In situ compressão de carga e de imagem não invasivos Correlative do Osso-Ligamento periodontal de dentes fibrosa Joint

1Division of Biomaterials and Bioengineering, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California San Francisco, 2Department of Radiology and Biomedical Imaging, University of California San Francisco, 3Xradia Inc.
Published 3/07/2014
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Bioengineering

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Summary

Neste estudo, será discutido o uso de um dispositivo de carga acoplada situ com tomografia de raios de micro-X calculado para biomecânica fibrosos. Leituras experimentais identificáveis ​​com uma mudança total na biomecânica incluem: 1) força reacionária versus deslocamento, deslocamento de dentes ou seja, dentro do alvéolo e sua resposta reacionária do carregamento, 2) tridimensional (3D) de configuração espacial e morfometria, ou seja geométrica relação do dente com o alvéolo, e 3) mudanças nas leituras 1 e 2, devido a uma mudança no eixo de carga, ou seja, cargas concêntricas ou excêntricas.

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Jang, A. T., Lin, J. D., Seo, Y., Etchin, S., Merkle, A., Fahey, K., et al. In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint. J. Vis. Exp. (85), e51147, doi:10.3791/51147 (2014).

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Abstract

Este estudo demonstra um protocolo de testes de novas biomecânica. A vantagem deste protocolo inclui a utilização de um dispositivo de carregamento em situ acoplados a um microscópio de alta resolução de raio-X, permitindo assim a visualização dos elementos estruturais internos sob cargas fisiológicas simulados e condições de humidade. Espécimes experimentais incluirá ligamento periodontal osso intacto (PDL) de dentes articulações fibrosas. Os resultados irão ilustrar três características importantes do protocolo, como eles podem ser aplicados a biomecânica nível órgão: 1) força reacionária versus deslocamento: deslocamento do dente dentro do alvéolo e sua resposta reacionária do carregamento, 2) tridimensional (3D) configuração espacial e morfometria geométrica: relação do dente com o alvéolo, e 3) mudanças nas leituras 1 e 2, devido a uma mudança no eixo de carga, ou seja, a partir de concêntrica a cargas excêntricas. A eficácia do protocolo proposto será avaliada por acoplamento te mecânicaleituras picada a morfometria 3D e biomecânica global da articulação. Além disso, esta técnica vai enfatizar a necessidade de equilibrar as condições experimentais, as cargas especificamente reacionários antes de adquirir tomografias de articulações fibrosas. Deve notar-se que a proposta de protocolo é limitada a testes de amostras ex vivo sob condições, e que o uso de agentes de contraste para visualizar a resposta mecânica do tecido mole pode levar a conclusões erradas sobre tecidos e órgãos de nível biomecânica.

Introduction

Vários métodos experimentais continuar a ser utilizado para investigar a biomecânica de articulações diartrodiais e fibrosas. Métodos específicos para a biomecânica do órgão de dente incluem o uso de medidores de tensão 1-3, métodos de fotoelasticidade 4, 5, Moiré interferometria 6, 7, eletrônico padrão speckle interferometria 8 e correlação de imagens digitais (DIC) 9-14. Neste estudo, a abordagem inovadora inclui não-invasivo através de raios-X para expor as estruturas internas de um conjunto fibroso (tecidos mineralizados e suas interfaces que consistem em zonas mais suaves, e uma interface de tecidos, tais como ligamentos) com cargas equivalentes para as condições in vivo. Um dispositivo de carregamento situ acoplados a um microscópio de micro-raios-X serão utilizados. O tempo de carga e as curvas de deslocamento de carga será recolhida como o molar de interesse dentro de um rato hemi-mandíbula recém-colhida é carregada. A mobjetivo ain da abordagem apresentada neste estudo é enfatizar o efeito da morfologia tridimensional do dente-osso, comparando as condições em: 1) sem carga e quando carregado, e quando 2) carregado de forma concêntrica e excêntrica. Eliminando a necessidade para os espécimes de corte, e para realizar experiências em órgãos inteiros intactos em condições de humidade para permitir a máxima preservação do estado de stress em 3D. Isso abre uma nova área de investigação para compreender os processos dinâmicos do complexo em vários cenários de carga.

Neste estudo, os métodos para a biomecânica testes PDL dentro de um conjunto fibroso intacto de uma ratazana Sprague Dawley, um conjunto considerado como um sistema modelo de bioengenharia óptima será detalhado. Experimentos irá incluir a simulação de cargas da mastigação em condições hidratados, a fim de destacar três características importantes do conjunto como eles se relacionam com a biomecânica do nível do órgão. Os três pontos incluem: 1) força reacionária versus deslocamento:deslocamento do dente dentro do alvéolo e sua resposta reacionária do carregamento, 2) tridimensional (3D) de configuração espacial e morfometria: relação geométrica do dente com o alvéolo, e 3) mudanças nas leituras 1 e 2, devido a uma mudança na eixo de carga, ou seja, a partir de concêntrico para cargas excêntricas. Os três leituras fundamentais da técnica proposta pode ser aplicado para investigar a natureza adaptável de articulações em vertebrados, quer devido à mudança das exigências funcionais, e / ou doença. Mudanças nas leituras acima referidas, nomeadamente a correlação entre as cargas reacionários com deslocamento, e resultando em tempo de carga e carga-deslocamento curvas reacionárias em diferentes taxas de carregamento pode ser aplicada para destacar as mudanças globais em biomecânica. Eficácia do protocolo proposto será avaliado pelo acoplamento de leituras de testes mecânicos para morfometria 3D e biomecânica globais do conjunto.

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Protocol

Alojamento dos animais e eutanásia: Todos os animais utilizados neste demonstração foram alojados em condições livres de patógenos, de acordo com as diretrizes do Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) e do Instituto Nacional de Saúde (NIH).

Fornecer animais com ração hard-pellet padrão e água ad lib. Eutanásia animais através de um método de duas etapas de asfixia dióxido de carbono, toracotomia bilateral, de acordo com o protocolo padrão da UCSF aprovado pelo IACUC. Realizar testes biomecânicos nas 24 horas após o sacrifício dos animais, para evitar a degradação do tecido.

1. Preparação e dissecção de um rato mandíbula ou maxila

  1. Retirar mandíbulas de ratos por meio do corte do tecido gentilmente anexos e tecido muscular membranosas preservando toda a mandíbula, incluindo o processo e o processo coronoide condilar (Figura 1) 15.
  2. Hemimandíbula separados de carroefully cortando o tecido fibroso da sínfise mandibular com uma lâmina de bisturi.
    Nota: Os processos de coronárias e do côndilo e ramo da mandíbula (Figura 1) deve ser removido se obstruir fisicamente testes biomecânicos do 2 º molar.
  3. Corte os incisivos, sem expor a câmara pulpar, para não dificultar o carregamento do molar.

2. Preparação de amostras para in situ à compressão de carga (Figura 2)

  1. Imobilizar a amostra sobre um topo de aço, utilizando um material que é significativamente mais duro do que o espécime experimentais antes de colocá-lo em um dispositivo de carregamento em situ (Figura 2A).
    Nota: polimetilmetacrilato (PMMA) foi utilizado para imobilizar a amostra em estudo e este excesso, se algum, foi removido usando um explorador dental.
  2. Alinhe a superfície oclusal do molar (s) de interesse paralelo com o disco de amostra AFM de metal usando uma borda reta em ambosaviões (ou seja, mesial-distal e vestíbulo-lingual).
  3. Criar uma calha com um instrumento contundente ao redor dos molares.
    Nota: Este espaço deve servir como um "fosso" para conter o excesso de líquido e manter a hidratação do tecido durante o carregamento em situ.
  4. Preparar a superfície do dente ao construir-se para concêntrica (Figura 2B) ou excêntrico (Figura 2C) usando uma carga composta dental. Gravar a superfície do dente de interesse com o gel de ácido fosfórico a 35% na superfície oclusal de 15 seg.
  5. Lavar o produto corrosivo abundantemente com água desionizada e secar a superfície usando uma seringa de ar / água ou um recipiente de ar comprimido. Com um explorador, espalhe uma gota de o agente de ligação em cúspides abertas em uma camada fina. Cure o composto com uma luz de cura dental.
    Nota: Todas as etapas que envolvem compósitos deve ser realizada sem a luz direta de uma lâmpada. Tais condições seriam indesejavelmente acelerar o processo de polimerização, e could evitar a colocação adequada do composto. Iluminação do quarto é aceitável.
  6. Retire o excesso de agente de ligação a partir de dentes adjacentes com um bom bisturi ou lâmina de barbear.
  7. Coloque compósito dentário fluida na superfície após a preparação da superfície e espalhá-lo dentro de ranhuras do molar (s) de interesse, utilizando um explorador dental.
  8. Exponha o composto à luz de cura dental para 30 seg.
  9. Moldar um acúmulo oclusal de cerca de 3-4 mm usando uma resina composta dental, a partir do plano oclusal do molar (s) de interesse e cura luz por 30 segundos.
  10. Reduzir o início da formação de compósito com uma superfície plana paralela ao permitir que um regime de carga consistente em todos os espécimes, usando uma régua e um dispositivo manual de alta velocidade.
    Nota: Durante o teste biomecânico, outras amostras devem ser armazenadas em tris-fosfato de solução tamponada (TBS) com 50 mg / ml de penicilina, estreptomicina e 15.

3. Carregando Deriva de dispositivos eRigidez, capacidade material de propriedade de diferenciação, in situ Carregando da fibrosa Joint

  1. Fixar o espécime com o acúmulo de compósito sobre a bigorna da fase de carregamento, e de teste para uma carga uniforme, como mostrado na Figura 2B.
  2. Coloque um papel de articulação sobre a superfície do compósito, seguido por carregar as amostras para uma carga finita para verificar a existência de carregamento concêntrica ou excêntrica (Figuras 2B e 2C).
  3. Coloque Kimwipe TBS-embebido em torno da amostra para garantir a hidratação da amostra. Faça uma calha ao redor da amostra e preenchê-lo com TBS para manter o órgão hidratado durante o exame.
  4. Carga de pico de entrada e taxa de deslocamento para o software Deben para comprimir o molar para uma carga de pico desejado a uma taxa de deslocamento após a imobilização do hemimandíbula.
    Nota: as leituras típicas deve incluir uma carga reacionário como o material é comprimido ao longo do tempo (sensibilidade do transdutor de carga = 0,1N). A partir do tempo de carga e tempo de deslocamento, a curva de carga-deslocamento para o material compactado deve ser obtida 16-18. Utilizando os dados recolhidos a partir dos ciclos de carga, várias propriedades do conjunto pode também ser determinada. A rigidez da junta deve ser calculada tomando o declive da porção linear (cerca de 30% do último dos dados) da fase de carregamento da carga versus deslocamento da curva 19.

4. Coloração de Tecidos Moles, o PDL, com ácido fosfotúngstico (PTA)

Nota: Para aumentar o contraste de raios-X de atenuação, o PDL devem ser coradas com solução de 5% PTA 20.

  1. Solução de coloração Backfill PTA em uma limpa 1,8 ml carpule de vidro e coloque carpule carregado na seringa.
  2. Injectar solução lentamente (5 min / carpule) para o espaço PDL de dentes adjacentes para evitar danos estruturais nos tecidos periodontais circundantes molar de interesse.
    Nota: Os passos acima deve be repete-se até cerca de 5 tubetes anestésicos completos (9 ml) de solução são injectados e deixada fluir para os tecidos circundantes. Os espécimes prepped também pode ser embebido durante a noite em solução de PTA restante (8 horas).

5. Recomendados Configurações de digitalização μ-XCT

Realize m-XCT com as seguintes configurações de digitalização:

Objetivo Ampliação 4X, 10X
1.800 imagens
Tensão do tubo de raios-X 75 kVp (50 kVp para amostras de PTA manchado)
8 W
Tempo de Exposição ~ 8-25 seg *
~ 4 mm (objetiva de 4X), ~ 2 m (objetiva de 10X) **

* O tempo de exposição pode variar com base na geometria e a densidade óptica da amostra e do tubo de raios-X voltage.
** Resolução real de pixels será ligeiramente diferente com base na configuração da fonte, espécime, e detector.

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Representative Results

Estimativa de carga dispositivo "backlash", "pushback", rigidez, e deriva do sistema sob uma carga constante

Folga: Entre carga e descarga de porções do ciclo, existe uma pausa de 3 segundos durante o qual engrena inversa dentro do motor antes da verdadeira descarga começa, por exemplo, como o modelo afasta-se da mandíbula superior (Figura 3). Este período é designado por uma folga no sistema, o que representa um segmento de tempo quando o sistema está a tentar passar de fecho para a abertura das maxilas. Deve notar-se que todos os ciclos de carga conterá uma resposta folga semelhante, independentemente da amostra ou condições de carga (Figura 4). Uma carga normal versus a curva do tempo obtido utilizando um corpo rígido é mostrado nas Figuras 3A e 3B destacando a carga, descarga, e as regiões de folga em dois l diferenteantidiabéticos orais de 6 N e 16 N. Uma carga normal versus curva de deslocamento destacando os correspondentes três segmentos é mostrada na Figura 3C.

Empurrão: Enquanto todos os períodos de folga ocorrer dentro do mesmo período de tempo de 3 segundos, a resposta reaccionário e como resultado a forma da região de folga podem mudar, dependendo da amostra. Ao testar o sistema utilizando um corpo rígido (Fig. 3), a maior queda e máxima em carga reaccionária foi observada quando em comparação com o complexo do osso-PDL-dente e polydimethlysiloxane (PDMS). No entanto, a articulação fibrosa ilustrada uma queda significativa na carga reacionária durante a fase de retrocesso em relação ao PDMS. PDMS (Figura 4) das amostras pareceu ter a menor queda (não há diferença entre as 01:05 e 01:25 densidades de ligação cruzada - Figura 4A).

Rigidez: Rigidez do dispositivo de carga, quando testado agcorpo ainst rígida era significativamente maior do que a das amostras complexas e PDMS. Estes dados validam a eficácia do dispositivo de carregamento para realçar as alterações na biomecânica do complexo osso PDL-dente e materiais mais macios (Figura 4B).

A visualização das estruturas de tecidos moles e duros no complexo osso PDL-dente intacto usando μ-XCT: Em um conjunto fibroso não corado, mas hidratado, a atenuação das características dos tecidos duros, incluindo osso alveolar, cimento, esmalte, e dentina foram destacadas (Figuras 5A e 5B). No entanto, os espaços que continham tecidos orgânicos predominantemente mais suaves eram transparentes aos raios X, deixando o PDL-espaço relativamente "vazio" (preto). As amostras tratadas com ATP mostrou o aumento do contraste dentro do espaço PDL, destacando assim características representativas da PDL e os tecidos gengivais (Figuras 5C-F). Digitalização em uma magnífica superiorção revelou PDL como uma rede de fibras entre o dente e osso.

Força reacionária versus deslocamento: resposta biomecânica da articulação fibrosa durante no carregamento situ: Comparado com carregamento concêntrico, padrão de carregamento excêntrico em um espécime semelhantes mostraram aumento deslocamento do dente dentro da articulação para uma determinada carga reacionária (Figura 6A). No entanto, para as articulações fibrosas tratados com PTA não houve diferenças significativas na biomecânica global foram observados independentemente do estado de carga (Figura 6B). No sistema não tratado, mas colocado de forma excêntrica, o aumento do deslocamento da raiz no alvéolo pode ser correlacionada com a menor rigidez, como observado nas curvas de deslocamento de carga (Figura 6C). Embora possa haver uma variação natural, levando a uma série de respostas biomecânicas de articulações fibrosas colhidas grupos de controle, PTA tratado fibrosasarticulações exibiu aumento da rigidez e deslocados menos dentro da tomada em relação a outros não tratados para uma determinada carga de pico reacionário. No entanto, não houve nenhuma alteração detectável na forma ou a duração da fase de recuo do ciclo de carga entre as amostras tratadas e não tratadas de PTA.

Configuração espacial tridimensional e morfometria: mapear a configuração osso-dente em condições carregados usando μ-XCT: fatias virtuais tiradas de tomografias foram comparados para ilustrar 1) o movimento dentário dentro da tomada, 2) associação dente-osso, tanto em 2D e 3D , 3) a extensão do movimento devido a excêntrica em relação à carga concêntrica. O movimento dentário foi destacado por superposição de fatias virtuais semelhantes sem carga e em carga e de geração de filmes gif. Embora ambos os regimes de carga causada o dente para deslocar verticalmente no interior da junta, uma configuração de carga excêntrica (Figuras 7B e 7C) caused um efeito de rotação adicional do dente com as raízes rotativa distal, resultando em diminuição do espaço PDL ao longo dos lados distais das raízes, em comparação com as verificações concêntricos de carga (Figuras 7 e 8). Embora o PDL manchado de ATP foi de mais atenuante (Figura 5), o movimento do dente dentro do alvéolo nas articulações PTA tratado foi menos pronunciada e correlacionado com os dados biomecânicas (Figuras 6B e 6C).

Figura 1
Figura 1. Uma ilustração de 15 locais-chave adaptada ao preparar o hemimandíbula para o teste biomecânico. Mostrado dentro do encarte é um hemimandíbula.


Figura 2. Configuração de um em unidade de carga situ e sistema μ-XCT. (A) Uma imagem de um carregamento em situ dispositivo em um suporte personalizado dentro do micro-raios-X a tomografia computadorizada (μ-XCT) unidade. Concêntrica (B) e as condições de (C) de carga excêntricas determinadas pelo tipo de contacto entre a bigorna e a superfície de compósito são ilustrados sob a forma de esquemas, e as configurações experimentais correspondentes (região corresponde ao que se destacam pela caixa branca (A ), respectivamente. Marcas de articular papel confirmar a área de contato inicial entre a bigorna eo compósito dental. Clique aqui para ver imagem ampliada. </ A>

Figura 3
Figura 3. Curva do tempo de carga representativo ilustrando sistema de "folga". Carga em função do tempo utilizando um corpo rígido ilustra período de folga, como um evento de fecho e abertura entre os batentes. A região verde indica período de carga onde bigornas estão se aproximando (região verde) para carregar um corpo rígido de 15 N (A) e 5 N (B, inserir). A região azul indica um período de descarga onde as bigornas são retracção do outro. No entanto, devido à falta de resposta motora instantânea devido ao tempo gasto pelo reversão engrenagem, encontra-se um período de chicote volta de ~ 3 seg. Durante este tempo, a carga decresce aproximadamente por 2 N antes de ocorrer a verdadeira descarga. Carga e descarga de eventos pode ser relacionado para carregar vs gráfico deslocamentos (C), que mostra o deslocamento mínimo durante o período de folga. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4
Figura 4. Curvas de deslocamento de carga representativos e efeito "pushback" utilizando PDMS curvas de fundo:. Relacionamentos em tempo de carga entre PDMS de diminuir monômero de relações do agente reticulante revelar a capacidade da unidade de carga em situ para detectar diferenças nas propriedades dos materiais. Curvas superiores, esquerdo e direito ilustra a mudança na folga do sistema, devido à recuperação do material. A esquerda e para a direita quando comparadas ilustrar o mesmo efeito, o que indica que a diferença de recuperação 01:25-01:05 PDMS é mínima ou não está dentro dolimites de detecção do dispositivo de carga. b) as curvas de carga-deslocamento para materiais variados, incluindo alumínio rígido corpo, espécime experimentais, e os 3 PDMS espécimes. É a inclinação da parte linear de 30% da curva de carregamento que foi usada para calcular a rigidez do material. clique aqui para ampliar.

Figura 5
Figura 5. Raios-X seções virtuais de segundos molares inferiores manchadas para o realce estrutura PDL. (A, B) valores de escala de cinzentos dentro molares não tratados indicam atenuação de raios-X de vários tecidos incluindo as regiões mais suaves dentro do complexo. No entanto, os tecidos não mineralizadas, como PDL não foram destacadas devido à sua minimal atenuar características da energia de raios-X a 75 kVp. (CF) Seguindo PTA manchando as características de atenuação do PDL suave foram reforçadas e detalhes dentro do PDL foram visualizadas por microscopia de raios-X. Assim, sagital 2D virtual (ampliação C-4X, ampliação E-10X) e transversais (ampliação D-4X, ampliação F-10X) seções revelou a orientação das fibras PDL (setas amarelas). A luz dos vasos sanguíneos dentro espaços endosteais (setas laranja) eo PDL (setas brancas) aparecem como estruturas circulares escuras, enquanto o espaço pulpar permanece imaculada. Artefatos criados durante o processo de coloração também são anotados (D, asteriscos vermelhos). Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Figura 6. Espécimes de forma concêntrica e colocado de forma excêntrica. Superior (A) e painéis de fundo (B) ilustram os filmes de relação de dente-de osso em tempo rápido em vazio e, quando carregada a 15 N, de forma concêntrica e excentricamente, respectivamente. Painéis superior e inferior ilustrar associação osso-dente quando (B) condições não tratadas (A) e manchados. Painel central (C) ilustra diferentes comportamentos de deslocamento de carga entre excêntrica e concêntrica (curvas à esquerda) complexos carregados e coradas e não coradas (curvas à direita) complexos. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Figura 7. Secção sagital de 2 º molar ilustra a associação do dente com o alvéolo quando carregado concentricamente (A) e excêntrica (B). Maioria de compressão foi visto dentro interradicular (cabeças de seta) e apical (setas) regiões. Quando comparado com secções virtuais do dente em carga excêntrica (B), o componente de rotação adicional das causas de movimento de dente maior compressão para o lado distal da raiz mesial. Seções transversais sobrepostos revelou tradução distal e movimento de rotação no sentido horário do dente (raízes verdes) em relação a um dente de forma concêntrica carregado (cinza). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 8 Figura 8. Filmes reconstruída 3D revelar um espaço PDL-diminuído dentro do lado distal da raiz, quando colocado de forma excêntrica (E) em relação a uma forma concêntrica complexo carregado (D). Clique aqui para ver o carregamento excêntrico e clique aqui para ver o carregamento concêntrica.

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Discussion

O primeiro passo para estabelecer este protocolo envolveu a avaliação da rigidez da estrutura de carregamento por meio de um corpo rígido. Com base nos resultados, a rigidez foi significativamente mais elevada que permita a utilização do dispositivo de carregamento para mais testes de amostras com valores de rigidez significativamente inferiores. O segundo passo destaque a capacidade de o instrumento para distinguir diferentes valores de rigidez, utilizando duas fases da curva de carga-descarga gerados pela utilização de um corpo rígido, os materiais de PDMS de diferentes densidades de reticulação, e as articulações fibrosas. A rigidez da fase de carregamento e de empurrão, durante a fase de reação foram utilizados para identificar a resistência do material de carga e a recuperação do material após a descarga (Figuras 3 e 4). Os terceiro e quarto passos do protocolo foram correlacionar as alterações nas curvas de carga-deslocamento obtidas a partir do dispositivo de carregamento para a imagiologia in situ realizada com tele usar de raios-X (Figura 5). Isto envolveu o carregamento das articulações e na obtenção de tomografias sem peso e de carga, em condições concêntricas e excêntricas, respectivamente. O protocolo demonstrou que, alterando as diferenças eixo de carga nos níveis de PDL-compressão podem ser destacadas (figuras 6 e 7). Nesta discussão, vamos primeiro destacar características de instrumentos e desafios que devem ser adequadamente compreendidas e atendidas antes do teste biomecânico do complexo osso-PDL-dente.

Desafios da montagem experimental

Acúmulo Composto: Enquanto o protocolo é relativamente simples, há várias etapas que devem ser feitas com muito cuidado. Um dos maiores desafios era o de garantir que o excesso de material composto não estouro de dentes adjacentes, o que, em seguida, ligar mecanicamente vários dentes e deturpar a meca conjuntaics de um único dente. Desde destreza manual significativo e conhecimento de ferramentas dental mostrou-se útil para este procedimento, a preparação de amostras para carga foi realizada principalmente por estudantes de odontologia e dentistas com o auxílio de ampliação ótica.

Esquema de carregamento Consistente: Outro detalhe importante para o teste biomecânico foi garantir um esquema de carregamento consistente. A área de contacto entre a maxila do dispositivo de carregamento e opondo-se in situ na superfície do compósito provou ser muito importante para o experimento. Isso ocorre porque a mecânica da articulação fibrosa pode mudar como resultado da área de contato, que foi simulada neste estudo usando (desbalanceados) cargas concêntricas e excêntricas. O cenário apresentado neste estudo imita possíveis alterações na oclusão dos dentes de mamíferos, o que pode resultar numa mudança na circulação do dente dentro do alvéolo (Figura 5). Embora seja entendido that o mecanismo de teste proposto não imitar ciclo mastigação fisiológica, apresenta-se como um método de teste padrão. Ao criar uma acumulação de compósito com uma superfície paralela à maxila da fase de carregamento, que foram capazes de gerar um padrão de carga consistente. Este método de teste padrão pode ser usado para identificar mudanças na biomecânica dos complexos osso PDL-dente de vários grupos experimentais.

A sensibilidade do dispositivo de carregamento situ: O protocolo experimental descreve métodos para validar os limites de detecção do dispositivo de carregamento em situ, utilizando três amostras diferentes, dos quais dois podem ser considerados como materiais convencionais. A rigidez da estrutura de carregamento, quando testado com o alumínio era significativamente mais elevada com uma contribuição insignificante para o comportamento mecânico observados de vários espécimes de PDMS, e a resposta de biomecânica de um conjunto fibroso. Enquanto todas as amostras testadas tiveram um período de folga de~ 3 seg, a forma da porção de folga variou ligeiramente (Figura 4A) com o tipo de espécime. Espécimes rígidos exibiu uma diminuição acentuada na carga reacionária (Figuras 3A e 4A), enquanto os espécimes mais suaves não apresentaram uma diminuição acentuada (Figura 4A). Pode-se argumentar que a diferença de comportamento reação é atribuída à capacidade do corpo de prova para empurrar para trás nas engrenagens durante a reversão da engrenagem. O efeito de empurrar para trás sobre as engrenagens pode manifestar-se em uma queda menor na resposta reaccionário pico do material que a mandíbula começa a mover-se para longe da amostra. Assim, o segmento de reação pode ser explorada para obter insights à propriedade material. Os valores de rigidez de PDMS calculados a partir de curvas de deslocamento de carga estavam em concordância com os valores da literatura 22, e a gama de dureza para os PDMS reticulados estava dentro da gama do complexo osso PDL-dente. Assim, a carga em situ device é apropriado para medir o deslocamento e resposta reaccionário do dente, uma vez que é comprimida para o alvéolo. A resposta pode ser reaccionário dos constituintes mais suaves e / ou duros. A dominância do constituinte mais macio sobre o mais difícil pode ser identificado através do carregamento de forma incremental e imagiologia, seguido por digitalmente correlacionar a carga sem a condições de carga para identificar regiões dominada de estirpe dentro do complexo do osso PDL-dente 13.

Componente principal de mastigação é na direcção axial: Semelhante para os seres humanos, o ciclo de mastigação de ratos envolvem o movimento livre da mandíbula para mastigar comida 23, 24. Enquanto este movimento tem sido mapeada para incluir muitas direcções diferentes, tais como os movimentos laterais, a principal componente de carga é considerada na direcção axial 23. Portanto, o simulado em cargas in situ no sentido axial foram colocados ou concentrically ou excêntrica (Figura 2).

Fatores experimentais que podem afetar os resultados relacionados à biomecânica nível de órgãos: A vantagem de acoplar microscopia de raios-X com a carga situ é que a curva de deslocamento de carga pode ser correlacionada com a associação espacial do dente com o alvéolo, a forma da raiz ea superfície alveolar, eo estreitamento e alargamento do PDL-espaço sob carga. A correlação e avaliação complementar oferece uma abordagem holística para determinar a biomecânica de órgãos. No passado, apenas foi postulado que a mecânica de um órgão e / ou tecidos pode levar a um comportamento de força-deslocamento. Este protocolo ilustrado que a associação entre os membros que se deslocam quando sob carga também pode ser uma característica que define a rigidez observada. Todas as alterações observadas nas primeiras 5-8 N é pensado para ser contribuído com a qualidade do PDL uma mudança conformacional inicial dentro docolágeno e troca fluido intersticial com resistência mínima para carregar; esta região tem sido referida como a região "uncrimping" 26. Cargas superiores a 7 N pode ser contribuído por dente, o osso, os efeitos de encruamento do ligamento periodontal e as interfaces inerentes aos tecidos. Uma vez que o espaço PDL é minimizado e que a PDL sofre endurecimento de tensão, as interacções de tecidos duros entre o dente e encaixe ósseo surgem na região inter resultando numa carga mais acentuada ao deslocamento do declive. Em adição a recuperação de material, a folga do dispositivo de carregamento pode ser explorado para investigar a natureza viscoelástica do PDL sem alterar o conjunto tal como foi feito em outros estudos 16, 25.

As regiões gerais dentro das curvas de deslocamento de carga correlacionar a alguns eventos dentro da articulação. Os eventos acima são os denominadores comuns entre os dois regimes de carga. No entanto, as diferençasentre os perfis de carga-deslocamento concêntricas e excêntricas e tomografias correspondentes destacou a influência da direção da carga sobre a biomecânica geral do órgão. A principal fonte destes diferenças foi a introdução de um dente, uma vez que a rotação desloca no interior da junta, fazendo com que a compressão de espaços PDL em áreas específicas. Entende-se que as cargas fisiológicas normais são aplicados sobre o dente em várias direcções, incluindo aqueles que introduzem o movimento de rotação do dente. No entanto, recomenda-se que um regime de carga concêntrica ser usado como um sistema de carregamento padrão, devido à dificuldade de aplicar uma carga excêntrica "padrão" em todas as amostras. Como este protocolo como experimental pode ser usado para diferenciar as diferenças biomecânicas entre os sistemas adaptados e nonadapted.

Um dos inconvenientes da utilização de raios X de energia mais elevada é que eles são minimamente absorvidos pelos tecidos mais macios e produzido contraste inadequada. O PDL é transparent de raios-X e como resultado exige a utilização de agentes de contraste. PTA aumenta os contrastes de tecidos moles através da coloração diretamente 27-29 e permitindo a visualização, usando raios-X. Assim, usando os agentes de contraste, deformações visíveis dentro das regiões dos tecidos moles entre coradas tomografias carregadas e descarregadas foi observado, no entanto uma ampliação maior (pelo menos 10X) é recomendado para análise (dados não mostrados). Uma limitação do protocolo de coloração incluiu o uso de etanol, um fixador leve 29 que poderia ter alterado a rigidez do PDL e mecânica da articulação gerais que levam a conclusões errôneas.

CONCLUSÕES

Este estudo destaca um protocolo novo teste para analisar a resposta biomecânica de um osso PDL-dente articulação fibrosa intacto, mas sob condições ex vivo. O método experimental descrito incluindo análises pós de dados podem ser utilizados para medir os efeitos de expervariáveis ​​imental (ou seja, a doença, fatores de crescimento, idade e moléculas terapêuticas) sobre a mecânica do osso PDL-dente articulação fibrosa. Além disso, os resultados destas experiências vão servir como uma linha de base para que as relações entre as variações no nível do órgão macroescala pode estar relacionada com alterações específicas nos níveis teciduais e celulares. Limitações do protocolo incluem, de representação gráfica em condições ex vivo, o uso de agentes de contraste, e perda de precisão espacial entre as superfícies do dente e alvéolo devido ao relaxamento do tecido durante tempos de aquisição mais necessário para a geração de tomografia.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Protocolo para o teste biomecânico de molares em maxila:

1. Se maxilas estavam a ser testadas, remover a maxila de cada crânio de ratos com o aspecto ventral (céu da boca) voltada para cima. Cortar o músculo e tecido conjuntivo a partir do ligamentoo aspecto lateral do crânio, cortando através do vestíbulo (bolsa entre a gengiva e bochecha).

2. Apalpe e fraturar o processo zigomático do osso maxilar do crânio e cortar o arco zigomático do osso maxilar.

3. Corte o crânio para baixo com um par de tesouras de dissecação em massa através do cérebro a partir do palato mole. Isolar o aspecto anterior do crânio e descasque o couro cabeludo para longe da face dorsal (topo) do crânio.

4. Com um par de tesouras de dissecação finas, separar o certo e hemimaxillae deixado por fazer uma incisão que segue uma linha reta através do centro do palato duro e para a região interproximal entre os incisivos. Certifique-se que a profundidade do corte é superficial - apenas a uma profundidade suficiente para perfurar o palato duro.

5. Isolar o hemimaxillae fazendo perpendicular (ao longo do eixo do crânio) incisõesanterior ao primeiro molar e posterior ao terceiro molar. 1) Não corte muito de perto com os primeiros e terceiros molares para isso pode perturbar a estrutura de raiz; 2) Não arrancar o tecido gengival ao redor todos os três molares. Separe o hemimaxillae do crânio, cortando o osso maxilar superior, fina a cada hemimaxilla. Remova qualquer excesso de tecido e ósseas espículas.

Validação do dispositivo de teste mecânico:

A fim de determinar a rigidez da armação de carga e o deslocamento dos transdutores de carga / deslocamento, utilizar um corpo rígido, tal como alumínio, com um módulo de elasticidade de longe maior do que a das amostras experimentais.

Para determinar se o instrumento é capaz de diferenciar os diferentes valores de rigidez representativos de elementos mais macios, fabricar blocos de PDMS com diferentes densidades de reticulação (1:05, 1:10, 1:25 reticulador à base de peso) e carregá-los usando a mesmano dispositivo de carregamento situ.

Modo de contraste de fase para o realce de contraste de elementos mais macios: realce do contraste da PDL pode ser feita através da exploração do modo de contraste de fase do scanner. Fundamentalmente, contraste de fase explora as capacidades de detecção do scanner de uma mudança de fase nas bordas do tecido, e proporciona maior detalhe estrutural. Como resultado, neste estudo, as lacunas de cementocyte-lacunas e osteócito-lacunas apareceu como porosidades dentro respectivos tecidos mineralizados. Estas estruturas foram previamente não detectado em um exame padrão no modo de absorção. Tomogramas adquirido no modo de transmissão permitiu a visualização de estruturas dentro do espaço negativo, ou seja, o PDL-espaço e espaços endosteais incluindo o sistema de canal de Havers (para o modelo 3D ver Figura S1). Estruturas adicionais no interior da PDL espaço pode ser visualizado como também, tal como a vascularização que é contínua com a in osso.

Cargas equilibradas para aquisição de tomografia e deriva do sistema:. Esta seção pode ser melhor explicado por referindo-se a suplementar Figura 2 Figura S2A demonstra a necessidade de equilibrar os picos de carga antes de adquirir tomografias. As cargas de pico, invariavelmente cair até uma magnitude inferior e o sistema deve ser equilibrada pelo menos durante uma hora antes de uma tomografia 6-8 horas é adquirido. Deve notar-se que o tomograma adquirida não é representativo da associação osso-dente no pico de carga, mas com uma carga de 2-3 N mais baixa do que a carga de pico. Além disso, o sistema de tração medido identificados usando um esboço de alumínio rígido foi encontrado a mudar com taxa de deslocamento e / ou cargas de pico (Figura S2B e S2C). Os valores aproximados de deriva variou de 1 + N / hora.

Após a realização de ensaios mecânicos, uma tomografia da articulação fibrosa foi feita sem carga, e a um pico de carga, a uma taxa de deslocamento desejado. Antes de adquirir uma tomografia em condições carregadas, deve ser tomado cuidado para que o sistema para chegar a um equilíbrio (estabilidade) na sequência do qual a digitalização deve prosseguir. Condições semelhantes foram repetidas para complexos manchadas excentricamente carregadas e PTA. Do tomografias, fatias virtuais foram comparados sem carga para condições de carga, a fim de identificar associação dente-osso tanto em duas e três dimensões.

Figura Suplementar 1. Reconstrução em 3D do espaço negativo usando microscopia de raios-X melhorada de contraste de fase. Sob modo de melhoramento de contraste de fase, a mudança de fase que ocorre nas bordas de tecidos foi aproveitada para realçar os vasos sanguíneos dentro do PDL. Especificamente modo de absorção (à esquerda) destacou tecidos mineralizados dentro do campo de visão, enquanto o modo de transmissão (à direita) destacou os vasos sanguíneos dentro do espaço PDL bem os espaços endosteais.

tenda "> Figura Suplementar 2. Decay de forças reacionárias de pico para um estado de equilíbrio antes do CT-varredura. Curves indicar diferentes taxas de decaimento da resposta reacionária de uma articulação fibrosa (painel superior) e um corpo rígido (painel inferior).

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o apoio do financiamento do NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) e os Departamentos de prevenção e reparação Odontologia e Ciências orofaciais, UCSF. Além disso, os autores reconhecem Xradia Graduate Fellowship (AJ), Xradia Inc., Pleasanton, CA.

Os autores agradecem ao Dr. Kathryn Grandfield, UCSF por sua assistência com pós-processamento de dados; drs. Stephen Weiner e Gili Naveh, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, Dr. Ron Shahar, da Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel por suas discussões criteriosas específicas para o dispositivo de carga em situ. Os autores também gostariam de agradecer Biomateriais e Bioengenharia microCT Imagem Facilidade na UCSF para o uso de Micro XCT eo dispositivo de carga em situ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bard Parker Blade BD MEDC-001054
AFM metal disk Ted Pella 16218
Polymethyl methacrylate  GC America N/A
Uni-Etch Bisco E5502EBM
Optibond Solo Plus Kerr Corp N/A
Filtek Flow 3M N/A
Hurculite Ultra Kerr 34346
Tris buffer Mediatech Inc. N/A
Articulating paper Parkell Inc.
Phosphotungstic Acid Sigma Aldrich HT152

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