 애리조나 주립 대학이 연구는 NIH NCRR (BHS에 R01 RR014166), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS 공동 PI), 미국 농무부 (USDA)에서 자금을 지원했다. 학생 (그림 4의 데이터)를 훈련 워크숍 자금은 칠레의 과학 재단에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma-Aldrich S9378-1KG
Odorant Compounds (for example)
    1-hexanol Sigma-Aldrich 471402-100ML For additional examples
    2-octanone Sigma-Aldrich W280208-800G-K of odorants, see any of
    heptanol Sigma-Aldrich 51778-5ML the papers on olfactory
    gerianol Sigma-Aldrich 163333-25G processing from the
    nonanal Sigma-Aldrich 131210-100ML Smith lab.
Hexane Sigma-Aldrich 296090-1L
Heavy mineral oil Sigma-Aldrich 330760-1L Make sure it’s odorless.
Ethanol Sigma-Aldrich 459836-1L
Scintillation vials Sigma-Aldrich Z190535-1PAK Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.
Bee harness Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.
Duct tape
Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956-1PAK
Wash bottles Sigma-Aldrich Z560847-3EA For the 70% ethanol.
Dryer tubing
FOR METHOD 1 ONLY
20 ml disposable plastic syringes Cole-Parmer WU-07945-18
15 mm filter paper circles Sigma-Aldrich Z274844-1PAK
Pushpins
Toothpicks
FOR METHOD 2 ONLY
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml Cole-Parmer EW-07840-00
Gilmont micrometer syringe tip Cole-Parmer EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles Fisher Scientific 14-826-10
1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) Sigma-Aldrich Z181641-1EA OR Z192090-200EA Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.
Small rubber/silicone restrictors Cole-Parmer EW-95702-02 Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.
Name Company Catalog Number Comments
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
75 x 100 mm filter paper Sigma-Aldrich Z695106-500EA
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing Cole-Parmer Various Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.
Polypropylene connectors & leur fittings Cole-Parmer Various Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.
65 mm Correlated Flowmeter Cole-Parmer EW-03216-08 Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.
OR
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump Aquacave AE-TETRA-300
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" The Lee Company LFAA1200118H Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer RadioShack 273-074

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