Unprocessed पूरे रक्त से न्युट्रोफिल Chemotaxis मापने के लिए मंच microfluidic

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Bioengineering

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Summary

इस प्रोटोकॉल मजबूत reproducibility के साथ पूरे रक्त की एक छोटी बूंद से मानव न्युट्रोफिल chemotaxis को मापने के लिए बनाया गया एक परख विवरण. यह दृष्टिकोण न्युट्रोफिल जुदाई के लिए की जरूरत में गतिरोध उत्पन्न और परख तैयारी के समय के कुछ ही मिनट की आवश्यकता है. microfluidic चिप शिशुओं या नमूना मात्रा सीमित है जहां छोटे स्तनपायी, में समय के साथ न्युट्रोफिल chemotaxis के दोहराया उपाय सक्षम बनाता है.

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Jones, C. N., Hoang, A. N., Dimisko, L., Hamza, B., Martel, J., Irimia, D. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. J. Vis. Exp. (88), e51215, doi:10.3791/51215 (2014).

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Abstract

न्यूट्रोफिल रक्त में संक्रमण और उनकी संख्या के खिलाफ संरक्षण में एक आवश्यक भूमिका निभाते अक्सर क्लिनिक में मापा जाता है. कम न्युट्रोफिल मायने रखता संक्रमण के लिए उच्च जोखिम के लिए एक चेतावनी के संकेत हैं, जबकि रक्त में उच्च न्युट्रोफिल मायने रखता है, आम तौर पर चल रहे संक्रमण का सूचक हैं. उनके कार्यों को पूरा करने के लिए, neutrophils भी संक्रमण होते हैं जहां ऊतकों में, वे अपने जीवन के सबसे अधिक खर्च जहां खून से प्रभावी ढंग से ले जाने के लिए सक्षम होना चाहिए. नतीजतन, विस्थापित करने के लिए neutrophils की क्षमता में कोई दोष neutrophils रक्त में उचित संख्या में मौजूद हैं, तब भी जब संक्रमण के लिए जोखिम को बढ़ा सकते हैं. हालांकि, क्लिनिक में न्युट्रोफिल प्रवास क्षमता को मापने, समय लेने वाली है, जो एक चुनौती भरा काम है, बड़े रक्त की मात्रा, और विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता है. इन सीमाओं का पता करने के लिए, हम परिस्थितियों, unprocessed रक्त की एक छोटी बूंद की आवश्यकता है, जो न्युट्रोफिल प्रवास के लिए एक मजबूत microfluidic assays बनाया गयान्युट्रोफिल जुदाई के लिए की जरूरत vents, और एक साधारण माइक्रोस्कोप पर यों के लिए आसान है. इस परख में, neutrophils chemoattractant के स्रोत की ओर, छोटे चैनलों के माध्यम से, रक्त छोटी बूंद से सीधे चले जाते हैं. एक ही चैनल के माध्यम से लाल रक्त कोशिकाओं की बारीक प्रवाह को रोकने के लिए, हम चुनिंदा लाल रक्त कोशिकाओं की अग्रिम कि ब्लॉक बदल जाता है सही कोण के साथ यांत्रिक फिल्टर लागू किया है. हम उंगली चुभन और शिरापरक रक्त से एकत्र रक्त बूंदों से न्युट्रोफिल प्रवास तुलना करके परख मान्य. हम भी शुद्ध neutrophils के नमूनों से न्युट्रोफिल प्रवास के साथ इन पूरे रक्त (पश्चिम बंगाल) के सूत्रों की तुलना में और तीन स्रोतों के बीच लगातार गति और दिशात्मकता पाया. इस मंच microfluidic स्वास्थ्य और रोग में न्युट्रोफिल कार्यों के बारे में हमारी समझ अग्रिम में मदद करने के लिए क्लिनिक और अनुसंधान सेटिंग में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा.

Introduction

न्युट्रोफिल तस्करी atherosclerosis 1, जीवाणु संक्रमण या पूति 2 सहित कई भड़काऊ शर्तों, की प्रगति और संकल्प का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और चोट 3 जला. स्वास्थ्य और बीमारी की स्थिति के लिए अपने प्रमुख योगदान के लिए, न्युट्रोफिल गिनती अक्सर नैदानिक ​​और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में माना मानक रक्त विश्लेषण का हिस्सा है. हालांकि, सबसे सर्वव्यापी परीक्षणों में से एक, संक्रमण और पूति के निदान में न्युट्रोफिल गिनती के मूल्य होने के बावजूद अक्सर 4 पूछताछ की गई है. उदाहरण के लिए, रोगियों को जलाने में neutrophils के एक अध्ययन न्युट्रोफिल गिनती और न्युट्रोफिल प्रवास समारोह सहसंबंधी नहीं है कि पता चला; कि न्युट्रोफिल अकेले गिनती वाचक प्रतिरक्षा स्थिति 3 का सही संकेत नहीं है. मापने के लिए और अधिक कठिन है, न्युट्रोफिल कार्यात्मक क्षमता स्थितियों की एक विस्तृत रेंज में अधिक मूल्यवान के रूप में प्रस्तावित किया गया है.

टी "> महत्वपूर्ण बात है, न्युट्रोफिल दोष के कई क्षणिक हैं और स्थायी आनुवंशिक दोष, मोटे तौर पर हाल ही में जब तक क्लिनिक में अनदेखी की गई है कि एक अंतर से चालू होने वाले नहीं हैं. जला चोटों के संदर्भ में, न्युट्रोफिल प्रवास के दौरान नजर रखी जा सकता है भड़काऊ स्थिति या संक्रमण 3 के एक संकेत के रूप में एक मरीज ​​के उपचार वे रक्त की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. वर्तमान में प्रयोगशाला (Boyden कक्ष, डन कक्ष, micropipette परख) में इस्तेमाल किया पारंपरिक प्रवास assays एक नैदानिक ​​सेटिंग में अनुवाद नहीं किया जा सकता और बोझिल समय लेने वाली न्युट्रोफिल अलगाव के लिए आवश्यक रक्त की मात्रा केवल एक नमूना के लिए अनुमति देता है और अक्सर भी पूलिंग की आवश्यकता है क्योंकि न्युट्रोफिल अलगाव तकनीक (1 टेबल). ये assays भी, चूहों जैसे छोटे पशु प्रयोगशाला में न्युट्रोफिल chemotaxis में क्षणिक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता एक एकल परख के लिए कई जानवरों से खून. उदाहरण के लिए, शामिल अध्ययन एमकई समय अंक से अधिक एकाधिक शर्तों और उपचार के संभावित वर्तमान chemotaxis assays का उपयोग चूहों के हजारों की आवश्यकता सकता है. इस चोट, संक्रमण के संदर्भ में प्रतिरक्षा समारोह की जटिल गतिशीलता को समझने या अक्सर murine मॉडल 5 में अध्ययन जलाने के लिए किया जा सकता है कि बुनियादी जैविक अनुसंधान प्रतिबंधित करता है.

कम से कम रक्त की मात्रा की आवश्यकता होती है, जबकि तेजी से मजबूत है कि एक न्युट्रोफिल कार्यात्मक परख की आवश्यकता का पता करने के लिए, हम पूरे रक्त का एक छोटा सा छोटी बूंद से सीधे न्युट्रोफिल chemotaxis उपाय है कि एक microfluidic युक्ति को विकसित किया है. यह सीरम 6 और प्लेटलेट्स 7 सहित पूरे रक्त में कई कारकों, न्युट्रोफिल समारोह को प्रभावित कर सकता है. यह पूरे रक्त microfluidic परख इन विट्रो परख 8 के साथ chemotaxis में बदलाव को मापने जब ​​न्युट्रोफिल के vivo microenvironment बनाए रखने के लिए नमूना प्रसंस्करण कि कम से कम इसलिए फायदेमंद है. यह दृष्टिकोणरक्त संग्रह से परंपरागत तकनीक का उपयोग घंटे से न्युट्रोफिल प्रवास assays के लिए समय कम कर देता है बस मिनट (तालिका 1) के लिए. पूरे रक्त microfluidic मंच, प्रयोग की लंबाई के लिए एक स्थिर रेखीय chemoattractant ढाल का उत्पादन नहीं चलती भागों है, और एक बाहरी दबाव स्रोत (यानी सिरिंज पंप) की आवश्यकता नहीं है. पूरे रक्त microfluidic डिवाइस के डिजाइन में प्रमुख विशेषता यंत्रवत् डिवाइस के प्रवास चैनल में प्रवेश करने से लाल रक्त कोशिकाओं कि फिल्टर एक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) निस्पंदन कंघी का समावेश है. इस निस्पंदन कंघी के दाएँ मुड़ता संभावना लाल रक्त कोशिकाओं से भरा किया जाएगा जो आकार अपवर्जन निस्पंदन, के लिए की जरूरत को रोकने और इसलिए पश्चिम बंगाल में सक्रिय रूप से पलायन neutrophils तक पहुँचने से chemoattractant ढाल ब्लॉक. एक 12 या 24 अच्छी तरह से थाली में पूरे रक्त microfluidic डिवाइस का समावेश मानव या murine न्युट्रोफिल chemotaxis सी के कई मध्यस्थों की स्क्रीनिंग की सुविधाmultaneously.

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Protocol

1. Microfluidic डिवाइस निर्माण

  1. मानक photolithographic तकनीक का उपयोग करना, एक वर्ग 1,000 साफ कमरे में मास्टर मोल्ड वेफर बनाना. पैटर्न निर्माता से निर्देश के अनुसार प्रवास चैनलों को परिभाषित करने के पहले 3 माइक्रोन पतली epoxy आधारित नकारात्मक photoresist परत. पैटर्न सेल लोडिंग और केमोकाइन कक्षों को परिभाषित करने के लिए दूसरा 50 माइक्रोन मोटी परत.
  2. Polydimethylsiloxane (PDMS) उपकरणों कास्ट करने के लिए नमूनों वेफर का प्रयोग करें. सख्ती बड़े प्लास्टिक वजन ट्रे में प्लास्टिक कांटा का उपयोग कर 5 मिनट के लिए सर्जक (2 जी) के साथ PDMS (20 ग्राम) मिश्रण.
  3. सावधानी मोल्ड पर PDMS डालना.
  4. 1 घंटे के लिए एक निर्वात desiccator में डाला PDMS साथ मोल्ड रखकर PDMS देगास.
  5. सेंकना और 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक ओवन में कम से कम 3 घंटे के लिए PDMS microfluidic उपकरणों का इलाज
  6. 1.5 मिमी की एक टिप व्यास के साथ एक पंचर का उपयोग केंद्रीय WBLCs पंच.
  7. एक punc उपयोग कर पूरे डोनट के आकार उपकरणों पंच5.0 मिमी की एक टिप व्यास के साथ उसे.
  8. चिपकने वाला टेप का उपयोग डोनट उपकरणों से कणों को दूर.
  9. विआयनीकृत पानी और नाइट्रोजन के साथ तो सूखे के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली कुल्ला. 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में थाली प्लेस.
  10. ऑक्सीजन प्लाज्मा दो बार 12 अच्छी तरह से थाली का इलाज; एक बार अकेले 35 सेकंड के लिए और उसके बाद फिर से एक और 35 सेकंड के लिए डोनट उपकरणों के साथ.
  11. ध्यान से चिमटी का उपयोग कर थाली के कुओं में उपकरणों की जगह है.
  12. 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म थाली पर बंधुआ उपकरणों के साथ सेंकना थाली.

2. Microfluidic परख तैयारी

  1. तुरंत ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के बाद प्रधानमंत्री microfluidic उपकरणों डिवाइस हाइड्रोफिलिक है और केशिका प्रभाव डिवाइस में छोटे चैनलों के भड़काना प्रचार कर सकते हैं जब.
  2. 5 μl फ़ाइब्रोनेक्टिन [शेयर समाधान 1 मिलीग्राम / एमएल] और 490 μl HBSS के साथ 5 μl fMLP [शेयर समाधान 10 माइक्रोन] के मिश्रण से chemoattractant समाधान बनाएँ.
  3. धीरे धीरे pipet & #160; WBLC में chemoattractant समाधान, एक जेल लोड हो रहा है टिप (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर. डिवाइस के बाहर चारों ओर chemoattractant की pipet एक अतिरिक्त 20 μl.
  4. 15 मिनट के लिए एक desiccator में थाली प्लेस. इस उपकरण के लिए एक निर्वात लागू करके, समाधान डिवाइस और PDMS के माध्यम से बाहर दूर तक फैला हुआ विस्थापित हवा का पक्ष चैनलों में डाले है.
  5. Desiccator से थाली निकालें और खुर्दबीन के नीचे युक्ति चैनल के गीला पुष्टि. Chemoattractant समाधान कक्ष में प्रवेश करती है के रूप में बुलबुला छोटा हो जाता है के रूप में देखें. कोई बुलबुला निर्वात उपचार के बाद डिवाइस के भीतर मौजूद होना चाहिए.
  6. WBLC धोएं और युक्ति के बाहर अच्छी तरह से अतिरिक्त chemoattractant समाधान निकालने के लिए. यह कदम डिवाइस केंद्र को फोकल chemotactic कक्षों (FCCs) में से प्रत्येक से chemoattractant की एक ढाल उत्पन्न करता है.
    1. सिरिंज से एक 30 जी कुंद सुई टिप जोड़ने, पीबीएस के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें. धीरे, में सिरिंज की सुई टिप सम्मिलितडोनट छेद के केंद्र के लिए. धीरे छेद में पीबीएस के 100 μl धक्का इतना है कि डिवाइस के शीर्ष पर पीबीएस रूपों की एक बूँद.
    2. डिवाइस के आसपास पीबीएस के झुकाव की थाली और पिपेट 1 मिलीलीटर तरल अच्छी तरह से नीचे एकत्र करता है तो. महाप्राण (अलग हो neutrophils मीडिया में लोड किया जाएगा अगर बजाय बफर का उपयोग मीडिया) ताजा बफर समाधान का उपयोग 3x की कुल के लिए तरल और दोहराने की प्रक्रिया 9.
  7. उपकरणों के सबसे ऊपर तरल तहत जलमग्न कर रहे हैं जब तक मीडिया के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक भरें. उपकरणों ढाल स्थिर करने के लिए अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए बैठते हैं. प्रयोगात्मक परिणाम और परिमित तत्व सिमुलेशन से सैद्धांतिक डेटा इन उपकरणों में ढ़ाल छोटे अणुओं (जैसे, fMLP) के लिए और बड़ा आणविक वजन (जैसे, IL8) के लिए एक कई दिन तक 24 घंटे के लिए ऊपर स्थिर दिखा रहे हैं.
  8. जेल लोड हो रहा सुझावों का प्रयोग, धीरे धीरे प्रत्येक पूरे रक्त एलओए में 2 रक्त की μl (या पृथक neutrophils) पिपेटडिंग कक्ष (WBLC) (चित्रा 1 ए).

3. नमूना तैयार

केशिका रक्त से मानव न्यूट्रोफिल

  1. कोई immunosuppressants पर है जो स्वस्थ स्वयंसेवक, की उंगली चुभन से केशिका रक्त ले लीजिए. सभी रोगी के नमूने लिखित सूचित सहमति के साथ प्राप्त किया, और MGH और श्राइनर्स संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के माध्यम से किया गया.
    1. उंगली चुभन रक्त संग्रह के लिए, पानी और साबुन से हाथ धोने और त्वचा सूखी. रक्त संग्रह ट्यूब (1.65 USP/50 μl रक्त) हेपरिन के 1 मिलीलीटर HBSS + 0.2% HSA और 10 μl Hoechst दाग (32.4 माइक्रोन) जोड़कर anti-coagulant/stain शेयर समाधान तैयार करें. रक्त की पहली बूंद दूर पोंछ और धीरे स्टॉक विरोधी कौयगुलांट और Hoechst फ्लोरोसेंट दाग समाधान (10 μl) और युक्त Eppendorf ट्यूब में रक्त का 50 μl इकट्ठा, एक SurgiLance सुरक्षा नुकीला (2.2 मिमी गहराई, 22 जी) का उपयोग करते हुए उंगली चुभन मिश्रण.
    नाभिक फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए रक्त और Hoechst दाग सेते हैं. रक्त संग्रह के 1 घंटे के भीतर नमूना चलाएँ.

शिरापरक रक्त से मानव न्यूट्रोफिल

  1. 33 खासियत हेपरिन युक्त ट्यूबों में परिधीय, शिरापरक रक्त के 10 एमएल ड्रा.
  2. पहले से वर्णित के रूप में मीडिया और Hoechst दाग को शिरापरक रक्त के 50 μl जोड़ें. नाभिक फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए रक्त और Hoechst दाग सेते हैं. रक्त संग्रह के 1 घंटे के भीतर नमूना चलाएँ.

पूरे रक्त से न्युट्रोफिल पृथक्करण - सकारात्मक नियंत्रण

  1. , Neutrophils अलग Hetastarch का उपयोग कर 10 मिलीलीटर शिरापरक पूरे रक्त के नमूने से neutrophils अलग करने के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए (6% w / v) निर्माताओं प्रोटोकॉल के बाद एक नकारात्मक चयन चुंबकीय मनका अलगाव किट द्वारा पीछा घनत्व ढाल.
  2. एक concentr में neutrophils की अंतिम विभाज्य resuspended1X HBSS + 0.2% मानव सीरम albumin में / μl 4,000 कोशिकाओं की समझना. प्रयोग चलाने के लिए तैयार है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखें.

न्युट्रोफिल Chemotaxis माप के लिए 4. माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण

  1. 5% से कम 37 डिग्री सेल्सियस, 80% से कम आर्द्रता, और सीओ 2 को biochamber तापमान सेट करें.
  2. एक माइक्रोस्कोप (10x या उच्च वृद्धि) पर समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर तुरंत इमेजिंग शुरू.

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. स्वयं प्रत्येक नमूने में कम से कम 50 neutrophils ट्रैक.
  2. समय के साथ एफसीसी में प्रवेश कोशिकाओं (चित्रा 2) गणना.
  3. ImageJ (एनआईएच) (चित्रा 2) का उपयोग WBLC और एफसीसी के बीच चैनल में न्युट्रोफिल वेग की गणना.
  4. बंटवारे पारित कि कोशिकाओं की संख्या की गणना और है कि बाहर निकलने वें एफसीसी और कोशिकाओं की ओर बारी है कि कोशिकाओं की संख्या के बीच अनुपात की गणना के द्वारा neutrophils की दिशात्मकता योंई युक्ति. दिशात्मक नहीं हैं कि कोशिकाओं chemotactic ढाल का पालन करें और इसलिए एफसीसी और निकास चैनल (चित्रा 2) की ओर से बराबर संख्या में विस्थापित नहीं है.

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Representative Results

पूरे रक्त (पश्चिम बंगाल) न्युट्रोफिल chemotaxis परख एक fMLP ढाल (मूवी S1) की ओर neutrophils के संचय को मापने के द्वारा मान्य किया गया था. परिणाम neutrophils (नीला) को सक्रिय रूप से पूरे रक्त (चित्रा 3 ए और मूवी S1) से बाहर पलायन करने में सक्षम हैं, जबकि लाल रक्त कोशिकाओं निस्पंदन कंघी से फंस रहे हैं, इसकी पुष्टि. पूरे रक्त microfluidic डिवाइस द्वारा गठित स्थिर रेखीय chemoattractant ढाल (हरा) FITC लेबल dextran (चित्रा 3A इनसेट) का उपयोग कर पुष्टि की है और समय के साथ प्रतिदीप्ति का स्तर मापा गया था. इन उपकरणों में उत्पादित ढ़ाल बड़ा आणविक वजन के लिए छोटे अणुओं के लिए 24 घंटे तक का समय और एक सप्ताह तक स्थिर थे. वॉशिंग प्रोटोकॉल की दक्षता WBLC में कोई संकेत के साथ एफसीसी में स्थानीय फ्लोरोसेंट संकेत इमेजिंग या डिवाइस आसपास के द्वारा सत्यापित किया गया था. उपकरणों अगले अलग बीएल से न्युट्रोफिल प्रवास में मतभेद का आकलन करने के लिए नियोजित किया गयाई. सूत्रों.

उपन्यास पश्चिम बंगाल कीमोटैक्सिस मंच का उपयोग कर प्राप्त परिणाम पश्चिम बंगाल के एक उंगली चुभन छोटी बूंद से neutrophils, शिरापरक पश्चिम बंगाल से, या (लगातार वेग (20 ± 2 मिमी / मिनट, नीली रेखा) के साथ है और इसी तरह कुल प्रवासी कोशिकाओं के साथ विस्थापित शिरापरक रक्त से अलग बताते हैं कि 38 ± सभी रक्त स्रोतों (3B चित्रा) से 10 / घंटा कोशिकाओं, छायांकित सलाखों). हम भी दिशात्मकता या सही ढंग से chemotactic ढाल का पालन करने के लिए न्युट्रोफिल की क्षमता यों कर रहे थे. विभाजन हमें किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना तहत बेतरतीब ढंग से चले गए और युक्ति से बाहर निकल गया कि neutrophils के साथ तुलना में एफसीसी की ओर chemoattractant ढाल के साथ directionally चले गए कि neutrophils यों की अनुमति दी पूरे रक्त डिवाइस के डिजाइन में शामिल किया. सभी तीन रक्त स्रोतों से पलायन neutrophils 0.9 (डिवाइस से बाहर निकल गया कि हर कोशिका के लिए एफसीसी की ओर 9 सेल) के एक दिशात्मकता सूचकांक के साथ चले गए.


चित्रा 1. डोनट के आकार का उपकरण की योजनाबद्ध. ए) chemoattractant डिवाइस में primed है और एक ढाल फोकल कीमोटैक्सिस कक्षों (FCCs) की ओर प्रवास चैनल के साथ बनाई है. सोलह FCCs प्रत्येक WBLC चारों ओर. धोने के बाद, chemoattractant ही एफसीसी में रहता है, और एक रैखिक ढाल प्रवास चैनल के साथ बनाई है. लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) निस्पंदन कंघी चैनल clogging और न्युट्रोफिल सक्रिय माइग्रेशन अवरुद्ध से लाल रक्त कोशिकाओं को रोकता है. न्यूट्रोफिल सक्रिय रूप से पूरे रक्त के बाहर की ओर पलायन और एफसीसी में जमा है, और उनके वेग, दिशात्मकता और संख्या सही मात्रा निर्धारित किया जा सकता है) मूवी S1. बी देखें. एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण.

चित्रा 2
चित्रा 2. योजनाबद्ध और पश्चिम बंगाल डिवाइस के लिए सेल गिनती योजना का अवलोकन. न्यूट्रोफिल सक्रिय रूप से (पश्चिम बंगाल) लाल रक्त कोशिका निस्पंदन कंघी अतीत और डिवाइस के प्रवेश द्वार में पूरे रक्त लोडिंग कक्ष (WBLC) में लोड 2 μl पूरे रक्त से बाहर चले जाते हैं. सेल की दिशात्मकता बंटवारे पर सेल के निर्णय के आधार पर मापा जाता है. दिशात्मक neutrophils ढाल का पालन नहीं करेंगे और बेतरतीब ढंग से एक समान वितरण के साथ बाहर निकलें चैनल की ओर या एफसीसी या तो पलायन होगा फोकल कीमोटैक्सिस कक्ष और गैर दिशात्मक कोशिकाओं की दिशा में अग्रणी chemotactic ढाल का पालन करेंगे. अंतिम सेल गिनती एफसीसी में कोशिकाओं की गणना के द्वारा हर समय बिंदु पर गणना की है.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. पूरे रक्त (पश्चिम बंगाल) की एक छोटी बूंद से न्युट्रोफिल chemotaxis मापने. ए) पश्चिम बंगाल (1 μl) पूरे रक्त लोडिंग कक्ष (WBLC) में भरी हुई है. न्यूट्रोफिल (नीला) fMLP chemotactic शिरापरक पश्चिम बंगाल से पश्चिम बंगाल के एक उंगली चुभन छोटी बूंद से एफसीसी. बी की ओर प्रवास चैनल में गठन ढाल) neutrophils,, या शिरापरक रक्त से अलग संगत संख्या (बार) और वेग के साथ पलायन (नीला विस्थापित साथ लाइन). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


तालिका 1. एक पक्ष चैनल microfluidic डिवाइस और पारंपरिक Boyden कक्ष बनाम पूरे रक्त microfluidic मंच का उपयोग न्युट्रोफिल chemotaxis के लिए प्रोटोकॉल की तुलना करें. प्रत्येक प्रोटोकॉल चरण को पूरा करने के लिए समय और अभिकर्मकों की राशि न्युट्रोफिल chemotaxis को मापने के लिए विभिन्न तरीकों के बीच तुलना कर रहे हैं. पूरे रक्त microfluidic मंच 95% की परख चलाने के लिए आवश्यक कुल समय और> 99% रक्त की मात्रा कम कर देता है.

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Discussion

इस काम में, हम खून की एक छोटी बूंद (2 μl) से न्युट्रोफिल chemotaxis को मापने के लिए एक microfluidic मंच विकसित की है. सक्रिय रूप से neutrophils पलायन से लाल रक्त कोशिकाओं की चिप पर यांत्रिक निस्पंदन neutrophils सक्रिय द्वारा कलाकृतियों को पेश होने का खतरा है, जो इस तरह के घनत्व 10 gradients रूप बोझिल सेल जुदाई तरीकों, सकारात्मक चयन 11, या नकारात्मक चयन 12, के लिए की जरूरत में गतिरोध उत्पन्न. लाल रक्त कोशिकाओं के यांत्रिक निस्पंदन न्युट्रोफिल प्रवास की जांच के लिए अन्य microfluidic चिप्स से हमारी प्रौद्योगिकी अलग. उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला में 13 और से पिछले कार्यों बीबे एट अल. पूर्व chemotaxis परख करने के लिए पूरे रक्त के नमूने से neutrophils को अलग करने के लिए चिप पर 8 उपयोग selectins,. Selectin सतहों पर अलग होने के बाद, न्युट्रोफिल प्रवास बफर समाधान में हुई. इन स्थितियों में, न्युट्रोफिल chemotaxis पर सीरम का कोई असर हटा दिया गया था. इसके अलावा, selectins जाना जाता हैविशिष्ट रिसेप्टर्स को उलझाने के द्वारा कोशिकाओं को सक्रिय करने और इसलिए विट्रो कीमोटैक्सिस माप में बदल सकता है. हमारे डिवाइस में आरबीसी निस्पंदन कंघी द्वारा यांत्रिक जुदाई हमारे डिवाइस से मापा neutrophils की स्थिति में परिवर्तन नहीं करता है. हमारे उपकरण वेग और सेल संचय संख्या के साथ ही सेल दिशात्मकता की मजबूत माप की सुविधा.

इस अध्ययन में, हम केशिका पूरे रक्त, शिरापरक रक्त की एक बूंद, और शिरापरक खून से अलग से पलायन स्वस्थ स्वयंसेवकों से neutrophils समान वेग और दिशात्मकता 14 के साथ विस्थापित दिखाया है. न्युट्रोफिल दिशात्मकता की माप ऐसे दिशात्मकता बिगड़ा हो जाना जाता है जहां जलता 3, 15 और आघात 16, जैसे भड़काऊ शर्तों, में महत्वपूर्ण है. बिगड़ा और अधिक neutrophils दूर चोट की साइट से विस्थापित और संभवतः स्वस्थ ऊतकों को चोट के कारण हो सकता है प्रेरित किया. डिवाइस वर्तमान की एक सीमाइस पत्र में एड डिवाइस पर सेल संवर्धन संभव नहीं है और इसलिए सेल मायने रखता है कि वे देशी पूरे रक्त में पाया जाता है कि अनुपात पर निर्भर कर रहे हैं. इस तरह के न्युट्रोफिल गिनती कम है जहां neutropenia, जैसी स्थितियों में कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण संख्या से chemotaxis माप प्राप्त करने में समस्याओं उपस्थित हो सकता है. हमारे उपकरण में एक अन्य संभावित समस्या एक साथ पलायन लाल रक्त कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं से पलायन कोशिकाओं की steric बाधा है. हमारे प्रयोगों में, neutrophils उनके प्रवास गति को बदलने के बिना आरबीसी निस्पंदन कंघी के फंदों में फंस अतीत लाल रक्त कोशिकाओं निचोड़ कर सकते हैं. इसके अलावा, chemoattractant एकाग्रता और शक्ति सेल प्रवास उत्प्रेरण में अत्यंत महत्वपूर्ण है. परख के निवारण के लिए अन्य शर्तों के साथ यह chemoattractant के अलग परिमाण के साथ खुराक प्रतिक्रिया घटता चलाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. ऐसे लिपिड मध्यस्थों के रूप में अधिक अस्थिर chemoattractants हैंडलिंग और प्रसंस्करण भी महत्वपूर्ण है, इसलिए यह प्रधानमंत्री उपकरणों के लिए महत्वपूर्ण हैतुरंत पहले पश्चिम बंगाल लोड हो रहा है. अंत में, यह पूरे रक्त पश्चिम बंगाल डिवाइस भड़काना से पहले थक्का नहीं है कि यह भी महत्वपूर्ण है. यह निम्न तुरंत परख चलाने के लिए संभव नहीं है, तो रक्त संग्रह रक्त हेपरिन में एक घुमाव पर संग्रहित किया जाना चाहिए. पश्चिम बंगाल डिवाइस में अत्यधिक दबाव लागू करने के लिए नहीं के रूप में नमूना की लोडिंग देखभाल के साथ, धीरे से किया जाना चाहिए.

भविष्य में, हमारी डिवाइस संभावना न्युट्रोफिल शिथिलता 17 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो मरीज ​​की देशी सीरम, से न्युट्रोफिल हटाने के बिना जला या आघात रोगियों में न्युट्रोफिल समारोह में perturbations को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस डिवाइस को भी इन रोगियों में सामान्य न्युट्रोफिल समारोह बहाल करने के लिए संभावित समर्थक संकल्प चिकित्सा विज्ञान स्क्रीन करने के लिए भविष्य में उपयोग किया जा सकता है. अंत में, इस डिवाइस के आगे इस तरह monocytes, मैक्रोफेज, और टी कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रवासी कोशिकाओं से chemotaxis को मापने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है.

अंत में, हम एक Nove विकसित किया हैन्युट्रोफिल को मापने के लिए एल विधि पूरे रक्त की एक छोटी बूंद से सीधे chemotaxis. एक 12 या 24 अच्छी तरह से थाली में पूरे रक्त microfluidic डिवाइस का समावेश एक साथ कई स्थितियों की स्क्रीनिंग की सुविधा. इस डिवाइस को जलाने और अन्य भड़काऊ शर्तों का इलाज सूजन संकल्प के मध्यस्थों के विकास की सुविधा होगी. भविष्य में, इस डिवाइस रोगी के नमूने और नमूना मात्रा सीमित है जहां murine मॉडल में समय के साथ न्युट्रोफिल chemotactic समारोह में perturbations को मापने के लिए उपयोग किया जाएगा.

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Disclosures

खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष कर रहे हैं.

Acknowledgements

राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से समर्थन और श्राइनर्स बर्न्स अस्पताल (GM092804, DE019938 अनुदान).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Fabrication
SU-8 Microchem Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides Fisher Scientific 125495 1 X 3 inches
Glass-bottom plate MatTek P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm Ted Pella, Inc. 15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm Ted Pella, Inc. 15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip Fisher Scientific 02-707-139
Syringe Fisher Scientfic 309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in. Brico Medical Supply BN3005
Vacutainer, Heparin Becton Dickinson
HBSS Sigma-Aldrich
Human serum albumin Sigma-Aldrich A5843-5G 0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895-1MG
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G SLN240
Hoescht stain Life Technologies H3570
Positive Control
HetaSep STEMCELL Technologies Inc. 7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies Inc. 19257
Plasma Asher March Instruments P-250
Lindberg/Blue M Oven Thermo Scientific 13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers Techni Tool 758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator Fisher Scientific 08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate Alpha Multiservices PMC 720
Nikon TiE inverted microscope Nikon - Micro Video Instruments Inc. MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective Nikon - Micro Video Instruments Inc. MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon Nikon - Micro Video Instruments Inc. 500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters Chroma - Micro Video Instruments Inc. 31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels Qimaging - Micro Video Instruments Inc. RET-2000R-F-M-12-C

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References

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