Yerinde Basınç Yükleme ve Kemik-periodontal ligament-diş Lifli Joint Korelatif noninvaziv Görüntüleme

1Division of Biomaterials and Bioengineering, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California San Francisco, 2Department of Radiology and Biomedical Imaging, University of California San Francisco, 3Xradia Inc.
Published 3/07/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Bu çalışmada, lifli ortak biyomekanik için mikro-X-ışını bilgisayarlı tomografi ile birlikte yerinde yükleme cihazının bir kullanımının tartışılacaktır. Ortak biyomekanik bir genel değişim ile tanımlanabilir deneysel okumalar içerecektir: 1) gerici deplasman vs kuvvet, alveol soket içinde yani diş deplasman ve yükleme onun gerici tepki, 2) üç boyutlu (3D) mekansal yapılandırma ve morfometrik, yani geometrik nedeniyle yükleme ekseni örneğin, konsentrik ya da eksantrik yükler bir değişiklik için alveol yuva ile diş ve okumalar 1 ve 2 'de 3) değişikliklerin ilişkisi.

Cite this Article

Copy Citation

Jang, A. T., Lin, J. D., Seo, Y., Etchin, S., Merkle, A., Fahey, K., et al. In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint. J. Vis. Exp. (85), e51147, doi:10.3791/51147 (2014).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu çalışma, yeni bir biyomekanik test protokol göstermektedir. Bu protokolün bir avantajı bu şekilde simüle fizyolojik yükler ve ıslak koşullarda, iç yapı elemanları görselleştirme sağlayan, yüksek çözünürlüklü bir X-ışını mikroskop kuple yerinde yükleme cihazı olarak bir kullanımını içerir. Deneysel örnekler bozulmamış kemik-periodontal ligament (PDL)-diş lifli eklemler içerecektir. 1) deplasman vs gerici güç: diş deplasman alveol soket içinde ve yükleme, 2) üç boyutlu (3D) mekansal konfigürasyonu kendi gerici tepki sonuçları, organ düzeyinde biyomekanik uygulanabilir gibi protokol üç önemli özellikleri gözler önüne serecektir ve morfometrik: geometrik alveolar soketi ile diş arasında ilişki nedeniyle, yani eksensel eş merkezli ikinci yükleme ekseninde bir değişiklik için okumalar 1 ve 2 'de 3) değişir. Önerilen protokolün etkinliği mekanik te birleştirilmesi tarafından değerlendirilecektir3D Morfometri ve eklem genel biyomekaniğine acı okumaları. Buna ek olarak, bu tekniği özellikle gerici yükler önce lifli eklem tomogram edinme, deneysel koşullar dengelenmeye ihtiyacı vurgulamak olacaktır. Bu önerilen protokol ex vivo koşullar altında numunelerin test sınırlıdır ve yumuşak doku mekanik yanıtını görselleştirmek için kontrast maddelerin kullanımının doku ve organ düzeyinde biyomekanik hakkında hatalı sonuçlara yol açabileceği unutulmamalıdır.

Introduction

Çeşitli deneysel yöntemler diarthrodial ve fibröz eklemlerin biyomekanik araştırmak için kullanılmaya devam. Diş organı biyomekanik özgü yöntemler gerginlik ölçme 1-3, photoelasticity yöntemleri 4, 5, Harelenme interferometri 6, 7, elektronik benek desen interferometri 8, ve dijital görüntü korelasyon (DIC) 9-14 kullanımını içerir. Bu çalışmada, yenilikçi bir yaklaşım, bir elyaflı mafsalın iç yapıları ortaya çıkarmak için X-ışınları kullanılarak (yumuşak bölgeler aşağıdakilerden oluşan mineralize dokuları ve arayüzleri ve bu gibi bağ dokularının arayüz) in vivo koşullara denk yüklerde invazif olmayan görüntülemeyi içerir. Bir mikro-X-ray mikroskop bağlanmış bir in situ yükleme cihazı kullanılacaktır. Yük-zaman ve yük-deplasman eğrileri taze hasat sıçan hemi-mandibulanın içinde ilgi molar yüklü olarak tahsil edilecektir. M1) Hiçbir yük ve yüklenen ve zaman 2) eş ve eksantrik yüklü: Bu çalışmada sunulan yaklaşım ain hedefi en şartlarını karşılaştırarak diş kemiğin üç boyutlu morfoloji etkisini vurgulamaktır. Kesim örnekleri için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ve ıslak koşullarda bütün dokunulmamış organlar üzerinde deney yapmak için 3D stres durumunda maksimum koruma sağlayacak. Bu çeşitli yükleme senaryolar altında karmaşık dinamik süreçleri anlamada soruşturma yeni bir alan açar.

Bu çalışmada, Sprague Dawley sıçan sağlam bir lifli eklem içinde test PDL biyomekanik için yöntem, bir optimum bioengineering bir model sistem olarak kabul ortak bir detaylı olarak açıklanacaktır. Deneyler organ düzeyinde biyomekanik ile ilgili olarak eklemin üç önemli özelliklerini vurgulamak amacıyla hidratlı koşullar altında çiğneme yüklerinin simülasyon içerecektir. Üç puan içerecektir: yerinden vs 1) gerici kuvvet:diş alveolar yuva içinde yer değiştirme ve yükleme gerici tepki, 2) üç boyutlu (3D) uzamsal konfigürasyon ve morfometrik: alveolar yuva ile dişin geometrik ilişki nedeniyle bir değişiklik için okumalar 1 ve 2 3) değişiklikleri konsantrik eksantrik yüklerin yani yükleme ekseni. Önerilen teknik, üç temel okumalar nedeniyle fonksiyonel taleplerindeki değişikliklere ve / veya hastalığa omurgalı ya da eklemlerin adaptif doğasını araştırmak için uygulanabilir. Anılan okumalar değişiklikler, farklı yükleme hızlarında özellikle deplasman gerici yükler arasındaki korelasyon ve gerici yük-zaman ve yük-deplasman eğrileri çıkan ortak biyomekanik genel değişiklikleri vurgulamak için uygulanabilir. Önerilen protokol etkinliği 3D Morfometri ve eklem genel biyomekanik mekanik test okumalarını birleştirilmesi tarafından değerlendirilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan gövdesi ve ötenazi: Bu tasvirde kullanılan bütün hayvanlar Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) kurallarına uygun olarak patojen içermeyen koşullar altında tutuldu.

Standart sabit-pelet sıçan yemi ve suyla birlikte hayvanları sağlayın. IACUC tarafından onaylanmış gibi ucsf standart protokolüne uygun karbon dioksit boğulma, bilateral torakotomi bir iki aşamalı yöntemi ile hayvanlar Euthanize. Dokusu bozulmasını önlemek için, hayvan kurban 24 saat içinde biyomekanik test gerçekleştir.

1.. Hazırlanması ve Rat Altçene'ye veya Maksillada diseksiyonu

  1. Koronoid ve kondiler süreci (Şekil 1) 15 de dahil olmak üzere tüm mandibula, koruyarak nazikçe membranöz doku ve kas dokusu ekleri koparılması ile sıçan altçeneleri çıkarın.
  2. Arabayla Ayrı hemimandiblesefully bir neşter ile mandibular symphysis'in fibröz doku kesme.
    Not: fiziksel 2. molar biyomekanik test engel ise koroner ve kondiler süreçler ve mandibulanın ramus (Şekil 1) çıkarılmalıdır.
  3. Molar yüklenmesini engellemeyecek şekilde hamuru oda maruz kalmadan kesicilerin kesti.

2. Yerinde Basınç Yükleniyor için Numune Hazırlama (Şekil 2)

  1. Önce in situ yükleme cihazı (Şekil 2A) bir in yüklemeden için deney numunesinin önemli ölçüde daha sert olan bir malzeme kullanılarak bir çelik parçası üzerinde numune hareketsiz.
    Not: polimetilmetakrilat (PMMA), eğer varsa, bir diş Explorer kullanılarak uzaklaştırılmıştır, bu çalışma ve fazla miktarda numune hareketsiz hale getirmek için kullanılmıştır.
  2. Hem de bir düz kenarı kullanarak AFM metal numune disk ile faiz paralel molar (ler) oklüzal yüzeyini hizalayınuçaklar (yani mesial-distal ve yanak-lingual).
  3. Azılarını çevreleyen bir cisimle bir çukur oluşturun.
    Not: Bu alan aşırı sıvı içeren ve yerinde yükleme sırasında doku hidrasyon korumak için bir "hendek" olarak hizmet etmelidir.
  4. Bir diş kompozit kullanılarak eş (Şekil 2B) ya da eksantrik (Şekil 2C) yükleme oluşturmak için diş yüzeyini hazırlayın. 15 saniye için oklüzal yüzeyi üzerinde% 35 fosforik asit jeli ile, ilgi konusu dişin yüzeyini aşındırma.
  5. Iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın ve pürüzlendirici bir hava / su şırınga ya da bir basınçlı hava spreyi kullanarak yüzeyi kurutun. Bir kaşif ile, ince bir tabaka halinde açık başlangıç ​​çizgileri içine bağlama maddesinin bir damla yayıldı. Dental bir ışık ile bileşik Cure.
    Not: Tüm adımlar içeren kompozit bir lamba doğrudan ışık olmadan gerçekleştirilmelidir. Bu koşullar, istenmeyen bir polimerizasyon sürecini hızlandırmak ve coul olurd kompozitin doğru yerleştirilmesini engeller. Oda aydınlatma kabul edilebilir.
  6. Ince bir neşter veya jilet ile komşu dişlerin aşırı bonding ajanı çıkarın.
  7. Yüzeyin hazırlanması sonra yüzeyi üzerinde akışkan dental bileşik yerleştirin ve bir diş explorer kullanarak, ilgi konusu molar (ler) olukları içine yayıldı.
  8. 30 saniye boyunca diş kür ışık kompozit Açığa.
  9. Ilgi molarlık (lar) ve 30 saniye boyunca ışık tedavi oklüzal düzleminden, bir dental reçine bileşik kullanılarak, yaklaşık 3-4 mm'lik bir oklüzal oluşumunu kalıp.
  10. Bir cetvel ve bir yüksek hızlı el parça kullanılarak tüm örneklerde tutarlı bir yükleme düzeni sağlamak için düz bir yüzeye paralel kompozit birikimini üst azaltın.
    Not: Biyomekanik Testler sırasında, diğer örnekleri 50 mg / ml penisilin tris-fosfat tamponlu çözelti (TBS) içerisinde saklanır ve streptomisin 15 olmalıdır.

3. Yükleme Cihazı Drift veSertlik, Material Property Farklılaşan Yetenek, Lifli Joint in situ Yükleniyor

  1. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, tek tip yükleme için yükleme aşamasının örs üzerinde kompozit birikimi ile örnek ve bir test edin.
  2. Eş merkezli veya dış merkezli yükleme (Şekil 2B ve 2C) kontrol etmek için sınırlı bir yük için numune yükleme ardından kompozitin yüzeyi üzerinde bir eklem kağıt yerleştirin.
  3. Numune hidrasyon sağlamak için numune etrafında TBS-batırılmış Kimwipe yerleştirin. Numune etrafında bir oluk yapmak ve görüntüleme sırasında nemli organı tutmak için TBS ile doldurun.
  4. Hemimandibula hareketsizliği izleyen bir deplasman oranda istenen pik yük molar sıkıştırmak için Deben yazılımı içine girdi pik yük ve deplasman oranı.
    Not: Malzeme yükü dönüştürücü duyarlılık = 0.1 (zaman içinde sıkıştırılır gibi tipik okumalar gerici yükü içermelidirN). Yük zaman ve yer değiştirme-zaman, sıkıştırılmış malzeme için yük-deplasman eğrisi 16-18 alınmalıdır. Yükleme döngüsü toplanan verileri kullanarak, çeşitli ortak özellikleri de belirlenebilir. Eklemin sertliği doğrusal bölümü yer değiştirme eğrisinin 19 karşı yükün yükleme fazı (verinin yaklaşık olarak en son% 30) eğimini alınarak hesaplanır.

4. Fosfotungstik Asit (PTA) ile Yumuşak Doku, PDL boyanması,

Not: X-ışını zayıflama kontrastı arttırmak için, PDL% 5 PTA çözeltisi 20 ile boyanmış olmalıdır.

  1. Dolgu PTA boyama, temiz bir 1.8 ml'lik bir cam karpülün içine çözeltisi ve şırıngaya yüklendi karpül yerleştirin.
  2. Ilgi azıdişi çevreleyen periodontal dokular için yapısal hasarı önlemek için komşu dişlerin PDL-uzaya solüsyonu yavaş yavaş (5 dk / karpül) enjekte edilir.
    Not: Yukarıdaki adımlar b gerekirçözeltisi yaklaşık 5 tam carpules (9 mi) e kadar tekrar enjekte edilir ve çevredeki dokulara akmasına izin verilir. Prepped örnekleri de kalan PTA çözeltisi (8 saat) içinde gece boyunca ıslatılmış olabilir.

5. Önerilen μ-XCT Tarama Ayarları

Aşağıdaki tarama ayarları ile m-XCT gerçekleştirin:

Amaç Büyütme 4X, 10X
1.800 görüntüleri
X-ışını tüpü gerilim 75 kVp (PTA lekeli örnekler için 50 kVp)
8 W
Pozlama Saati ~ 8-25 sn *
~ 4 mikron (4X objektif), ~ 2 mikron (10X objektif) **

* Maruz kalma süresi, geometri ve numune ve X-ışını tüpü vo optik yoğunluğuna bağlı olarak değişebilirltage.
** Gerçek piksel çözünürlük biraz kaynak, numune ve dedektör yapılandırmasına göre farklı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yükleme cihazı "tepki" sürekli bir yük altında, "pushback", sertlik, ve sistem sürüklenme Tahmini

Boşluk: döngüsünün yükleme ve boşaltma bölümleri arasında gerçek boşaltma numune uzakta üst çene (Şekil 3) çeker, yani olduğu gibi, başlamadan önce motorun içinde ters vites sırasında 3 saniyelik bir duraklama mevcuttur. Bu süre sistem çenelerinin açılması kapanış geçmek için çalıştığı zaman zaman bir parçasını temsil eden sistemi, bir tepki olarak adlandırılır. Her ne olursa olsun, numune yükleme döngüleri veya yükleme koşulları ile benzer bir tepki yanıt (Şekil 4) içerir unutulmamalıdır. Katı bir gövde kullanılarak elde zaman eğrisi Normal yük, iki farklı l yükleme, boşaltma ve geri tepme bölgeler vurgulama Şekiller 3A ve 3B içinde gösterilmektedir6 N ve 16 N. OAD'ler tekabül eden üç segment vurgulama yer değiştirme eğrisi normal bir yük Şekil 3C 'de gösterilmiştir.

Pushback: tüm tepki süreleri aynı 3 sn zaman diliminde, gerici yanıtı içinde ve tepki bölgenin şekli numune bağlı olarak değişebilir bir sonucu olarak ortaya çıkar iken. Kemik-PDL-diş kompleksi ve polydimethlysiloxane (PDMS) karşılaştırıldığında rijit bir gövde (Şekil 3) kullanarak sistemi test ederek, gerici yük dik ve yüksek düşüş gözlendi. Ancak, lifli ortak PDMS göre tepki aşamasında gerici yükü önemli bir düşüş gösterilmiştir. PDMS (Şekil 4) örnekler az düşüş (- Şekil 4A 01:05 ve 01:25 çapraz bağlayıcı yoğunlukları arasında fark) sahip çıktı.

Sertlik: yükleme cihazı sertliği test against rijit gövde karmaşık ve PDMS örneklerin önemli ölçüde daha yüksek oldu. Bu veriler kemik-PDL-diş kompleksi ve yumuşak malzeme (Şekil 4B) biyomekanik değişiklikleri vurgulamak için yükleme cihazın etkinliğini doğrulamak.

Μ-XCT kullanarak sağlam kemik-PDL-diş kompleksi içinde yumuşak ve sert doku yapıları görselleştirme: Bir boyanmamış, ancak sulandırılmış lifli eklemde, alveol kemiğinin, sement, mine ve dentin gibi sert doku özellikleri, zayıflama çizildi (Şekil 5A ve 5B). Ancak, ağırlıklı olarak yumuşak organik dokuları içerdiği boşluklar (siyah) görece "boş" PDL-boşluk bırakarak, X-ışınları şeffaf idi. PTA ile tedavi numuneler böylece PDL ve dişeti dokularının (Şekil 5C-F) özellikleri temsilcisine vurgulayarak, PDL-alanı içinde artmış kontrast gösterdi. Daha yüksek bir Magnific'de Taramaation diş ve kemik arasında bir elyaflı ağ olarak PDL saptandı.

Yerinden vs gerici güç: in situ yükleme sırasında lifli eklem biyomekanik tepkisi: konsantrik yükleme ile karşılaştırıldığında, benzer bir numune üzerinde eksantrik yükleme desen verilen gerici bir yük (Şekil 6A) için eklem içinde dişin artan deplasman gösterdi. Bununla birlikte, PTA ile muamele elyaflı eklemler için genel biyomekanik olarak anlamlı bir fark ne olursa olsun, yükleme durumuna (Şekil 6B) gözlendi. Muamele edilmemiş ancak eksantrik olarak yüklü bir sistemde, alveolar yuvaya kökün artan değiştirme yük-yer değiştirme eğrileri (Şekil 6C) görüldüğü gibi daha düşük sertlik ile korele edilebilir. Kontrol grupları içinde hasat elyaflı eklem biyomekanik tepkilerin bir dizi yol açan doğal farkı var olabilir de, elyaflı PTA-işlenmişeklem sertlik artış sergiledi ve daha az soket içinde belirli bir gerici pik yük için işlenmemiş muadillerine kıyasla yerinden. Bununla birlikte, muamele edilmemiş ve PTA muamele edilmiş numuneler arasında yük çevriminin geri tepme aşamasının şekil veya süresi içinde tespit edilebilir bir değişiklik yoktu.

Üç boyutlu mekansal yapılandırma ve Morfometri: μ-XCT kullanarak yüklü koşullar altında kemik-diş konfigürasyonuna haritalama: tomogram alınan Sanal dilim soket içinde 1) diş hareketi göstermek karşılaştırıldığında, 2) diş-kemik dernek 2D hem de 3D , 3) nedeniyle eksantrik hareket ölçüde eş yükleme ile karşılaştırıldığında. Diş hareketi hiçbir yük ve yük ve üreten gif filmler benzer sanal dilimleri üst üste vurgulandı. Her iki yükleme düzenleri diş, eklem içinde dikey olarak dış merkezli bir yükleme konfigürasyonu (Şekil 7B ve 7C) c değiştirmesine neden olurkenkökler konsantrik yükleme taramaları (Şekiller 7 ve 8) ile karşılaştırıldığında köklerinin uzak kenarları boyunca azalmış PDL alanı elde distal döner dişin ek bir dönme etkisi aused. PTA-lekeli PDL daha zayıflatıcı (Şekil 5), PTA tedavi edilen eklemlerde alveolar soket içinde dişin hareket (Şekil 6B ve 6C) daha az belirgin ve biyomekanik verileri ile ilişkili olduğu olmasına rağmen.

Şekil 1
Şekil 1. Biyomekanik test için hemimandibula hazırlamak önemli yerlere uyarlanmış 15. illüstrasyon. Inset içinde Gösterildi bir hemimandibula olduğunu.


Şekil 2. Mikro-X-ışını bilgisayarlı tomografi (μ-XCT) birim içinde özel bir tutucu üzerine bir yerinde yükleme cihazının yerinde yükleme ünitesi ve μ-XCT sisteminde bir konfigürasyonu. (A) bir görüntü. Konsantrik (B) ve örs ve bileşik yüzeyi arasındaki temas türüne göre belirlenir eksantrik (C) yükleme koşulları şemadaki şeklinde gösterilen ve bunlara karşılık gelen deney düzenekleri (bölge (A beyaz kutu ile vurgulanır tekabül edilir ) sırasıyla. Marks kağıt örs ve diş kompozit arasındaki ilk temas alanını onaylamak dile gelen. resmi büyütmek için buraya tıklayın. </ A>

Şekil 3,
Şekil 3,. Rijit bir gövde kullanarak zamanında vs Temsilcisi yük-zaman eğrisi sistemi "tepki" gösteren. Load kapama ve örsün açılması arasında bir olay olarak tepki süresini göstermektedir. Yeşil bölge örslerdir 15 N (A) ve 5 N (B, ek) bir katı vücut yüklemek için (yeşil bölge) yaklaşıyor yükleme süresini gösterir. Mavi bölge örsler birbirinden çekilerek olduğu bir boşaltma süreyi gösterir. Ancak nedeniyle bağlı dişli ters tarafından alınan zaman ani motor tepki eksikliği, ~ 3 sn geri kirpik dönem orada yatıyor. Gerçek boşaltma meydana gelmeden önce bu süre boyunca, yük 2 N ile yaklaşık olarak azalır. Yükleme ve boşaltma olaylar deplasman grafiğine yüklemek için ilgili olabilirtepki döneminde asgari değiştirmesini göstermektedir s (C). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4. Temsili yük-deplasman eğrileri ve "pushback" etkisi PDMS kullanarak aşağıdan eğrileri:. Çapraz bağlayıcı oranlarında monomer azalan PDMS arasında yük-zaman ilişkileri malzeme özelliklerindeki farklılıkları tespit etmek yerinde yükleme ünitesinde yeteneğini ortaya koymaktadır. Top eğrileri, sol ve sağ dolayı malzeme kurtarma sisteminin tepki olarak değişiklik göstermektedir. Karşılaştırıldığında sağ ve sol 1:25 ile 1:05 PDMS'nin arasındaki iyileşme fark az ya da içinde olmadığını belirten aynı etkiyi göstermektediryükleme cihazı saptama sınırı. B) rijit gövde alüminyum, deneysel numune, ve 3 PDMS örneklerin dahil olmak üzere farklı malzemeler için yük-deplasman eğrileri. Bu, malzemenin sertliğini hesaplamak için kullanılan yükleme eğrisinin% 30 doğrusal parçası eğimidir. büyük resim görüntülemek için.

Şekil 5,
Şekil 5,. PDL yapı geliştirme için lekeli alt ikinci büyük azı dişlerinin X-ışını sanal bölümleri. Işlenmemiş molarlar içinde (A, B) Gri skala değerleri kompleksi içinde yumuşak bölgelerde dahil olmak üzere çeşitli dokuların X-ray zayıflama gösterir. Ancak, bu tür PDL gibi nonmineralized dokuları nedeniyle m vurgulanan değilinimal 75 kVp X-ışını enerji özelliklerini zayıflatan. Yumuşak PDL zayıflatıcı özelliklerini boyama (CF) sonra PTA geliştirilmiş ve PDL içinde bilgilerini bir X-ışını mikroskopi kullanılarak görselleştirilmiştir. Böylece, 2D sanal sagital (C-4X büyütme, E-10X büyütme) ve enine (D-4X büyütme, F-10X büyütme) bölümleri PDL lif yönü (sarı oklar) saptandı. Pulpa uzay boyanmamış kalırken Endosteal alanlarda (turuncu oklar) ve PDL (beyaz oklar) içindeki kan damarlarının lümen, koyu dairesel yapılar görünür. Boyama işlemi sırasında oluşturulan eserler de (D, kırmızı yıldız) not edilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 6, fo: src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg" />
Şekil 6,. Konsantrik ve eksantrik yüklü örnekleri. Top (A) ve alt paneller (B) yüksüz diş-kemik ilişkisinin hızlı zamanı filmleri göstermek ve sırasıyla eş ve eksantrik 15 N, yüklenen zaman. Üst ve alt paneller zaman tedavi edilmemiş (A) ve lekeli (B) koşullar kemik-diş ilişkiyi gösterir. Merkez paneli (C) (sol eğrileri) yüklü kompleksleri, ve lekeli ve lekesiz (sağ eğrileri) kompleksleri eksantrik ve eş arasında farklı yük-deplasman davranışları göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

147/51147fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg "/>
(A) eş merkezli olarak yüklenir ve eksantrik (B) sıkıştırma. Çoğunluğu interradiküler (ok başları) ve uç (oklar) bölgeleri içinde görülebilir iken 2. molar Şekil 7. Sagital kısmı alveol yuva ile dişin ilişkiyi göstermektedir. Eksantrik yükleme (B) 'de dişin sanal bölümleri ile karşılaştırıldığında, diş hareket nedenlerinden ek dönme bileşen meziyal kökünün uzak tarafına sıkıştırma yükselmiştir. Kaplanmış enine kesitler (gri) bir eş yüklü dişe uzak çeviri ve dişin saat yönünde dönme hareketi (yeşil kökler) göreceli saptandı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 8, Şekil 8,. Yeniden 3D filmleri (E) eksantrik olarak yüklenen bir eş yüklü kompleksi (D) kıyasla kökün uzak yan içinde azalan bir PDL-alan ortaya koymaktadır. Tıklayın burada eksantrik yükleme görmek ve ardından burada eş yükleme görmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolü kurulmasında ilk adım rijit bir gövde kullanarak yükleme çerçevenin sertliğini değerlendirmek içeriyordu. Sonuçlara göre, önemli ölçüde daha düşük sertlik sertlik değerleri ile örneklerin daha fazla test için yükleme tertibatının kullanılmasını sağlayan önemli ölçüde daha yüksek idi. İkinci adım, rijit bir gövde, farklı çapraz yoğunlukları PDMS malzeme ve lifli eklemleri kullanarak oluşturulan yükleme-boşaltma eğrisinin iki fazını kullanarak farklı sertlik değerleri ayırmak için enstrümanın yeteneğini vurgulanır. Tepki aşamasında yükleme fazı ve pushback gelen sertlik boşaltma aşağıdaki yükleme ve malzemenin geri kazanım için materyalin direncini belirlemek için kullanılır (Şekil 3 ve 4). Protokolün üçüncü ve dördüncü adımlar t ile yapılan in situ görüntüleme için yükleme cihazından elde edilen yük-yer değiştirme eğrileri değişiklikleri ilişki vardıo X-ışınları (Şekil 5) kullanımı. Bu eklem yükleme ve sırasıyla konsantrik ve eksantrik koşullar altında, yüksüz ve yük tomogram elde çıkıyor. Protokol PDL-sıkıştırma seviyelerinde yükleme eksen farklılıklar değiştirerek (Şekiller 6 ve 7) gibi önemli olduğunu göstermiştir. Bu tartışmada ilk enstrüman özellikleri ve yeterince anlaşılmış ve önceki kemik-PDL-diş kompleksinin biyomekanik test için yerine getirilmesi gereken zorlukları vurgulamak olacaktır.

Deney düzeneği Zorlukları

Kompozit birikimini: Protokol kendisi nispeten basit iken, büyük bir özenle yapılması gereken birkaç adım vardır. En büyük zorluklardan biri daha sonra mekanik birden fazla diş bağlayacak komşu dişlerin, o aşırı kompozit malzeme taşma vermedi sağlamak ve eklem Mechan yanlış olduTek bir diş ics. Diş araçlarının önemli el becerisi ve bilgisi bu işlem için yararlı olduğu kanıtlanmıştır yana, yükleme için numunelerin hazırlanması öncelikle optik büyütme yardımı ile diş hekimliği öğrencileri ve diş hekimleri tarafından yapıldı.

Tutarlı yükleme şeması: biyomekanik test için bir diğer önemli ayrıntı tutarlı bir yükleme düzeni sağlamak oldu. In situ yükleme cihazının çenesi ve bileşiğin karşı yüzey arasındaki temas alanı deney için çok önemli olduğunu kanıtladı. Lifli eklem mekaniği konsantrik ve eksantrik (dengesiz) yükler kullanılarak bu çalışmada simüle edilmiş temas alanının bir sonucu olarak değişebilir çünkü bu. Bu çalışmada sunulan senaryo alveol soket içinde diş hareketinde bir değişim (Şekil 5) neden olabilecek, memeli dişlerin tıkanması olası değişiklikleri taklit eder. Bu tha anlaşılır dat önerilen test mekanizması standart bir test yöntemi olarak sunar, fizyolojik çiğneme döngüsü taklit etmez. Yükleme aşamasında çene bir yüzeye paralel bir kompozit birikimini oluşturarak, biz tutarlı bir yükleme desen oluşturmak başardık. Bu standart test yöntemi çeşitli deneysel gruplarından kemik-PDL-diş komplekslerinin biyomekanik değişiklikleri tanımlamak için kullanılır.

In situ yükleme cihazının Hassasiyet: Deneysel protokol, algılama sınırları doğrulamak için yöntemleri açıklar iki standart malzeme olarak kabul edilebilir olan üç farklı örnekleri kullanarak, in situ olarak yükleme cihazı. Alüminyum ile test yükleme çerçevesinin sertliği çeşitli PDMS örneklerinin gözlemlenen mekanik davranış ve lifli ortak biyomekanik tepkisine ihmal edilebilir bir katkı ile önemli ölçüde daha yüksek idi. Test edilen tüm örneklerin bir tepki dönemi arasında iken~ 3 saniye hafifçe numune tipine (Şekil 4A) çeşitli tepki kısmının şekli. Yumuşak örnekler keskin bir düşüş (Şekil 4A) sergilemek vermedi rijit örnekler gerici yükü keskin bir düşüş (Şekil 3A ve 4A) sergiledi. Bu tepki davranışı farklılık vites bozma sırasında dişliler geri itmek için numunenin yeteneği atfedilen olduğu söylenebilir. Çene uzak örnekten hareket etmeye başlar gibi dişliler üzerinde itme geri etkisi malzemenin zirve gerici yanıtında daha düşük bir damla içine tezahür olabilir. Böylece, boşluklu bölüm malzeme özelliği için anlayışlar kazanmak için istismar edilebilir. Yük deplasman eğrileri hesaplanan PDMS sertlik değerleri edebiyatı 22 değerleri ile anlaşmaya vardı ve çapraz PDMS için sertlik aralığı kemik-PDL-diş kompleksinin aralığında oldu. Bu nedenle, in situ yükleme device bu alveoler sokete sıkıştırdığında dişin yer değiştirmesini ve gerici yanıtının ölçülmesi için uygundur. Gerici tepki yumuşak ve / veya sert bileşenlerinden olabilir. Daha fazla yumuşak kurucu hakimiyeti dijital kemik-diş PDL-kompleksi 13 içinde soyu çoğunlukta olduğu bölgeleri tespit etmek yüklü koşulları hiçbir yük ilişkilendirerek, ardından aşamalı olarak görüntüleme ve yükleme ile tespit edilebilir.

Çiğneme temel bileşen eksenel yönde: insanlara benzer, sıçanların çiğneme döngüsü gıda 23, 24 çiğnemek mandibulanın serbest hareket içerir. Bu hareketi bu yanal hareketleri gibi pek çok farklı yönleri içerir eşlenmiş olsa da, yük ana bileşeni, eksenel yönde 23 içinde olduğu düşünülmektedir. Bu yüzden, eksenel doğrultuda yerinde yükler simüle konsantrik ya yerleştirildily veya eksantrik (Şekil 2).

Organ düzeyinde biyomekanik ilişkin sonuçlarını etkileyebilecek Deneysel faktörler: yerinde yükleme ile X-ışını mikroskobu bağlanması avantajı yük-deplasman eğrisi alveol soketi, kök formu ile dişin mekansal dernek korelasyon olmasıdır ve alveol yüzey, ve yük altında PDL-alan daralma ve genişleme. Korelasyon ve tamamlayıcı değerlendirme organı biyomekanik belirlemek için bütünsel bir yaklaşım sağlar. Geçmişte, sadece bir organ ve / veya dokuların mekanik yük-yer değiştirme davranışı isteyebilir konutlanmıştır. Bu protokol yük altında hareket eden üyelerin dernek de gözlenen sertlik belirleyici bir özelliği olabilir gösterilmiştir. Ilk 5-8 N gözlenen herhangi bir değişiklik PDL kalitesi içinde bir ilk yapısal değişiklik katkıda düşünülmektedirkollajen ve yüklemek için minimum direnç ile interstisyel sıvı değişimi, bu bölge "uncrimping" Bölgede 26 olarak anılır olmuştur. 7 N daha yüksek yükler diş, kemik, periodontal ligament gerginlik-sertleştirme efektleri ve dokuları takılarak arayüzler katkıda olabilir. PDL-boşluk minimize ve PDL pekleşmesi uğrar gibi, diş ve kemik yuva arasında sert doku etkileşimleri yamaç deplasman için bir dik yük sonuçlanan interradiküler bölgede ortaya sonra. Malzeme geri kazanımı ek olarak, yükleme cihazın tepki diğer çalışmalar 16, 25 olarak yapıldı ortak değiştirmeden PDL viskoelastik doğasını araştırmak için kullanılabilir.

Yük deplasman eğrileri içindeki genel bölgeleri eklem içinde bazı olaylara bağlantılıdır. Yukarıdaki olaylar iki yükleme şemaları arasında ortak paydalar vardır. Ancak farklarkonsantrik ve eksantrik yük-deplasman profilleri ve ilgili tomogram arasındaki genel organı biyomekanik yük yönde etkisi vurgulanır. Bu farklılıkların ana kaynağı belirli alanlarda PDL mekanların sıkıştırma neden, eklem içinde yerinden olarak bir diş dönme giriş oldu. Bu normal fizyolojik yüklerin dönme hareketini tanıtmak diş de dahil olmak üzere çeşitli doğrultularda diş uygulanır anlaşılmaktadır. Ancak, bir eş yükleme düzeni tüm numuneler arasında bir "standart" eksantrik yük tatbik edilmesi zor olduğu için standart bir yükleme şeması olarak kullanılması tavsiye edilir. Bunlar da bu deneysel protokol uyarlanmış nonadapted sistemleri arasındaki farklılıklar biyomekanik ayırt etmek için kullanılabilir gibi.

Yüksek enerji X-ışınları kullanılarak sakıncaları biri de minimal yumuşak dokular tarafından emilir ve yetersiz kontrast üretilmiş olmasıdır. PDL transpare olduğununt X-ışınları ve bir sonuç kontrast ajanlarının kullanımını zorunlu kılmaktadır. PTA doğrudan 27-29 boyama ve X-ışınlarını kullanarak görselleştirme için izin vererek yumuşak dokuların kontrast artırır. Bu nedenle, yüklü ve yüksüz tomografisinde arasında boyanmış yumuşak doku bölgeleri içinde kontrast maddeleri, görünür deformasyon kullanarak gözlendi, ancak daha yüksek bir büyütme (en az 10 X) analizi (veriler gösterilmemiştir) için tavsiye edilir. Boyama protokolü bir sınırlama etanol kullanımını PDL ve hatalı sonuçlara yol açan tüm eklem mekaniği sertliğini değiştirilmiş olabilir hafif bir fiksatif 29 dahildir.

SONUÇLAR

Bu çalışma, sağlam bir kemik-PDL-diş lifli eklem biyomekanik yanıt analiz için yeni bir test protokolü vurgular, ancak ex vivo koşullar altında. Veri analizi sonrası da dahil olmak üzere tarif edilen deneysel yöntem, Exper etkilerinin ölçülmesi için kullanılabilirimental değişkenler (yani hastalık, büyüme faktörleri, yaş, ve terapötik moleküller) kemik-PDL-diş lifli eklem mekaniği. Ayrıca, bu deneylerden sonuçlar macroscale Organ düzeyinde varyasyonları arasındaki ilişkileri doku ve hücresel düzeyde özel değişikliklerle ilgili olabilir hangi için bir temel olarak hizmet edecektir. Protokol sınırlamalar, ex vivo koşullar altında, görüntüleme, kontrast ajanlarının kullanımı ve tomogram üretimi için gerekli olan uzun süreleri elde etme sırasında nedeniyle doku gevşeme diş ve alveolar yuvanın yüzeyleri arasındaki mekansal hassasiyet kaybı bulunmaktadır.

YARDIMCI MALZEME

Üst çene içinde azıdişinin biyomekanik testleri için Protokol:

1.. Üst çene test edilecek olsaydı, yukarı bakacak ventral (ağız çatı), her sıçan kafatası maksilla çıkarın. Kas ve bağ bağ dokuları itibaren Severvestibül (dişeti ve yanak arasında cep) ile keserek kafatasının lateral.

2. Palpe ve kafatası maksiller kemiğin zigomatik süreci kırılan ve maksiller kemik elmacık kemer sever.

3. Düz aşağı yumuşak damak başlayarak beyin aracılığıyla toplu diseksiyonu bir makas ile kafatası kesti. Kafatasının anterior yönü izole ve uzak kafatası dorsal (üst) kafa derisi soyma.

4. Ince diseksiyon makas bir çift, sert damağın merkezinden geçen ve ön dişler arasındaki bitişme bölgeye düz bir çizgi izler bir kesi yaparak sağ ve sol hemimaxillae ayrı. Kesme derinliği sığ olduğundan emin olun - sadece yeterince derin sert damak delmek için.

5. Insizyon (kafatası uzun eksenine) dikey yaparak hemimaxillae izoleÜçüncü molar birinci molar ve posterior anterior. 1) Bu kök yapısı kesebileceği için birinci ve üçüncü azı dişleri çok yakından kesmeyin; 2) Tüm üç azılarını çevreleyen dişeti dokusu uzak rip etmeyin. Her hemimaxilla üstün ince maksiller kemik keserek kafatası hemimaxillae ayırın. Herhangi bir aşırı doku ve kemik spiküllerin çıkarın.

Mekanik test cihazı doğrulama:

Yükleme çerçevenin sertlik ve yük / yer değiştirme transdüktörün sürüklenme belirlemek amacıyla, deney numunesinin çok daha yüksek böyle bir elastik modül ile alüminyum gibi sert bir gövde kullanır.

Gösterge yumuşak elemanları çeşitli sertlik değerleri temsil eden ayırt yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için, farklı çapraz bağlama yoğunluğu (01:05, 01:10, ağırlıkla taban 1:25 çapraz bağlayıcı) ile PDMS blokları üretmek ve aynı kullanarak bu yükYerinde yükleme cihazı olarak.

Yumuşak elemanların kontrast için Faz Kontrast Modu: PDL Kontrast geliştirme tarayıcının faz kontrast modunu istismar yapılabilir. Temel olarak, faz kontrast dokuların kenarlarında fazda bir kaymanın tarayıcı algılama yetenekleri patlatır ve gelişmiş yapısal ayrıntı sağlar. Sonuç olarak, bu çalışmada, cementocyte-boşluklar ve osteosit-boşluklar arasında boşluklar ilgili mineralize dokuları içinde gözeneklilik olarak ortaya çıktı. Bu yapılar daha önce emme modunda standart bir tarama tespit edilmemiş edildi. Tomogramlar negatif boşluk, yani PDL-uzay ve harvers kanal sistemi (3D model için Şekil S1 bakınız) dahil olmak üzere Endosteal boşluk içindeki yapıların görüntülenmesi için izin iletim modu altında satın aldı. PDL-alanı içinde ek yapılar, bu i ile süreklidir, damar olarak, hem de görüntülenmiştir edilebilirn kemik.

Tomogram edinme ve sistem sürüklenme için dengelenmiş yükler:. Bu bölümde en iyi Ek Şekil 2 bakarak açıklanabilir Şekil S2A önce tomogram edinme pik yükleri dengelenmeye ihtiyacı gösterir. Pik yükler her zaman daha düşük bir büyüklüğe çürüme ve 6-8 saat tomogram elde edilir önce sistemi bir saat boyunca en az dengelenmelidir. Bu edinilen tomogram pik yükte kemik-diş dernek temsilcisi değildir, ama dikkat edilmelidir pik yük daha 2-3 N düşük bir yükte. Ayrıca sert bir alüminyum saplama kullanılarak tespit ölçülen sistem sürüklenme deplasman oranı ve / veya pik yükler (Şekil S2B ve S2C) ile değiştirmek bulundu. Yaklaştırılmış kayma değerleri + 1 N / saat arasında değişmektedir.

Mekanik testler sonra, lifli ortak bir tomogram yüksüz alındı, ve istenen yer değiştirme hızında bir pik yük. Önceki yüklenen koşullar altında bir tomogram edinme, bakım sistem tarama devam gereken bir denge (kararlılık) şu gelmek için izin alınmalıdır. Benzer koşullar eksantrik olarak yüklenen ve PTA lekeli kompleksleri için tekrarlandı. Tomogram, Sanal dilimler, iki ve üç boyutlu olarak her iki diş, kemik ilişkiyi belirlemek amacıyla yüklü koşulları yüksüz karşılaştırıldı.

Ek Şekil 1. Faz kontrast geliştirilmiş X-ışını mikroskobu kullanılarak negatif alan 3 boyutlu rekonstrüksiyon. Faz kontrast modu altında dokuların kenarlarında meydana gelen faz kayması PDL içindeki kan damarları vurgulamak için istismar edildi. Iletim modu (sağda) endesiteal alanlarda yanı sıra PDL alanı içinde kan damarları vurgulanan ederken özellikle emme modu (solda), görüş alanı içinde mineralize dokuların vurgulanır.

çadır "> önceki CT-tarama bir denge durumuna Ek Şekil 2 pik gerici güçlerin. çürüğü. Eğriler lifli bir eklemin (üst panel) gerici tepkinin farklı bozunma oranları gösterir ve sert bir gövde (alt panel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Yazarlar finansman desteği NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645, (SPH) ve Koruyucu ve Restoratif Diş Bilimleri Bölümleri kabul ve orofasial Bilimler, ucsf. Ayrıca, yazarlar Xradia Lisans Bursu (AJ), Xradia Inc, Pleasanton, CA kabul.

Yazarlar verilerinin sonradan işleme ile ona yardım için Dr Kathryn Grandfield, ucsf ederim; Drs. Stephen Weiner ve Gili Naveh, Fen Rehovot'taki, İsrail Weizmann Enstitüsü; situ yükleme cihaza özgü onların anlayışlı tartışmalar Dr Ron Shahar, Kudüs Hebrew Üniversitesi, İsrail. Yazarlar ayrıca Micro XBT kullanımı ve in situ yükleme cihazı için ucsf de Biomateryaller ve Biyomühendislik mikroBT Görüntüleme Tesisi teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bard Parker Blade BD MEDC-001054
AFM metal disk Ted Pella 16218
Polymethyl methacrylate  GC America N/A
Uni-Etch Bisco E5502EBM
Optibond Solo Plus Kerr Corp N/A
Filtek Flow 3M N/A
Hurculite Ultra Kerr 34346
Tris buffer Mediatech Inc. N/A
Articulating paper Parkell Inc.
Phosphotungstic Acid Sigma Aldrich HT152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Popowics, T. E., Rensberger, J. M., Herring, S. W. Enamel microstructure and microstrain in the fracture of human and pig molar cusps. Arch. Oral Biol. 49, 595-605 (2004).
  2. Jantarat, J., Palamara, J. E., Messer, H. H. An investigation of cuspal deformation and delayed recovery after occlusal loading. J. Dent. 29, 363-370 (2001).
  3. Jantarat, J., Panitvisai, P., Palamara, J. E., Messer, H. H. Comparison of methods for measuring cuspal deformation in teeth. J. Dent. 29, 75-82 (2001).
  4. Asundi, A., Kishen, A. A strain gauge and photoelastic analysis of in vivo strain and in vitro stress distribution in human dental supporting structures. Arch. Oral Biol. 45, 543-550 (2000).
  5. Asundi, A., Kishen, A. Advanced digital photoelastic investigations on the tooth-bone interface. J. Biomed. Opt. 6, 224-230 (2001).
  6. Wang, R. Z., Weiner, S. Strain-structure relations in human teeth using Moire fringes. J. Biomech. 31, 135-141 (1998).
  7. Wood, J. D., Wang, R., Weiner, S., Pashley, D. H. Mapping of tooth deformation caused by moisture change using moire interferometry. Dent. Mater. 19, 159-166 (2003).
  8. Dong-Xu, L., et al. Modulus of elasticity of human periodontal ligament by optical measurement and numerical simulation. Angle Orthod. 81, 229-236 (2011).
  9. Li, J., Li, H., Fok, A. S., Watts, D. C. Multiple correlations of material parameters of light-cured dental composites. 25, 829-836 (2009).
  10. Zhang, D., Arola, D. D. Applications of digital image correlation to biological tissues. J. Biomed. Opt. 9, 691-699 (2004).
  11. Zhang, D., Mao, S., Lu, C., Romberg, E., Arola, D. Dehydration and the dynamic dimensional changes within dentin and and enamel. Dent. Mater. 25, 937-945 (2009).
  12. Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
  13. Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. (2012).
  14. Qian, L., Todo, M., Morita, Y., Matsushita, Y., Koyano, K. Deformation analysis of the periodontium considering the viscoelasticity of the periodontal. 25, 1285-1292 (2009).
  15. Huelke, D. F., Castelli, W. A. The blood supply of the rat mandible. Anat. Rec. 153, 335-341 (1965).
  16. Chiba, M., Komatsu, K. Mechanical responses of the periodontal ligament in the transverse section of the rat mandibular incisor at various velocities of loading in vitro. J. Biomech. 26, 561-570 (1993).
  17. Natali, A. N., et al. A visco-hyperelastic-damage constitutive model for the analysis of the biomechanical response of the periodontal ligament. J. Biomech. Eng. 130, (2008).
  18. Naveh, G. R., Shahar, R., Brumfeld, V., Weiner, S. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone: A dynamic 3D microCT study of the rat molar. J. Struct. Biol. 177, 477-483 (2012).
  19. Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
  20. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
  21. Carrillo, F., et al. Nanoindentation of polydimethylsiloxane elastomers: Effect of crosslinking, work of adhesion, and fluid environment on elastic modulus (vol 20, pg 2820). J. Mater. Res. 21, 535-537 (2006).
  22. Hiiemae, K. M. Masticatory function in the mammals. J. Dent. Res. 46, 883-893 (1967).
  23. Hunt, H. R., Rosen, S., Hoppert, C. A. Morphology of molar teeth and occlusion in young rats. J. Dent. Res. 49, 508-514 (1970).
  24. Komatsu, K., Sanctuary, C., Shibata, T., Shimada, A., Botsis, J. Stress-relaxation and microscopic dynamics of rabbit periodontal ligament. J. Biomech. 40, 634-644 (2007).
  25. Lin, J. D., et al. Biomechanics of a bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint. J. Biomech. 46, 443-449 (2013).
  26. Quintarelli, G., Zito, R., Cifonelli, J. A. On phosphotungstic acid staining. I. J. Histochem. Cytochem. 19, 641-647 (1971).
  27. Quintarelli, G., Cifonelli, J. A., Zito, R. On phosphotungstic acid staining. II. J. Histochem. Cytochem. 19, 648-653 (1971).
  28. Quintarelli, G., Bellocci, M., Geremia, R. On phosphotungstic acid staining. IV. Selectivity of the staining reaction. J. Histochem. Cytochem. 21, 155-160 (1973).
  29. Crabtree, W. N., Murphy, W. M. The value of ethanol as a fixative in urinary cytology. Acta Cytol. 24, 452-455 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats