DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

Chemistry

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Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. J. Vis. Exp. (106), e51272, doi:10.3791/51272 (2015).

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Abstract

DNAのナノロボットは、特定の刺激と内部隔離存在貨物に応じて開くように設計された中空の六角形ナノメートル装置です。どちらも刺激と貨物は、特定のニーズに応じて調整することができます。ここでは、DNA折り紙の技術を使用して、DNAナノロボット製作プロトコルを記述します。そして、処理は、折り畳み緩衝液の存在下で長い、円形、一本鎖DNAの足場に添加された原料混合物中に短い一本鎖DNAのステープルを混合することにより開始します。標準的なサーモサイクラーは、徐々にナノロボットの折り後ろ案内力でステープルツー足場アニーリングを容易にするために、混合反応温度を下げるようにプログラムされています。 60時間のフォールディング反応が完了したら、過剰なステープルは、アガロースゲル電気泳動(AGE)を介して可視化に続いて遠心分離フィルターを使用して廃棄されます。最後に、ナノロボットの成功した製造は、透過型電子顕微鏡(TEM)により確認され、ネガティブ染色としてウラニルギを用いました。

Introduction

核酸のナノテクノロジーのための用途は驚異的です。ワトソン-クリック塩基対と同様に、カスタムメイドのオリゴ2の大規模合成の容易さと相対的な低コストの扱いやすさは、アプリケーション3およびDNAナノテクノロジーの分野での研究の爆発を生成しました。基本的なビルディングブロックとして不動シーマン接合4,5に基づいて、構造のDNAナノテクノロジーは、任意の形状6-8の建設のための自己組織化基本単位としてのDNAを使用しています。

足場のDNA折り紙9技術の最近の開発は、サブナノメートルの精度で複雑 ​​な2D / 3Dナノアーキテクチャ10-12の構築を可能にし、複雑化し、驚くほどの多様性と新しい機能オブジェクトを構築するための効率的なルートです。建設プロセスが長い足場一本鎖DNAに基づくもので、通常はウイルスGENOM由来短い一本鎖DNAオリゴの何百ものハイブリダイゼーションを介して折り畳むことができるeは、ステープルと呼ばれます。製造の再現性が達成可能な最大の水素結合相補性を容易にするために、短い一本鎖の短配列を調整した結果であるが、この技術により得られた高分解能の構造は、DNA二重らせんの自然な寸法の直接的な結果です。遅い高温アニールの使用は設計最低エネルギーをランプでは、熱力学的に好適なナノ構造は、高い収率及び忠実度に到達しました。コンピュータコードにおける接合設計ルールの簡単な実装は非常に接続された接合部の数百人を含む、大規模で複雑 ​​な構造を設計する作業を簡素化するなどcaDNAno 13などのCADツールの開発を可能にしました。

これまで我々はcaDNAnoツール14,15を用いて、DNAのナノロボットの設計を説明しました。ここでは、製造を表しており、透過型電子顕微鏡(TEM)を介して可視化、の寸法のナノロボット、3D中空六角形のナノデバイス、所定の刺激と存在する特定の貨物に応じて大規模な構造変化を起こすように設計された35×35×50 nmの3、このようなタンパク質や核酸オリゴとして、内部に隔離。 12ロードステーションは、中空シャーシ内部利用可能であるが、バインドされた貨物の実際の数は、貨物のサイズとは異なります。カーゴ分子は、小DNA分子から、酵素、抗体、および5〜10 nmの金ナノ粒子の範囲。どちらCargocan均一または不均一で、各ナノロボットは、異なる分子の混合物を含むようにします。検出はaptasensor 16,17またはDNAの鎖置換技術18のいずれかに基づいて、タンパク質、核酸または他の化学物質を感知するために2つの二重螺旋固定ゲート設計を介して達成されます。アプタマー選択プロトコール19-21における最近の開発は、応答nanorobotsの設計を可能に分子および細胞型の増え続ける範囲。

初期の研究は、その抗原に結合する混合細胞集団15内の特定の細胞型の内側に抑制または多産の信号のいずれかを中継することができる特異抗体を担持ナノロボットを示しました。これらのナノデバイスのエキサイティングな機能は、単一集団内の異なるナノロボットサブタイプの導入で、より複雑なタスクとロジック制御を実行する能力です。最近では、アクティブなカーゴ分子22を含むエフェクター集団を制御する、正または負の調節因子のいずれかとして行うnanorobotsの特定のサブタイプを明らかにしました。

ここで紹介するプロトコルは、ナノロボット15,22の開放を容易にするために、PDGFに選択的に結合するアプタマーセンサー系列でゲートナノロボットの製造、精製およびイメージングを説明します。説明した製造方法は、nと同様です最初に、収率および精製速度を増加させながら、全体的な処理時間を低減することを目的とした変化にダグラス 15によって示さanorobot製造プロセス。

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Protocol

ステープルズプール混合物の調製

  1. 表1に記載された96ウェルプレート上に凍結乾燥したDNAナノロボットのステープルを注文材料参照)、10ナノモルに正規化します。 DNAのナノロボットの設計とアーキテクチャの詳細についてはベン・Ishay 14、ダグラスらを参照してください。15)。
  2. 100μMの濃度にDNアーゼ/​​ RNaseフリーの超高純度でうまく各ステープルを再構成します。ステープルが10ナノモルに正規化するために、超純水100μlで再構成します。
  3. プール一緒にマルチチャンネルピペッターおよび滅菌55ミリリットルソリューション流域を使用して、各ステープルの20μlの。
    注:ナノロボットの形状(コア、エッジ、ハンドルおよびガイド配列を含む、 表1)254短 ​​鎖から構成されているので、ステープル・プール内のステープルの各々の濃度は394 nMです。ステープルプールからステープルを削除するか、別の巻でのいくつかを追加しますリューム、かなりの収率を減少させる、またはそれ以外の場合は折り畳まれていない集合体になることがあります。

製作反応混合物の調製

  1. 標準的な反応混合物について材料を参照してください 、100 nMの原液)足場DNAの4ピコモルに対応し、M13mp18のウイルスゲノム環状一本鎖DNAを40μlを使用しています。製造混合物中の足場の最終濃度は20 nMで、最終容量200μlのです。
    1. 具体的なニーズに応じて足場DNAの量を調整します。しかしながら、一定の20 nmで反応混合物中の骨格DNAの最終濃度を保ちます。
  2. それぞれ、1〜10のステープル比に足場に到達するためにステープルを加えます。 20nMの足場DNA濃度について、ステープル254 'の最終濃度の各々は、200nmです。 200μlの最終反応容量についてステープルプール混合物(セクション1.2)の102μlを添加します。
    1. 目に別々に特定のゲート列を追加します。Eは、この時点で、反応混合物を折り畳みます。これらのオリゴは別途注文し、HPLC精製を必要としています。 20 nMの足場濃度について各オリゴのすなわち 200 nMの、ゲートオリゴ1:10足場ゲートにシーケンス比で存在することを確認してください。 200μlのフォールディング反応容量については、100μMのストック濃度で4門オリゴのそれぞれについて、0.4μlを添加します。
  3. 1×TAE(40mMのトリス - 酢酸、1mMのEDTA)の最終濃度に到達するために10倍TAEストック緩衝を追加します。 200μlのフォールディング反応容量の場合、10倍TAEの20μlを添加します。
  4. 10mMの最終濃度まで、1MのMgCl 2を加えます。 200μlのフォールディング反応容量は、1 MのMgCl 2の2μlを添加します。
  5. 200μlの最終容量に到達するためのDNase / RNaseを含まない超純水36μLを加えます。
  6. PCRバイアルにボルテックスし、アリコート100μlのサンプル。
    注:使用される最大反応体積に関するサーマルサイクラーの仕様を参照してください。これらの制限を満たすために音量を小さくすると得られた収率は減少しません。指定された最大上記の反応ボリュームは利回りを危うくします。

製造反応の3高温アニールのランプ

  1. 以下のようにプログラムサーマルサイクラー:
    1. 5分/℃の割合で60℃まで85℃に上昇します。
    2. 75分/℃の割合で4℃まで60℃に上昇します。
    3. 無期限に4℃で保持します。
  2. 製造後に-20℃で保存するサンプルを終了しました。

過剰ステープルズの4取り外し

  1. 100キロダルトンのMWCOと0.5ミリリットル遠心分離フィルターにフォールディング反応混合物の100μLを加えます。後の分析のためにnanorobots予備精製の10μlのサンプルを保存します。
  2. 9,600×gで10分間遠心。
  3. フォールディングバッファー(1×TAE、10のMgCl 2)400μlのを追加します。
  4. 繰り返し二回より4.2と4.3を繰り返します。
  5. 9,600×gで5分間遠心。
  6. 9,600×gで1分間きれいなマイクロ遠心チューブやスピンに逆さまにフィルタを配置することによって濃縮物を回復します。最終容積は、フィルタに入れ、製造の反応混合物の初期量に依存して変化し得ます。典型的には、濃縮されたナノロボット試料25-60μlの最終容量を得ました。
  7. 260nmで分光光度計を経由して試料中のDNA濃度を測定します。ナノロボットサンプルのモル濃度を算出する際に5.3μgの/ピコモルの分子量を使用してください。
    注意:二本鎖DNA、50μgの/ OD 260のためのモル吸光係数をほとんどのアプリケーションで十分です。 48μgの/ OD 260は、エッジのステープルの口座に一本鎖DNAが伸びポリチミンを取ります。

二つ折りNanorobotsの5アガロースゲル電気泳動分析

  1. 0.5×TBE(45mMのトリス-ホウ酸、1mMのEDTA)を10mMのMgCl 2を補充した2%アガロースゲルの調製らから適応21。):
    1. ddH 2 Oの118.75ミリリットルで10倍TBEストック緩衝の6.25ミリリットルを希釈することにより、0.5×TBE緩衝液を準備
    2. 0.5×TBEバッファーの125ミリリットルで、アガロースの2.5グラムを溶解します。
    3. アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで煮。
    4. 10mMの最終濃度になるように、1MのMgCl 2の1.25ミリリットルを追加します。
    5. 10 mg / mlの臭化エチジウムの7μLを加えます。
    6. 少しクールを解決するために待って、アガロースゲル固化する前にゲルトレイを埋めます。すぐに目的の櫛をインストールします。
    7. ddH 2 Oを 940ミリリットルに10倍のTBEストック緩衝し、1MのMgCl 2の10ミリリットルの50ミリリットルを追加することで、ランニング緩衝液1 Lの0.5倍のTBEを準備
    8. ゲル電気泳動デバイスにバッファを実行している固体のアドオンで、氷浴中にデバイスを入れたら。
  2. 足場と一緒nanorobots予備精製の負荷1μgの全DNA(ステップ3.2)、および精製後(ステップ4.7)、ゲル上のDNAサンプルと1 kbのDNAマーカー。 を図2に示す 。試料の実際の体積は、精製後に得られた濃度に依存します。 6、最終体積比:各サンプルは1でローディングバッファーにロードされます。
  3. 80 Vに電源​​を設定し、3時間ゲルを実行します。氷と水で満たされた浴中でゲルを実行します。 Nanorobotsは展開し、アガロースゲル電気泳動中に熱くなる場合スメアとして表示されます。電気泳動時の加熱からデバイスを保つために、追加の氷を追加します。
  4. 紫外線テーブル上のビューゲル( 図2)。

ウラニルギでナノロボットの6陰性染色

  1. 2%のウラニルギストック溶液の調製(カストロから適応23):
    1. 15ミリリットルチューブにウラニルギ粉末100mgを秤量します。
    2. 3分間沸騰のDNase / RNaseを含まない超純水は、脱酸素化物をします。
    3. 脱酸素したお湯(〜60℃)の5ミリリットルを追加します。(前のステップから)ウラニルギ粉末を含む15mlチューブに。しっかり開閉蓋、10分(渦に締めチューブ)のために厳密にアルミ箔と渦に包みます。溶液は黄色の色で濁って表示されます。
    4. 0.2μmシリンジフィルターで濾過してソリューションを提供します。溶液は透明になるはずです。
    5. 小分けマイクロ遠心チューブに溶液200μl。
    6. チューブの底のプールサンプルにテーブルトップ遠心機で5分間最大速度で遠心。
  2. グリッドとネガティブ染色への試料のローディング:
    1. (セクション6.1で調製した)2%ウラニルギ溶液200μlアリコートを解凍。 3分間厳密に0.5 M NaOH溶液と渦の10μLを加えます。テーブルトップ遠心機を用いて5分間、最大速度で遠心。
    2. 一方、グロー放電グリッド0.2ミリバールと30秒25 mAで部屋の空気を使用して。
    3. 精製後2 nmのナノロボットサンプルの15μlのを追加(secti4.7の)鉗子で開催されたグリッド()の上面上に、1分間に吸収させます。ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。
    4. (鉗子で開催された)グリッドの上面に(ステップ6.2.1から)2%のウラニルメート10μlのを追加します。
    5. すぐにろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用しています。グリッド表面に触れないでください。
    6. 繰り返しは6.2.4と6.2.5を繰り返します。
    7. (鉗子で開催された)グリッドの上面に(ステップ6.2.1から)2%のウラニルメート10μlのを追加します。染色溶液を30秒間吸収しましょう​​。
    8. ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。
    9. グリッドは、少なくとも30分間完全に乾燥TEMに注入する前に、ろ紙上に直面しよう。

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Representative Results

代表的な結果を図2Aに示されています。すべてのレーンは、分光光度計(OD 260)を介して測定し、合計1μgのDNAが含まれています。環状一本鎖DNAの足場(レーン2)と比較して、nanorobotsは、それらのより高い分子量、骨格DNA(レーン3赤矢印)にステープルハイブリダイゼーションの結果をゲルに妨げられます。レーン3中の低分子量バンドは、足場のDNA(緑の矢印)に結合しなかった過剰ステープルを表します。遠心濾過による精製後、過剰のステープルのほとんどが(レーン4-6)削除され、nanorobotsはハンドル相補鎖14,15,22に共役カーゴ分子でロードされる準備ができています。レーン4-6は、ナノロボットの二量体を表す高分子量バンド(青矢印)、一緒に結合されているnanorobotsの人口が含まれています。潜在的のRedu(5または10のいずれかnmの)製造手順における足場の濃度を低減することができますこれらの高分子量構造物の相対量を、CE。レーン記載の精製プロトコルにわずかな変動で4-6ショーnanorobots精製後、すなわち製造されたnanorobotsの初期体積は、スピンフィルタに追加(ステップ4.1レーン4:50μL;レーン5:100μlの;レーン6:100 μL)、及び緩衝液をフィルターに添加した回数(4.4ステップレーン4:2倍;レーン5:2倍;レーン6:5回)。

プロトコル( 図2C)の異なるバリエーション間の収量および精製結果の比較は、遠心フィルター(ステップ4.1)にむかっロード作製したロボットの初期体積を減少させることは、収率および精製率にほとんど影響を与えないことを示しています。かなりの収率を低減しつつ、さらに、(4.4ステップ)バッファー交換および遠心スピンの数を増やすと、nanorobotsに純度に限界影響を与えます。したがって、記載されているプロトコルは、100μlに対応します初期容量と2バッファの追加(レーン5)は、最適であると考えられます。

収量の推定を分光光度計(OD 260)の各サンプル、精製後の測定値に基づいて、各遠心分離フィルターにロードされた初期量を基準に計算されます。精製は、精製の間に洗い流すなかったnanorobotsと過剰のステープルに対応する、試料中の全DNAからnanorobotsの重量パーセントに基づいています。精製推定が過剰ステープルとnanorobots( 図2Aの赤と青の矢印)( 図2Bの緑色の矢印)の相対強度から計算されます。相対nanorobots /ステープルの強度が初期に対応する、ステープルの全DNA量(緑の矢印)が未精製nanorobots(赤矢印)の〜4.5倍である精製前のサンプル(レーン3)、と正規化しました10:1の足場へ製造プロトコル内のステープルモル比。

構造的完全性の最終的な検証は、ネガティブ染色として2%のギウラニルを用いた透過型電子顕微鏡を介して達成されます。写真3に示されています。

図1
図1:ナノロボットのデザインの概略閉じたナノロボットの(A)は側面図アプタマー配列と相補鎖によって生成門二重らせんは、緑の矢印で示されています。 (B)の内部に結合したタンパク質の貨物を示す閉じたナノロボットの正面図。 (C)生産閉じナノロボットの断面模式図。ハンドルステープルは赤い矢印で強調表示されます。グリーンの円は片側のヒンジと反対側のゲート配列を含む螺旋を示します。 (D)設計図の側面図でナノロボット。ハンドルは赤い矢印で示されています。ゲート配列は、緑の矢印で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:アガロースゲル電気泳動の結果、(A)レーン1:1キロバイトのマーカー。レーン2:M13mp18の環状一本鎖の足場。レーン3:nanorobots予備精製。レーン4-6:nanorobotsポスト精製。レーン4:50μlの初期容量。 2バッファの追加。レーン5:100μlの初期量を、 2バッファの追加。レーン6:100μlの初期容量。 5バッファの追加。過剰ステープルを作製nanorobotsは赤い矢印で示されている緑色の矢印で示されています。青い矢印は、ナノロボットの二量体を示しました。 (B)アガロースのバンドの相対強度の3Dビューゲル。 (C)収量および精製推定。

図3
図3:複数の捏造/染色手順から採取したDNAのnanorobotsのTEM写真。

"> TATACAGGAAATAAAGAAATTTTGCCCGAACGTTAAGACTTT 2 ">コア 141 0 "> TTTTTTTTTTTTTTTGTTAATTTCATCT
指定 シーケンス
1 コア AAAAACCAAACCCTCGTTGTGAATATGGTTTGGTC
2 コア GGAAGAAGTGTAGCGGTCACGTTATAATCAGCAGACTGATAG
3 コア TACGATATAGATAATCGAACAACA
4 コア CTTTTGCTTAAGCAATAAAGCGAGTAGA
5 コア GTCTGAAATAACATCGGTACGGCCGCGCACGG
6 コア GGAAGAGCCAAACAGCTTGCAGGGAACCTAA
7 コア AAAATCACCGGAAGCAAACTCTGTAGCT
8 コア CCTACATGAAGAACTAAAGGGCAGGGCGGAGCCCCGGGC
9 コア CATGTAAAAAGGTAAAGTAATAAGAACG
10 コア ATTAAATCAGGTCATTGCCTGTCTAGCTGATAAATTGTAATA
11 コア ATAGTCGTCTTTTGCGGTAATGCC
12 コア AGTCATGGTCATAGCTGAACTCACTGCCAGT
13 コア AACTATTGACGGAAATTTGAGGGAATATAAA
14 コア ATCGCGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAGAAAGACCATC
15 コア AAATATTGAACGGTAATCGTAGCCGGAGACAGTCATAAAAAT
16 コア GTCTTTACAGGATTAGTATTCTAACGAGCATAGAACGC
17 コア GCACCGCGACGACGCTAATGAACAGCTG
18 コア AACTTCATTTTAGAATCGCAAATC
19 コア CGTAGAGTCTTTGTTAAGGCCTTCGTTTTCCTACCGAG
20 コア CCAATCAAAGGCTTATCCGGTTGCTATT
21 コア AGAGGCGATATAATCCTGATTCATCATA
22 コア CCGTAATCCCTGAATAATAACGGAATACTACG
23 コア AAATGGTATACAGGGCAAGGAAATC
24 コア TCCTCATCGTAACCAAGACCGACA
25 コア CATTATCTGGCTTTAGGGAATTATGTTTGGATTAC
26 コア ACCCGCCCAATCATTCCTCTGTCC
27 コア CGACCAGTCACGCAGCCACCGCTGGCAAAGCGAAAGAAC
28 コア CTAAAGGCGTACTATGGTTGCAACAGGAGAGA
29 コア TTGGCAGGCAATACAGTGTTTCTGCGCGGGCG
30 コア
31 コア AAGTATAGTATAAACAGTTAACTGAATTTACCGTTGAGCCAC
32 コア ACATTCAGATAGCGTCCAATATTCAGAA
33 コア AAACATCTTTACCCTCACCAGTAAAGTGCCCGCCC
34 コア GAGATGACCCTAATGCCAGGCTATTTTT
35 コア TCCTGAATTTTTTGTTTAACGATCAGAGCGGA
36 コア GCCGAAAAATCTAAAGCCAATCAAGGAAATA
37 コア AGCGTAGCGCGTTTTCACAAAATCTATGTTAGCAAACGAACGCAACAAA
38 コア ACCAATCGATTAAATTGCGCCATTATTA D>
39 コア ATCTTACTTATTTTCAGCGCCGACAGGATTCA
40 コア CCCTAAAAGAACCCAGTCACA
41 コア GGAAGGGCGAAAATCGGGTTTTTCGCGTTGCTCGT
42 コア CAGACCGGAAGCCGCCATTTTGATGGGGTCAGTAC
43 コア TAATATTGGAGCAAACAAGAGATCAATATGATATTGCCTTTA
44 コア TTCCTTATAGCAAGCAAATCAAATTTTA
45 コア ACTACGAGGAGATTTTTTCACGTTGAAACTTGCTTT
46 コア AAACAGGCATGTCAATCATATAGATTCAAAAGGGTTATATTT
47 AACAGGCACCAGTTAAAGGCCGCTTTGTGAATTTCTTA
48 コア TTCCTGAGTTATCTAAAATATTCAGTTGTTCAAATAGCAG
49 コア AAAGAAACAAGAGAAGATCCGGCT
50 コア TTGAGGGTTCTGGTCAGGCTGTATAAGC
51 コア TTTAACCGTCAATAGTGAATTCAAAAGAAGATGATATCGCGC
52 コア ACGAGCGCCCAATCCAAATAAAATTGAGCACC
53 コア AATAAGTCGAAGCCCAATAATTATTTATTCTT
54 コア ACGAAATATCATAGATTAAGAAACAATGGAACTGA
55 コア TTTCATAGTTGTACCGTAACACTGGGGTTTT
56 コア AGGAGCGAGCACTAACAACTAAAACCCTATCACCTAACAGTG
57 コア CAAAGTATTAATTAGCGAGTTTCGCCACAGAACGA
58 コア TGGGGAGCTATTTGACGACTAAATACCATCAGTTT
59 コア ATAACGCAATAGTAAAATGTTTAAATCA
60 コア ACGAATCAACCTTCATCTTATACCGAGG
61 コア TAATGGTTTGAAATACGCCAA
62 コア CGGAACAAGAGCCGTCAATAGGCACAGACAATATCCTCAATC
63 コア ATTAAAGGTGAATTATCAAAGGGCACCACGG
64 GGCAACCCATAGCGTAAGCAGCGACCATTAA
65 コア AGAAACGTAAGCAGCCACAAGGAAACGATCTT
66 コア AGAGGTCTTTAGGGGGTCAAAAGGCAGT
67 コア GGGGACTTTTTCATGAGGACCTGCGAGAATAGAAAGGAGGAT
68 コア TTTTAGAACATCCAATAAATCCAATAAC
69 コア AAATGTGGTAGATGGCCCGCTTGGGCGC
70 コア ACGGATCGTCACCCTCACGATCTAGAATTTT
71 コア CGCCATAAGACGACGACAATAGCTGTCT
72 コア GCGTATTAGTCTTTAATCGTAAGAATTTACA
73 コア AGAGAACGTGAATCAAATGCGTATTTCCAGTCCCC
74 コア AACGAAAAAGCGCGAAAAAAAGGCTCCAAAAGG
75 コア TAATTTAGAACGCGAGGCGTTAAGCCTT
76 コア ACCAGGCGTGCATCATTAATTTTTTCAC
77 コア CAGCCTGACGACAGATGTCGCCTGAAAT
78 コア ATTAGTCAGATTGCAAAGTAAGAGTTAAGAAGAGT
79 コア CTCGAATGCTCACTGGCGCAT
80 コア GGGCAGTCACGACGTTGAATAATTAACAACC
81 コア
82 コア TCAACCCTCAGCGCCGAATATATTAAGAATA
83 コア ATTATACGTGATAATACACATTATCATATCAGAGA
84 コア GCAAATCTGCAACAGGAAAAATTGC
85 コア ATAATTACTAGAAATTCTTAC
86 コア TATCACCGTGCCTTGAGTAACGCGTCATACATGGCCCCTCAG
87 コア AAGTAGGGTTAACGCGCTGCCAGCTGCA
88 コア CCAGTAGTTAAGCCCTTTTTAAGAAAAGCAAA
89 コア TGGCGAAGTTGGGACTTTCCG
90 CAGTGAGTGATGGTGGTTCCGAAAACCGTCTATCACGATTTA
91 コア AAATCAAAGAGAATAACATAACTGAACACAGT
92 コア CTGTATGACAACTAGTGTCGA
93 コア ATCATAAATAGCGAGAGGCTTAGCAAAGCGGATTGTTCAAAT
94 コア TTGAGTAATTTGAGGATTTAGCTGAAAGGCGCGAAAGATAAA
95 コア ATAAGAATAAACACCGCTCAA
96 コア CGTTGTAATTCACCTTCTGACAAGTATTTTAA
97 コア AACCGCCTCATAATTCGGCATAGCAGCA
98 コア AAATAGGTCACGTTGGTAGCGAGTCGCGTCTAATTCGC
99 コア CAGTATAGCCTGTTTATCAACCCCATCC
100 コア TTGCACCTGAAAATAGCAGCCAGAGGGTCATCGATTTTCGGT
101 コア CGTCGGAAATGGGACCTGTCGGGGGAGA
102 コア AAGAAACTAGAAGATTGCGCAACTAGGG
103 コア CCAGAACCTGGCTCATTATACAATTACG
104 コア ACGGGTAATAAATTAAGGAATTGCGAATAGTA
105 コア CCACGCTGGCCGATTCAAACTATCGGCCCGCT
106 コア GCCTTCACCGAAAGCCTCCGCTCACGCCAGC
107 CAGCATTAAAGACAACCGTCAAAAATCA
108 コア ACATCGGAAATTATTTGCACGTAAAAGT
109 コア CAACGGTCGCTGAGGCTTGATACCTATCGGTTTATCAGATCT
110 コア AAATCGTACAGTACATAAATCAGATGAA
111 コア TTAACACACAGGAACACTTGCCTGAGTATTTG
112 コア AGGCATAAGAAGTTTTGCCAGACCCTGA
113 コア GACGACATTCACCAGAGATTAAAGCCTATTAACCA
114 コア AGCTGCTCGTTAATAAAACGAGAATACC
115 コア CTTAGAGTACCTTTTAAACAGCTGCGGAGATTTAGACTA
116 コア CACCCTCTAATTAGCGTTTGCTACATAC
117 コア GAACCGAAAATTGGGCTTGAGTACCTTATGCGATTCAACACT
118 コア GCAAGGCAGATAACATAGCCGAACAAAGTGGCAACGGGA
119 コア ATGAAACAATTGAGAAGGAAACCGAGGATAGA
120 コア GGATGTGAAATTGTTATGGGGTGCACAGTAT
121 コア GGCTTGCGACGTTGGGAAGAACAGATAC
122 コア TAAATGCCTACTAATAGTAGTTTTCATT
123 コア TGCCGTCTGCCTATTTCGGAACCAGAATGGAAAGCCCACCAGAAC
124 コア TGACCATAGCAAAAGGGAGAACAAC
125 コア CGAGCCAGACGTTAATAATTTGTATCA
126 コア GCTCAGTTTCTGAAACATGAAACAAATAAATCCTCCCGCCGC
127 コア AGACGCTACATCAAGAAAACACTTTGAA
128 コア AGTACTGACCAATCCGCGAAGTTTAAGACAG
129 コア GATTCCTGTTACGGGCAGTGAGCTTTTCCTGTGTGCTG
130 コア GGTATTAAGGAATCATTACCGAACGCTA
131 コア GTTCATCAAATAAAACGCGACTCTAGAGGATCGGG
132 コア
133 コア ACAGAGGCCTGAGATTCTTTGATTAGTAATGG
134 コア AACGAGATCAGGATTAGAGAGCTTAATT
135 コア TACCAAGTTATACTTCTGAATCACCAGA
136 コア CAGTAGGTGTTCAGCTAATGCGTAGAAA
137 コア AGGATGACCATAGACTGACTAATGAAATCTACATTCAGCAGGCGCGTAC
138 コア TTTCAACCAAGGCAAAGAATTTAGATAC
139 コア TTGAAATTAAGATAGCTTAACTAT
140 コア CTATTATCGAGCTTCAAAGCGTATGCAA
コア CAGGGTGCAAAATCCCTTATAGACTCCAACGTCAAAAGCCGG
142 コア GAGCTTGTTAATGCGCCGCTAATTTTAGCGCCTGCTGCTGAA
143 コア CGAACGTTAACCACCACACCCCCAGAATTGAG
144 コア GTGTGATAAATAAGTGAGAAT
145 コア GCTATATAGCATTAACCCTCAGAGA
146 コア AGGAGAGCCGGCAGTCTTGCCCCCGAGAGGGAGGG
147 コア CGGCCTCCAGCCAGAGGGCGAGCCCCAA
148 コア CCAAAACAAAATAGGCTGGCTGACGTAACAA
149 コア
150 コア ATAAAGGTTACCAGCGCTAATTCAAAAACAGC
151 コア ATTGCCCCCAGCAGGCGAAAAGGCCCACTACGTGACGGAACC
152 コア TTTTAAAACATAACAGTAATGGAACGCTATTAGAACGC
153 コア AATTGGGTAACGCCAGGCTGTAGCCAGCTAGTAAACGT
154 エッジ TTACCCAGAACAACATTATTACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT
155 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTAATAAGAGAATA
156 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTCCAGTTTGGGAGCGGGCTTTTTTTTTTTTTTT
157 エッジ
158 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGATTAAGACTCCTTATCCAAAAGGAAT
159 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTCTTCGCTATTACAATT
160 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCTTGCGGGAGAAGCGCATTTTTTTTTTTTTTTT
161 エッジ TTTTTTTTTTTTTTGGGAATTAGAGAAACAATGAATTTTTTTTTTTTTTT
162 エッジ TCAGACTGACAGAATCAAGTTTGTTTTTTTTTTTTTTT
163 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGGTCGAGGTGCCGTAAAGCAGCACGT
164 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTTTAATCATTTACCAGACTTTTTTTTTTTTTTT
165 エッジ TTTTTTTTTTTTTCATTCTGGCCAAATTCGACAACTCTTTTTTTTTTTTT
166 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTACCGGATATTCA
167 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTAGACGGGAAACTGGCATTTTTTTTTTTTTTTT
168 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCAGCAAGCGGTCCACGCTGCCCAAAT
169 エッジ CTGAGAGAGTTGTTTTTTTTTTTTTTT
170 エッジ CAATGACAACAACCATTTTTTTTTTTTTTTT
171 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTGAGAGATCTACAAGGAGAGG
172 エッジ TCACCAGTACAAACTATTTTTTTTTTTTTTT
173 エッジ
174 エッジ TAAAGTTACCGCACTCATCGAGAACTTTTTTTTTTTTTTT
175 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCACCCTCAGAACCGCC
176 エッジ TTTTTTTTTTTTTAGGTTTAACGTCAATATATGTGAGTTTTTTTTTTTTT
177 エッジ CCACACAACATACGTTTTTTTTTTTTT
178 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGCTAGGGCGAGTAAAAGATTTTTTTTTTTTTTT
179 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTAGTTGATTCCCAATTCTGCGAACCTCA
180 エッジ TTATTTAGAGCCTAATTTGCCAGTTTTTTTTTTTTTTTTT
181 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTACGGCGGAT
182 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTATATGCGTTAAGTCCTGATTTTTTTTTTTTTTT
183 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTACGATTGGCCTTGATA
184 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCAACGCCTGTAGCATT
185 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTTGAGCCGGAACGATTTTTTTTTTTTTTT
186 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTAAGCAAGCCGTTT
187 エッジ TTTTTTTTTTTTTATGTGTAGGTAAGTACCCCGGTTGTTTTTTTTTTTTT
188 エッジ ATCGTCATAAATATTCATTTTTTTTTTTTTTTTT
189 エッジ
190 エッジ TTTTTTTTTTTTTGTATTAAATCCTGCGTAGATTTTCTTTTTTTTTTTTT
191 エッジ GCCATATAAGAGCAAGCCAGCCCGACTTGAGCCATGGTT
192 エッジ GTAGCTAGTACCAAAAACATTCATAAAGCTAAATCGGTTTTTTTTTTTTT
193 エッジ ATAACGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT
194 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTAAAATACCGAACGAACCACCAGTGAGAATTAAC
195 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTACAAAATAAACA
196 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTACAAGAAAAACCTCCCGATTTTTTTTTTTTTTT
197 エッジ
198 エッジ TTTTTTTTTTTTTCAATTACCTGAGTATCAAAATCATTTTTTTTTTTTTT
199 エッジ GGTACGGCCAGTGCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT
200 エッジ TTTTTTTTTTTTTTGAATAACCTTGAAATATATTTTATTTTTTTTTTTTT
201 エッジ CACTAAAACACTTTTTTTTTTTTTTTT
202 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTAACCAATATGGGAACAATTTTTTTTTTTTTTT
203 エッジ TACGTCACAATCAATAGAATTTTTTTTTTTTTTT
204 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTAGAAAGATTCATCAGTTGA
205 エッジ TTTTTTTTTTTTTGTGGCATCAATTAATGCCTGAGTATTTTTTTTTTTTT
206 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTTGCATGCCTGCATTAATTTTTTTTTTTTTTTT
207 エッジ CCAGCGAAAGAGTAATCTTGACAAGATTTTTTTTTTTTTTT
208 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGAATCCCCCTCAAATGCTT
209 エッジ AGAGGCTGAGACTCCTTTTTTTTTTTTTTTT
210 エッジ ACAAACACAGAGATACATCGCCATTATTTTTTTTTTTTTTT
211 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCAAGAGAAGGATTAGG
212 エッジ TTTTTTTTTTTTTGAATTGAGGAAGTTATCAGATGATTTTTTTTTTTTTT
213 CAGAACAATATTTTTTTTTTTTTTTTT
214 エッジ TTTTTTTTTTTTTAGCCGGAAGCATAAAGTGTCCTGGCC
215 エッジ TGACCGTTTCTCCGGGAACGCAAATCAGCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTT
216 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGGTAATAAGTTTTAAC
217 エッジ TTTTTTTTTTTTTTGTCTGTCCATAATAAAAGGGATTTTTTTTTTTTTTT
218 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCCTCGTTAGAATCAGAGCGTAATATC
219 エッジ AATTGCTCCTTTTGATAAGTTTTTTTTTTTTTTT
220 エッジ CATCGGACAGCCCTGCTAAACAACTTTCAACAGTTTTTTTTTTTTTTT
221 TTTTTTTTTTTTTTTAACCGCCTCCCTCAGACCAGAGC
222 エッジ TCTGACAGAGGCATTTTCGAGCCAGTTTTTTTTTTTTTTT
223 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCGGAGTTCCATGTCATAAGG
224 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCGCCCACGCATAACCG
225 エッジ AATTACTTAGGACTAAATAGCAACGGCTACAGATTTTTTTTTTTTTTT
226 エッジ CAAGTTTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTT
227 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTCCTTTAGCGCACCACCGGTTTTTTTTTTTTTTT
228 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGAATCGGCCGAGTGTTGTTTTTTTTTTTTTTTT
229 エッジ TTTTTTTTTTTTTCATCTTTGACCC
230 エッジ TTTTTTTTTTTTTATAATCAGAAAATCGGTGCGGGCCTTTTTTTTTTTTT
231 エッジ GATACAGGAGTGTACTTTTTTTTTTTTTTTT
232 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTGGCGCAGACAATTTCAACTTTTTTTTTTTTTTT
233 エッジ GGAGGTTTAGTACCGCTTTTTTTTTTTTTTT
234 エッジ TTTTTTTTTTTTTACCGCCAGCCATAACAGTTGAAAGTTTTTTTTTTTTT
235 エッジ TTTTTTTTTTTTTTTATAGCAATAGCT
236 ハンドル AATAAGTTTTGCAAGCCCAATAGGGGATAAGTTGTGCTACTCCAGTTC
237 ハンドル ACATAGCTTACATTTAACAATAATAACGTTGTGCTACTCCAGTTC
238 ハンドル CCTTTTTGAATGGCGTCAGTATTGTGCTACTCCAGTTC
239 ハンドル CGTAACCAATTCATCAACATTTTGTGCTACTCCAGTTC
240 ハンドル CACCAACCGATATTCATTACCATTATTGTGCTACTCCAGTTC
241 ハンドル CCACCCTCATTTTCTTGATATTTGTGCTACTCCAGTTC
242 ハンドル AACTTTGAAAGAGGAGAAACATTGTGCTACTCCAGTTC
243 ハンドル CAAGGCGCGCCATTGCCGGAATTGTGCTACTCCAGTTC
244 ハンドル CATAGCCCCCTTAAGTCACCATTGTGCTACTCCAGTTC
245 ハンドル TTTCCCTGAATTACCTTTTTTACCTTTTTTGTGCTACTCCAGTTC
246 ハンドル AACGGTGTACAGACTGAATAATTGTGCTACTCCAGTTC
247 ハンドル GATTCGCGGGTTAGAACCTACCATTTTGTTGTGCTACTCCAGTTC
248 ガイド AGAGTAGGATTTCGCCAACATGTTTTAAAAACC
249 ガイド ACGGTGACCTGTTTAGCTGAATATAATGCCAAC
250 ガイド CGTAGCAATTTAGTTCTAAAGTACGGTGTTTTA
251 ガイド GCTTAATGCGTTAAATGTAAATGCTGATCTTGAAATGAGCGTT
252 ガイド AAGCCAACGGAATCTAGGTTGGGTTATATAGATTAAGCAACTG
253 ガイド TTTAACAACCGACCCAATCGCAAGACAAAATTAATCTCACTGC
254 ガイド TTTAGGCCTAAATTGAGAAAACTTTTTCCTTCTGTTCCTAGAT
255 ガイドの取り外し GGTTTTTAAAACATGTTGGCGAAATCCTACTCT
256 ガイドの取り外し GTTGGCATTATATTCAGCTAAACAGGTCACCGT
257 ガイドの取り外し TAAAACACCGTACTTTAGAACTAAATTGCTACG
258 ガイドの取り外し AACGCTCATTTCAAGATCAGCATTTACATTTAACGCATTAAGC
259 ガイドの取り外し CAGTTGCTTAATCTATATAACCCAACCTAGATTCCGTTGGCTT
260 グイデ取り外し GCAGTGAGATTAATTTTGTCTTGCGATTGGGTCGGTTGTTAAA
261 ガイドの取り外し ATCTAGGAACAGAAGGAAAAAGTTTTCTCAATTTAGGCCTAAA
262 ゲイツ Gate29 TGGGGCGCGAGCTGAAAAGTACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTA
263 ゲイツ Gate30 TACTCAGCCCATTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGTCTGAGAGACTACCTT
264 ゲイツ Gate0 TGATGAGCGTGGATGATACTCAGCCCATTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGTCATTTTTGCGGATGG
265 ゲイツ Gate61 ATACAAAAAGCCTGTTTAGTATCTACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTA

表1:ステープル配列のリストナノロボットを構築するために使用される。ステープルズ1-153コアを指定し、構造の大部分を構成しています。ステープルズ154から235は、指定されたエッジであり、構造の61螺旋の端部のそれぞれに位置しています。エッジステープルはnanorobotsの凝集を回避するために設計されたポリチミンテールが含まれています。ステープルズ236から247指定されたハンドルで、貨物のドッキング部位を構成します。ステープルは、それらの特定の構造の位置、およびカーゴ分子のドッキング部位として使用されるコンセンサス配列の領域にそれらを接続する、固有の配列領域を有しているハンドル。ステープルズ248-254は、ガイドを指定し、アニール処理中にデバイスの2つの半分を添付しています。製造後ガイドがナノロボットの二つのセンサによってロックされたデバイスを残して、ガイドの取り外しステープル255から261(ステップ6)の添加によって除去されています。センサ配列は、ゲートを指定されています。 2つのセンサのそれぞれは、PDGFアプタマーと相補鎖から構成されています。より詳細なexplaについて国家はベン・Ishay 14、ダグラスらを参照してください。15。ステープルズは、3つの96ウェルプレート(深い丸底)に、商業的に順序付けられています。各ステープル量は10ナノモルの正規化されています。 HPLC精製を必要とするゲート配列、を除いて、ステープルは、特別な精製操作を必要としません。

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Discussion

我々は、製造、精製、およびDNAナノロボットの視覚化を記載しています。デバイスの六角形の筐体の製造に続いて、ナノロボットの機能が容易に、利用可能な一本鎖ドッキング部位14と水素結合相補性への指定位置を見つけ、ロボットに固有の貨物およびセンシングストランドの簡単な紹介とプログラムされています、15,22。

説明した製造プロトコルは、一般的に折り紙の形状の広い範囲を折るために私たちの研究室で使用されている低速のアニーリングランプを使用しています。生産時間は、Sobczakの迅速な折りたたみプロトコルとして重要な要因の他のプロトコル、になった場合。24を使用することができます 。このプロトコルは、しかし、それは各折り紙の形状のためのキャリブレーションを必要とし、高収率で折り紙の折り畳みを達成することが報告されています。

スピン濾過を過剰ステープルからロボットを精製するために使用されます。 Sをロードする場合サンプルまたは緩衝液を用いて、ピンの列は、注意がピペットの先端で膜を損傷しないように注意してください。膜は、潜在的に劇的に減少した収率が得られ破裂することができます。それはnanorobotsは年齢によって可視化されるまで、フロースルーを廃棄しないことをお勧めします。

特定のアプリケーションのために、より高い浄化率が望まれています。これは、元のスピンカラムを用いて濾過を繰り返すことにより達成することができます。より高い純度のために、新しいスピンカラムは、しかし、これはイールド率に劇的な負の効果を持つことになり、使用することができます。 DNA折り紙構造体を精製するための他の方法は、このような過剰なステープルの電気透析の後にアガロースゲルから切り出したように、試験しました。これらの方法は、記載されたプロトコルと比較して歩留まりが悪いか悪い浄化率のいずれかが生じました。例えば、PEGベースの精製25およびレート帯状超遠心分離26のような他の方法は、試験されませんでした。これらの方法は、阿智ことが報告されています前夜高い浄化率が、しかしそれらは低収率(レート帯状超遠心分離)になるか、潜在的に中空のナノロボットの形状に悪影響を与えることができ、沈殿(PEG系)が必要ですどちらか。

Nanorobotsを製造yeilds 15を増加させるために、閉鎖位置で形状を固定ガイドステープルで製造されます。これは、設計の刺激(記載されているプロトコルにおけるPDGF)に応じて、効果的にオープンにnanorobotsためのガイドの取り外しステープルを追加することにより、これらのステープルを除去することが重要です。過剰の精製の ​​終わりに1モル比:ガイドステープルが鎖置換のプロセスを通じてガイドステープルを解放するガイドの取り外しステープルのドッキングのための足掛かり一本鎖領域と設計されている18 .Theseステープルが10で追加する必要がありますステープル「段階(ステップ4.7)と、エンドシェーカー上の端部に、室温で2時間インキュベートしました。

TEMによる可視化は、includi説明しましたNGウラニル-ギ2%ネガティブ染色。ウラニル酢酸と比較して、ウラニルギは、DNA折り紙設計の優れた分解能を可能に細かい粒子構造を生成します。アリコートを長期間凍結されている場合ウラニルメートが凝固するよう注意が必要です。これは、染色のために新たに調製した2%ウラニルギソリューションを使用することをお勧めします。より良い解像度がクライオTEM 27を利用して達成可能です。

DNAのナノロボットの基本的なアーキテクチャの設計および製造プロトコルは、最終的に均一で簡単です。しかし、柔軟性の広い範囲は、特定の貨物の混合物と感知ストランドの形態で提供されます。また、単一集団に多くのサブタイプが導入することができ、それらの相対的な化学量論は、プログラムされ、特定のニーズに合わせて最適化されています。各律速段階で具体的な動力学の一層の微調整は、二本鎖のハイブリダイゼーションの長さや削減/増加で達成可能です特定のキーの位置でのミスマッチの導入。建設の容易さと柔軟性のこの高度は、生物学的関連性の高い環境で多様な複雑なタスクを実行することが可能なナノスケールデバイスのエンジニアリングを可能にします。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者は有用な議論や作業のための非常に貴重な議論と助言し、バチェレラボのすべてのメンバーのためのS.ダグラスに感謝したいです。この作品は、生命科学の学部とバー - 宜蘭大学のナノテクノロジー&アドバンストマテリアル研究所からの助成金によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNase/RNase free distilled water Gibco 10977
M13mp18 ssDNA scaffold NEB N4040S
10x TAE Gibco 15558-042
1 M MgCl2 Ambion AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO Amicon UFC510024
Agarose Promega V3125
TBE buffer Promega V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution Sigma Aldrich E1510
1 kb DNA marker NEB N3232S
Loading Dye NEB B7021S
uranyl formate polysciences 24762
carbon-coated TEM grids  Science services EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch Bio-Rad
Glow Discharge K100X Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager Bio-Rad
NanoDrop 2000c Thermo Scientific
TEM FEI-G12 Tecnai

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References

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