마우스의 조영 증강 MRI에 의한 시신경 섬유 무결성의 생체 내 이미징

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Neuroscience

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Summary

이 동영상은 순진 마우스 시각 투사의 조영 증강 자기 공명 영상과 급성 시신경 압박 손상 및 만성 시신경 변성과 관련된 시신경 변성의 반복 및 종 생체 내 연구에, 임상 3 T 스캐너를 사용하는 방법을 보여줍니다 녹아웃 마우스 (P50 KO).

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Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K. H., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

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Abstract

설치류의 시각 시스템은 시각 피질에 시상과 중뇌 센터, 시냅스 돌기를 입력 시신경을 형성하는 망막 신경절 세포와 축색 돌기를 포함한다. 그것의 독특한 해부학 적 구조와 편리한 접근성을 바탕으로, 그것은 생존의 연결, 축삭 재생 및 시냅스 가소성에 대한 연구에 대한 선호 구조로되어있다. MR 영상에서의 최근 발전은 망간 매개 대비 향상 (MEMRI)를 사용하여이 돌기의 레티노-tectal 부분의 생체 내 시각화를 사용할 수있다. 여기, 우리는 (200 ㎛)의 3 해상도는 일반적인 3 테슬라 스캐너를 사용하여 달성 할 수있는 생쥐의 시각 투영의 그림 MEMRI 프로토콜을 제시한다. 우리는 15 nmol의 MnCl 2의 단일 투여 량의 유리체 강내 주입은 24 시간 안에 그대로 투영 포화 향상에 이르게하는 방법을 보여줍니다. 망막의 제외, 신호 강도의 변화는 각각 C1됩니다일치 시각적 인 자극 또는 생리적 노화의 함몰. 우리는 더 심각한 시신경 손상에 대한 응답으로 축삭 변성을 모니터링 종에이 기술을 적용, 패러다임 병변 사이트에있는 망간 2 + 교통 완전히 체포하여. 반대로, 활성 망간 2 + 수송 가능성, 수, 축삭 섬유의 전기적 활동을 정량적으로 비례한다. 이러한 분석을 위해, 우리는 시각, 전망 등의 감각의 자연 위축을 표시하는 형질 전환 마우스 모델 (NF-κB의 P50 KO)의 시각 경로를 따라 미네소타 2 + 전송 반응 속도를 예시. 이 마우스에서 MEMRI이 감소하지만, 따라서 NF-κB의 돌연변이에 의해 구조 및 / 또는 기능 장애의 징후를 드러내는, 야생형 마우스에 비해 망간 2 + 전송을 지연 나타냅니다.

요약하면, MEMRI 편리 생체 분석에 다리와 characterizati 대한 해부 조직학을 게시신경 섬유의 무결성과 활동에. 그것은 축삭 변성과 재생, 및 정품 또는 유도 표현형에 대한 돌연변이 생쥐의 조사에 종 연구에 매우 유용합니다.

Introduction

유리한 신경 해부학 적 구조를 기반으로 설치류의 시각 시스템은 신경 보호 1 프로 재생 효과 2,3를 중재하는 약물 화합물 및 이들의 능력을 평가하는 독특한 가능성을 제공합니다. 또한, 최근에 연접 비계 단백질 바순 4 부족한 생쥐에 예시 된 바와 같이, 마우스 돌연변이의 기능과 신경 해부학 적 특성에 대한 연구를 할 수 있습니다. 또한, 보조 도구의 광범위한 스펙트럼은 전위도 및 행동 테스트 및 고유 신호의 광학 영상에 의한 대뇌 피질의 재 배열의 결정에 의해, 예를 들어 망막 신경절 세포 (RGC) 및 RGC 축삭 번호뿐만 아니라 RGC 활동의 특색 추가로 제공한다. 레이저 현미경의 최신 기술 개발은 시신경 (ON)과 뇌의 전체 마운트 표본 깊은 조직의 형광 이미징에 의해 RGC 재생의 현장 시각화를 가능하게한다. 이 histolog에서iCal의 접근 방식, 빛 시트 형광 현미경과 함께 테트라 히드로 푸란을 기반으로 조직의 청산은 deafferented ON 및 광학 기관 (5)에 다시 입력 한 섬유의 해상도를 허용합니다. 이러한 기술은 해상도와 성장 패턴의 결정이 뛰어나 수도 있지만, 그들은 특히 장기 재생의 과정을 평가하기 위해 원하는 개별 성장 이벤트의 반복 및 종 분석을 사용하지 마십시오.

조영 증강 MRI는 생쥐와 쥐 6,7의 레티노-tectal 투사의 최소 침습 시각화를 위해 사용되어왔다. 이는 망막 세포에 상자성 이온 (예를 들어, Mn이 2 +)의 직접 안내 전달함으로써 달성 될 수있다. 칼슘 아날로그로, 미네소타 2 +는 전압 게이트 칼슘 채널을 통해 RGC의 인 somata에 통합하고 적극적으로 그대로 ON 및 광학 기관의 축삭 세포 골격을 따라 운반. 이는 뇌의 핵에 축적하면서그것은 10, 11을 발생할 수 있지만 시각적 투영, 옆 무릎 모양 관절이 핵 (LGN)와 우수한 둔덕 (SC)를 즉, 일차 시각 피질에 transsynaptic 전파, 8,9 무시할 나타납니다. MR의 순서에 따라, 성체 미네소타 2 +는 주로 T 1 스핀 - 격자 완화 시간 (12)을 단축하여 MR의 명암을 보완. 이러한 망간 2 + MRI (MEMRI)가 성공적으로 부상 13, 14 후 축삭 재생과 퇴보의 평가를 포함하여 쥐의 다양한 신경 해부학 적 및 기능적 연구에 적용된 강화, 레티노-tectal 돌기 (15)의 정확한 해부학 적 매핑 뿐만 아니라, 약물 치료 16 일 후 축삭 전송 특성의 결정 등. 미네소타 2 + 통풍 관 및 교통의 연결뿐만 아니라, 향상된 MRI 프로토콜의 투여 량, 독성 및 역학의 최근 분류는 유전자 변형에 대한 연구에의 응용 프로그램을 확장 한일반적으로 임상 실습 17에 사용 된 3 테슬라 스캐너를 사용하여 마우스 9.

여기, 우리는 마우스 레티노-tectal 투사의 생체 내 이미징에 세로에 적합한 MEMRI 프로토콜을 제시하고 순진 다양한 신경 변성 조건에서 망간 2 + 종속 신호 향상을 평가하여 그 적용 가능성을 예시. 우리의 프로토콜은 일반적으로 전용 동물 스캐너보다 더 액세스 할 수있는 적당한 3 T 자기장에서 MR 데이터 수집에 특정 중점을두고 있습니다. 순진 마우스, 우리는 기관 고유의 신호 강도가 실질적으로 재현성 강내 (ivit) 미네소타 2 + 신청 후 증가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 정량적으로, 시각적 투사 따라 미네소타 2 + 전파 (3, 26 개월 된 생쥐 사이에서 측정) 정상적인 노화 과정과 독립적으로 발생 증가는 어둠에 시각적 인 자극과 적응에 내화물입니다. 반대로, Mn이 18 급성뿐만 아니라 nfkb1 녹아웃 마우스에서 자연 사멸 RGC의 죽음과 변성 19 고통 (P50 KO) 다음 감소한다. 따라서, 기존의 조직 학적 분석에 확장에, 각각의 동물의 종 MEMRI 분석은 신경 퇴행성 과정의 독특한 역학의 프로파일 링을 사용합니다. 이 약물 또는 유전자 개입과 관련된 신경 보호 및 축삭 재생에 대한 연구에 유용합니다.

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Protocol

모든 동물의 개입은 실험 동물의 동물 관리 및 사용에 대한 유럽 협약안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 정책에 따라 수행된다. 모든 실험은 지역 윤리위원회에 의해 승인됩니다. 마우스에서 ON 부상의 절차는 다른 곳에서 설명한다.

1. 유리체 강내 주입 망간

  1. 이전의 MR은 조수의 도움으로 스캔에 미네소타 2 + 주입 24 시간을 수행합니다. (멸균 PBS에서 420-450 ㎎ / kg 체중) 5 % 클로 랄 하이드레이트 용액을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 추가로 국소 마취를 위하여 눈 구멍에 각막에 액체 conjuncain 한 방울 (0.4 % oxybuprocaine 염산염)를 적용한다. 15 nmol의 망간을 주입하는 2 + 아이 당 예를 들면, 132 LH 2 <1 M MnCl 2 원액 1 ℓ를 희석하여, 7.5 mM의 MnCl 2 용액을 제조/ 서브> O. 34 G 작은 허브 이동식 바늘 (RN 바늘)에 연결된 5 μL 해밀턴 주사기에 최종 솔루션의로드 5 μL.
  2. 오른쪽 눈으로 시작할 때, 쌍안 현미경으로 부드럽게 열려 양면 마우스를 놓고 왼쪽 손의 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 오른쪽 눈을 고정합니다. 오른손으로 주사기를 들고 끝 가까이에 바늘을 잡아. 눈 전구의 atraumatic 천자를 들어,주의하여 공막 혈관을 살려주는 각막 윤부에 약 1mm 원심 infero - 시간 주위에서 유리체에 바늘을 삽입합니다.
  3. 해밀턴 주사기의 규모를 제어하면서 다음, 보조 천천히 2 μL의 총 부피를 적용합니다. 이 절차를 수행하는 동안, 현미경 최적의 바늘 위치를 모니터링하고 액체의 렌즈 또는 유출의 구멍을 피하십시오. 정적으로 추가로 30 초 동안 삽입 된 바늘을 유지하고 액체를 최소화하기 위해 천천히 철회주사 부위에서 누출.
  4. 절차를 통해, 특별한주의가 눈에 압력을 피하기 위해주의해야한다. 마찬가지로, 눈 전구를 천공 거칠거나 많은 시도를하지 마십시오. 미네소타가 2 + 망막 신경절 및 ON 따라 전송에 통풍 관이 이미 15 nmol의 MnCl 2 포화되어 있기 때문에,이 약간 부정확 사출 볼륨에 의해 신호의 변화를 최소화 할 수 있습니다. 카메라 돌기의 양측 신호 향상을 위해, 왼쪽 눈을위한 주입 절차를 반복한다.
  5. 적용 플록 사신 함유 (3 ㎎ / ㎖) 안약과 절차는 안구 감염과 눈의 건조를 방지하기 위해 한 후 판테놀 함유 연고. MR 스캔의 시작 때까지 일반 주택 조건에서 자신의 새장에 마우스를 반환합니다.

MRI 2. 동물 준비

  1. 2 % / 98 % 이소 플루 란 / 산소 가스 혼합물을 투여하여 마우스를 마취. 거의 수평, 꼬임 위치에 마우스 홀더에 마우스를 장착합니다. 기능다음 MR 스캐너 내부 조정 MR 코일에 ERT 그것. 해당 시스템에 의해 호흡과 심장 박동을 모니터링합니다. 기술적 인 세부 사항, 헤르만 (20)를 참조하십시오.
  2. 동안 MRI, 통합 관에 의해 마우스 헤드 홀더에 연결된 증발기를 통해 초기에 1.5 % / 98.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합 가스의 취입에 의한 연속적인 공급 마취. 스캔하는 동안 기록 된 중요한 매개 변수 (예 : 분당 40 호흡의 안정된 호흡의 비율을 목표)에 따라 마취의 깊이를 조정합니다. 가열 장치를 사용하여 마우스의 복강 사이트에 위치하는 온도 센서에 의해 측정 한, 35 및 37 ° C 사이의 안정적인 신체 표면 온도를 유지한다. 기술적 인 세부 사항, 헤르만 17을 참조하십시오.
  3. 스캔 후, 홀더에서 마우스를 해방하고 마취에서 회복을 가속화하기 위해 순수한 산소를 공급한다. 또한 사용하여 안정된 체온을 유지붉은 빛이 가열 원.

3. MRI 프로토콜

  1. 프로토콜은 35mm × 38 mm 직경의 뷰의 효과적인 필드 전용, SNR 효율, 작은 동물 코일 (선형 편광 리츠 코일)를 장착 한 3 테슬라 스캐너에 대해 유효성이 검사됩니다. 송수신 모드에서 코일을 사용하십시오.
  2. 최종 위치에있는 동물로, 주파수 분석기의 도움으로 코일의 튜닝 및 매치를 조정한다. 수동 이미지 균질성과 품질을 최적화하는 송신기 기준 전압과 전류를 조정 심.
  3. T에게 계획에 대한 시상 및 횡단 뷰에서 0.5 mm × 2mm × 0.5 mm의 해상도를 가진 1 차원 가중 TSE 이미지를 획득. 계획 MR 스캔을 사용하여 코로나 둘레 방향 MEMR 화상을 취득, 좌우 방향의 위상 인코딩을 가진 동물의 머리 평행하게 회전된다. 획득 시간을 최소화하기 위해 조정 보이는 직사각형 필드를 사용실제 머리 크기. 위상 인코딩 방향으로 뷰의 93.8 % 직사각형 필드를 사용하여, 기본 매트릭스 256, 시야 14.08 mm × 50.65 mm × 54mm, 0.11-mm의 128 조각 : 다음 매개 변수를 사용하여 버릇 3D 플래시 시퀀스 (VIBE 3D)를 사용 슬라이스 해상도 슬라이스 두께는 61 %로 설정합니다.
  4. 0.18 mm × 0.21 mm × 0.21 mm의 유효 해상도 (0.1 mm × 0.1 mm × 0.09 mm 보간), 에코 시간 (T) E = 6.51 밀리를 제공하고, 512 × 480 × 128으로 최종 이미지를 만들 수있는 평면 보간을 활성화, 반복 시간 T의 R = 16 밀리 초, 대역폭 = 160 Hz에서 / PX, 플립 각도 = 22 °. 약 30 분의 총 획득 시간 (T)를 달성하기 위해 두 개의 평균과 세 개의 반복을 적용합니다.

4. MRI 데이터 분석

  1. 소프트웨어 syngo의 fastView를 사용하여 데이터를 분석한다. 정량적 인 신호 향상을 위해, O를 정의 영역을 선택F 2 차원 평면 MRI 레코딩에 대한 관심과 개선 된 구조 (SI MEMRI), 조직 배경 (SI의 배경,), 소음 (SD의 N)의 표준 편차의 신호 강도 (SI)를 결정합니다. 필요한 경우, LGN 및 SC 구조에 대한 신경 해부학 적 방향을 용이하게하기 위해 마우스 뇌 아틀라스를 사용합니다. : 수식을 이용한 콘트라스트 - 대 - 잡음비 (CNR)를 계산
  2. CNR = (SI MEMRI - SI의 배경,) / SD N
  3. 각 샘플에 대한 평균 CNR 계산을위한 세 개의 연속 이미지를 정량화. 양측 주입 동물에서, 각각 독립적으로 반구를 분석합니다.
  4. 수평 관상 및 시상 이미지의 묘사를 들어, 원래 3D MRI 데이터 세트에서 다 평면 재구성을 계산합니다. 이러한 처리 된 이미지는 정량 분석​​을하지 않는 것이 좋습니다. 레티노의 애니메이션 3D 재구성 (최대 강도 예측, MIPS의)를 만들려면- tectal 투사, 혈관 조영술 후 처리 소프트웨어 모듈을 사용합니다.

5. 미네소타 2 + Autometallography (TIMM 염색)

  1. MEMRI 다음 미네소타 2 + 추적 뇌 구조의 TIMM 염색의 경우, 15-150 nmol의 망간 2 + ivit 24 시간 이전의 영상에의 투여 량을 주입.
  2. MR 스캔 한 후, PBS의 30 ML 얼음처럼 차가운 0.325 % 나 2 S (산도 7.4)와 함께 동물을 perfuse. 냉동 섹션에서 망막 동결 샘플을 해부하다.
  3. cryotome 15 μm의 두께의 연속, 적도 부분을 잘라.
  4. Angenstein 22에 따라 정착 및 cryoprotection의 부재에 TIMM 염색 (21)를 수행합니다.

6. 통계 분석

사후 ANOVA 다음에 하나의 비교에 대한 학생의 T-테스트를​​ 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 개별 N 번호는각 실험에 대해 별도로 없습니다. (***, P ≤ 0.001, **, P ≤ 0.01 *, P ≤ 0.05) 0.05 ≤ P에 도달 한 결과는 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다.

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Representative Results

정확하게 시각적 투사의 활력과 기능을 평가하기 위해이 영상 기술의 능력은 유리체와 망막 신경절로의 흡수에 독성 미네소타 2 + 복용량의 정확한 응용 프로그램에 의존한다. 이 주요 가정은 계층 별 미네소타 2 + 흡수가 autometallography (TIMM 염색) (21)에 의해 설명된다 그림 1에서 테스트합니다. 망막 섹션은 컨트롤과 같은 15 nmol의 150 nmol의 하나 미네소타 2 +, 또는 PBS의 ivit 신청 후 24 시간에서 분석 하였다. 이 시점에서, 미네소타 2 + 주입 망막은 T 1에서 최대의 신호 향상을 보여 가중 MRI (= 3 N, 점선), PBS는 망막 신호 (= 3 N, 점선)에서 강화되지 주입 반면 (그림 1 ,) 패널을 떠났다. 150 nmol의 주입 눈에 hyperintensive 신호 향상을합니다. 반면, nonenhanced 뇌 영역 (별표)는 모든 공동 비슷한 배경 신호 강도를 표시특히 RGC 층과 다음과 같은 개인 RGC의 인 somata의 조사에 의해 확인 된 신경 섬유 층 (NFL) (그림 1, 가운데 패널의 확대 인 세트)에서 nditions (녹색). Ivit 미네소타 2 + 응용 프로그램이 증가 전반적인 TIMM 염색 H & E 공동 라벨 (오른쪽 패널).

마우스 레티노-tectal 돌기의 생체 촬상의 경우, 함께 장비와 동작 파라미터는,도 2에 도시 된 바와 같이, 3 T 필드에 생쥐를 분석하도록 구성되어 특별한 마우스 MEMRI 프로토콜을 선택하는 것이 중요하다. 이러한 스캐너의 설정을 적용, 우리의 이전 작업은 CNS의 이미지 해상도에 대한 쥐의 머리 코일 전용 마우스 전신 코일 (17)에 우수 것으로 나타났다. 쥐의 머리를 해결하려면 제대로 쥐 코일 내에서의 위치를​​ 조정하기 위해, 우리는 플라스틱 물린 바 크래들과 원뿔 튜브를 사용, 둘은 신체 치수에 맞게 다운 스케일링하는쥐 (그림 2A, B). 이미지는 3 차원 구배 에코 시퀀스를 구현 횡 T 1 가중 행렬 획득되면 획득 시간 35 분 이내 (200 ㎛) (3)의 고해상도 영상의 생성이 예상 될 수있다. 우리는 강력하게 스캔하는 동안 중요한 기능의 지속적인 모니터링을 권장합니다. 함께 postimaging 산소와 몸의 온도 조절 마취의 조정은 크게 복구 시간을 가속화하고 약 100 %의 생존율을 보장합니다. 이러한 기술적 인 사항은 전체 일대는 길이와 반복 MRI를 유지할 것을 보장하기 위해 필수적이다.

모든 연구에서, 15 nmol의 단지 무독성 Mn이 2 + 투여 띄게 ON, 망막 CNRS 바로 충분한하는 ivit 애플리케이션 구에 사용되어야하고, 시냅스 전 뇌내 LGN 및 SC까지 광섬유 요로. CNR 값은 최고 200 ㎛ 두께의 횡단 계산됩니다원래 등방성 3D 볼륨을 reslicing에 의해 원래의 MRI 데이터 세트에서 얻은 조각. 그림 3a는 그 세 가지 영역은 (1) 신호 강화 영역 (SI MEMRI 각 이미지에서 선택한 강화 LGN에 대한 정확한 CNR 결정의 예를 보여줍니다 ), (2) 비 아핀 뇌 조직 (SI의 배경,), (3) 백그라운드 노이즈 (SD의 N). 하나의 영상 투사의 전체를 따라 정량 기대할 공간 신호 향상은 그림 (b)에 표시됩니다. 시신경 유두에서 봉우리 dorsoventral 평면을 따라 망막 섹션의 신호 향상의 강한 점진적으로 증가합니다. 또한, 적용 실험 조건 (시각 피질에 신호 드롭)에서 대뇌 피질의 층에 관련 transsynaptic 미네소타 2 + 전파의 부족을 확인합니다. MIPS의 토토 (동영상 1)에서 레티노-tectal 투사의 3 차원 위치를 시각화 할 가능성 설명이다.시각적 투사 따라 망간 2 +의 ccumulation은 칼슘 2 + 채널과 빠른 축삭 수송에 의존뿐만 아니라 표적 조직 (13)로부터 상대적으로 낮은 클리어런스 전압을 통해 망막 신경절 세포에 흡수 반응 속도에 의해 결정된다. 우리의 이전 연구에 따르면 키네틱 이하, Mn 2 + 종속 신호 향상 빠르면 주입 후 6 시간 등을 검출 할 수있다. 그것은 24 시간에서 더 봉우리와 120 시간 주입 후 9 내에서 기본 수준으로 다시 감소한다. 따라서, 최적의 결과를 달성하기 위해, MEMRI 쥐 13 필요한 인핸스 시간의 반을 나타내는, 주사 후 24 시간을 실시한다.

MEMRI에 의해 시각적 투사의 콘트라스트 향상을위한 원리를 설명하는 데, 우리는 더 두 개의 매개 변수의 영향을 의사 소통 - 빛 조건과 동물의 연령 - 정량적 측정에 영향을 줄 수있는 :

(1) 조를 테스트하려면또는 중뇌 센터에서 미네소타 2 +의 자극에 의존하는 축적, 마우스는 어느 손전등 정의 된 주파수의 노출 (5 Hz에서)과 빛의 강도 (3 W의 LED)에 의해 달성 빛 자극 조건에서 또는 스캔 전에 완전한 어둠에 보관 하였다 와 미네소타 2 + 노출 24 시간 동안. CNR 24 시간의 정량 분석은 ivit 후 미네소타 2 + 응용 프로그램은 빛 자극 조건 (66.29 ± 3.07 54.56 ± 3.08, P ≤ 0.05, N = 7 /에 비해 어두운 적응 망막의 신호 강도의 상당한 증가를 보여 8, 그림 3C). 주변 망막 및 시신경 유두 (그림 (b) 참조) 사이의 신호 향상에 그라데이션을 감안할 때, 우리는 항상 모든 실험군에서 망막 섹션을 해당 분석 안심. 예상대로 ventrodorsal의 평면을 따라 이미지 분석은 절대 CNR 값이 두 조건에서 아래로가는 것을, 밝혀졌다. 중요한 것은, REL명암 적응 망막 사이는 ative 신호 차이 (데이터 미도시) 고정 유지된다. LGN의 투사 영역에서 그러나, 신호 향상 (26.97 ± 1.78 26.58 ± 1.05, P = 0.9, N = 7-2)와 SC (25.09 ± 1.24 26.81 ± 1.55, P = 0.4, N = 7 / 8) 빛과 어둠의 조화 환경 (그림 3C) 사이에 구별 할 수 있습니다. 이 분석은 대상 지역에서 레티노-tectal 투사와 축적을 따라 전파가 일치 시각적 인 자극에 의해 좌우되지 않는 반면, 망막 층에 미네소타 2 +의 흡수가, 빛의 노출에 민감하다는 것을 보여줍니다. 대안 적으로, 3 T 스캐너의 신호 감도는 LGN 또는 SC에서의 신호 변화를 검출 임계 값 이하가 될 수있다.

(2) 영상 투사의 MEMRI 관련 신호 향상에 동물의 시대의 의미를 탐구하기 위해, 우리는 3 26개월 O 사이에 마우스를 분석F 나이. (; = N, P = 0.79 16 23.90 ± 0.81) 13 개월 (23.35 3 개월 생쥐의 LGN (23.49 ± 1.36, = 12 N)이 7개월 세 생쥐에서 측정 된 신호 강도 다르지 않다있는 CNR 값 그림 3D) 1.29, P = 0.94, N = 10) 개 또는 26 개월 (25.10 ± 2.29, P = 0.53, N = 6 ±. 마찬가지로, SC의 신호 강도 (16.92 ± 2.18, P = 0.37; 그림 3D) 3 개월 (19.01 ± 1.20)과 연령에서 26 월 사이 변경되지 않습니다. 약간의 증가 26 개월 된 망막 (38.49 ± 3.25)의 CNR 값에 분명하지만 모든 그룹 (P> 0.05)에 걸쳐 비교했을 때,이 증가는 의미가 도착하지 않습니다. 이 실험은 시각적 투사의 대뇌 대상 지역의 신호 향상은 시각적 자극과 생리적 인 노화의 영향을받지 있음을 나타냅니다.

다음에, 우리는 O를 구조적 변경을 검출하기 MEMRI의 감도를 입증F 영상 투사가 급성 및 만성 axonopathy에 의해 발생. 이 탐험, 부상 18뿐만 아니라 시각적 통로 (19)를 포함하여 감각 돌기의 조숙 한, 자연 변성을 표시하는 동물 모델에 외상에 의해 유도 Wallerian 변성의 모델을 사용 하였다 :

(1) ON의 압박 손상에 의해 유도 된 외상 axonopathy는 axona 다발의 파손의 원인이됩니다. LGN, 미네소타 2 + 강화 된 신호의 완전한 손실에 의해 시각 및 SC 일 주일간 (그림 4A 어느 날 (도시하지 않음) 분석으로 그 결과, 축삭 세포 골격을 따라 미네소타 2 +의 레티노-tectal 수송은 완전하고 지속적으로 차단됩니다 점선), 4 주 (도시되지 않음)는 부상을 배치한다. 분명히 ON 손상의 신경 해부학 연속 MR의 기능을 설명하고 순진한 상태에서 그들을 해부, 병변은 일방적으로 가해졌다. 이 t에 변경되지 않은 망간 2 + 전송 결과그는 개입의 측면에서 추적 중단에 대비 측면을 제어 할 수 있습니다. deafferented 구역 CNR 값의 분석은 신호 향상 (미도시)의 완전한 부재를 확인한다. 이 실험은 더 MEMRI (그림 4B) 전에 부상 후 투사 따라 신호 강도의 길이 평가에 의한 병변 사이트의 위치와 정도를 검출하기에 매우 민감하다는 것을 보여줍니다. 부상 전에 ON 따라 신호 강도가 지속적으로 배경 위에 위치 유지하는 동안, ON 손상 후 배경 레벨 1 하루 신호 강도의 측두 - 공간 드롭이있다.

(2) 우리의 이전 작업은 주입 9 후 24 시간을 측정 할 때 LGN에있는 망간 2 + 종속 신호 향상이 NF-κB의 서브 유닛 P50이 결여 10 개월 마우스에서 감소 것을 보여 주었다. 높은 일관성과이 검출, 우리는 레티노-tectal 미네소타 2 + 트랜스에 전반적인 손상을 가정포트, 아마도 망막 신경절의 수가 감소로 인한 노화의 P50 KO 마우스 (19) 신경 병증 관. 또한, 감소 된 신호 향상은 유리체에서 지연의 연결 이해 및 망간 2 +의 전파와 함께하고 병적 인 투사 함께 관련 될 수 있습니다. 후자의 가능성에 일찍 (8 및 24 시간)과 후반 (48, 72 시간) 시간이 15 nmol의 망간 2 +의 하나의 응용 프로그램 후 반복적 인 MR 스캔을 수행하고 망막 및 LGN의 신호 향상의 역학 연구를 통해 탐색 할 수 있습니다 포인트. 야생형 및 P50 KO 마우스에서, 8 시간에 망막 신호 향상 피크 거의 동일한 개선 속도 (43.52 ± 3.24 및 40.72 ± 2.79, P = = 3-6 0.6, N, 왼쪽 그림 4C). 신호 향상은 24 시간 후 분사에 야생 유형의 높은 남아있는 동안 P50 KO 마우스의 감소 (43.38 ± 2.18 32.89 ± 1.54, P ≤ 0.01, N = 5-8). 이후 단계 (48, 72 시간) 동안 신호 향상 따라서 지연 망막 미네소타 2 + 통풍 관 및 P50 KO 마우스의 전파를 제외하고, (녹아웃 마우스에 일관되게 낮은 CNR 값으로) 두 그룹에서 감소한다. P50 KO 마우스의 LGN에서 해당 결과는이 개념을 확인합니다. CNR은 8과 48 시간의 후 분사 (P ≤ 0.05, N = 5-9) 사이의 상당히 낮은이지만, P50 KO 마우스의 신호 감쇠의 반응 속도 (오른쪽 그림 4C) 야생형 생쥐에 해당됩니다. 따라서, 레티노-tectal 투사의 감소 측두 - 공간 신호 향상은 제한된 RGC 인구보다는 손상 전송 반응 속도에서 발생 감소 축삭 번호에 의한 것입니다. 우리는 CNS에 projectional 장애에 대한 유전자 돌연변이 마우스를 화면에 가치있는 도구가 될 수 있도록 MEMRI을 제안한다.

내용 "FO : 유지 - together.within 페이지를 ="항상 "> 그림 1
미네소타 2의 그림 1. TIMM의 염색 + 망막 신경절에 통풍 관. T 1의 대표 히트 맵 이미지를 MRI (자기 공명 영상 T 1) 신호 렌즈의 향상 및 전체 망막 주위 (점선) 24 시간을 보여 가중치 15 ivit 신청 후 nmol의, 하이퍼 집약적 인 신호 향상 150 nmol의 적용 후 미네소타 2 + (왼쪽). 따뜻한 색은 차가운 색상보다 더 높은 신호 값을 나타냅니다. 스케일 바 : 1mm. / 오른쪽 중간 : 미네소타 2 +는 TIMM 염색 (검은 색)을 사용은 침전에 의해 검출로 MnCl 2 ivit 주입 후 망막 신경절에 의해 통풍 관. PBS 처리 제어 망막 섹션 (톱, N = 3) 오히려 약한 염색 및 RGC 층 (RGC)의 확산 차별화를 보여줍니다. 고배율는 D에게 허용하지 않습니다. 개별 셀 (확대 인 세트)의 iscrimination Ivit MnCl 2 응용 프로그램이 차등 특히 신경 섬유 층 (NFL), RGC 층 및 내부 핵 계층 (INL에서 눈에 띄는 실버 강수량, 망막 층에 걸쳐 총은 염색을 증가, 중간과 하단 , 확대 인 ​​세트, N = 3). H & E가 추가로 확인하고 같은 층에게 특정 미네소타 2 + 축적 (오른쪽 패널) 염색과 TIMM의 Colabeling. 스케일 바, 개요 : 50 ㎛, 배율 : 25 μm의. IPL, 내부 얼기 층; OPL, 바깥 얼기 층; ONL, 바깥 핵 층; RPE, 망막 색소 상피.

그림 2
그림 2. 임상 3T 스캐너에 마우스 MEMR 이미지 수집을 위해 특별히 MRI 장비를 보여주는 사진. A) B와 맞춤 마우스 크래들을 보여줍니다호흡 모니터링 (흰색 패드, 파란색 튜브). B)에 대한 ITE 바 헤드 고정 센서는 크래들에 위치 고정 마우스를 보여줍니다. 마취 가스. C)가 전송에서 작동하는 선형 편광 리츠 코일 내부에 마우스 머리 받침대의 위치를 예시합니다. D 수신 모드 왼쪽 공급)에 튜브는 차폐 관 앞의 코일 플랫폼을 보여 임상 3 T 스캐너. 구리 코팅 된 튜브가 뜨거운 물 기반으로 난방 매트 (튜브 주위에 검은 포장) 노이즈 차단 MRI 신호에서 추가 보호를 제공합니다. E)는 3 T 스캐너의 기공 내에서 동물 코일의 완전한 세트 업을 시각화 단지 스캐너 내부의 등각에 정확하게 동물 머리를 배치하기 전에.

그림 3
횡단 MRI에서 강화 된 LGN 및 배경 조직에 대한 관심 (ROI) 매핑 지역의 다양한 빛과 연령 조건에서 순진 레티노-tectal 투사의 그림 3. MEMRI.) 그림 (왼쪽) 기록. LGN 특정 신호 향상은 열지도 프레젠테이션 (오른쪽)에 의해 설명된다. 1, 1 ', 좌우 LGN; 2, 2 ', 배경 티슈; 3, 소음; P, 뒤; R, 맞아. 스케일 바 :. MEMRI에 의해 원래 인수 횡단 MR 이미지 분할 결정과 같은 단일 레티노-tectal 투사 따라 신호 향상의 100 μm의 B) 공간 매핑. 채워진 사각형, 미네소타 2 + 종속 신호 향상; 열린 삼각형, 배경 신호. R, 망막; ON, 시신경; OT, 눈 관; LGN, 옆 무릎 모양 관절이 핵; SC, 우수한 둔덕; VC, 시각 피질. 슬라이스 두께, 200 ㎛. C) 빛 자극은 크게 망막 신호 향상을 줄일 수 있습니다. EnhaLGN와 사우스 캐롤라이나에있는 ncement는 시각적 자극과 무관합니다. 채워진 원, 어두운 적응; 열린 원, 빛 적응. D) 신호 향상은 3 26 월 사이 연령의 증가에 독립적이다.

그림 4
신경 퇴행성 조건에서 레티노-tectal 투사의 그림 4. MEMRI. A) 양자 ivit 주입 된 생쥐의 MEMRI가 오른쪽의 일방적 인 압박 손상 후 1 주간 실시. 수평 관상, 및 측면보기의 다중 평면 재구성은 부상 반구 (점선)에 대한 LGN 및 SC에 신호 향상의 완전한 부재를 묘사. C, 반대측 반구; 나는, 동측 반구입니다. 스케일 바 :. 1mm B) MIP 이미지와 ON 따라 공간 신호 향상의 길이 MRI 분석 전에부상 후 일일. R, 망막; ON, 시신경; 병변의 위치를​​ 화살표. 스케일 바 :.. 망막 세포에 망간 2 +의 P50 KO 마우스의 영상 투사의 만성적 인 신경 퇴행에서 신호 향상의 0.5 mm C) 속도론 초기 (8 시간) 섭취는 영향을받지 않습니다 만, 이미 P50의 ​​LGN에 감소 KO 마우스. 반복 MR 24, 48의 이미징 및 (만 망막에 대한) 72 시간에 지속적인 신호 감소를 보여 주지만, 미네소타 2 + 전송 및 P50 KO 마우스의 망막 및 LGN의 축적과 비슷한 반응 속도.

영화 1 : 애니메이션의 3D 열지도 프레 젠 테이션 현장 조영 증강 레티노-tectal 투영 MR 영상이 15 nmol의 MnCl 2의 양자 ivit 주입 후 24 시간을 실시 하였다.. 데이터는 MIP 모드로 표시됩니다. 슬라이스 두께, 200 ㎛. <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4"대상 = "_blank"는>이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

시각 시스템의 MEMRI은 순진하고 병적 인 조건에서 기능을 평가하기위한 기존의 신경 생물학적 기술을 확장합니다. 떨어져 고립 CNS 섬유 기관의 무결성에 독특한 통찰력을 제공에서, MEMRI 쉽게 시각적 인식에 대한 특정 패러다임의 즉각적인 결과를 조사하기 위해, 행동 예를 들어, 테스트, 검안 및 시각 기반의 물 작업으로 보충 할 수있다. 또한 전기 생리학과 생체 내에서 기능 시각적 특성과 조직 학적 조사를 연결합니다. 이 기술은 (그림 3에서 오차 막대 4 참조) 높은 신뢰성 및 동일 그룹 내 작은 interindividual 차이로 재현. 그 신호 향상이 추가 미네소타 2 + 공급 (9)에 의해 상승 할 수없는 고원에 도달 할 수 있도록 흥미롭게도, 15 nmol의의 용량으로, 미네소타 2 +는, 통풍 관과 축삭 수송은 프로세스를 포화. 실제 점에서적어도 신호 향상에 어느 정도, 주입 관련 변화에 같은 용량 반응 특성 최소화를 볼 수 있습니다. 특히, 투여 량 및 망간 2 + 신호 향상의 반응 속도에 제시된 데이터는 최적의 콘트라스트 향상을 달성하기 위해 마우스에 대한 구체적이고 약 10 - 20 배 높은 망간 2 + 용량 증가 대기 시간 (36 시간)이 필요 쥐에서와 구별되는 13, 23. 또한, 영상 투사 따라 개선은 동물 3 세 26 월 사이 일관성을 유지. 이 발견은 시각 노화 쥐에서 수행 테스트 및 C57/B6 마우스가 24 세 2 년에 정상 시각적 활동을 유지하는 것이 사실과 일치한다. 우리가 노화 연구에 길이 방향으로 각각의 쥐를 분석하지 않았지만, 이전의 결과는 명확 세로 노화 연구에 원하는 수 있습니다 시각 유지 보수 9, 15 nmol의의 반복 투여 미네소타 2 + 투여의 안전성을 보여줍니다.

미네소타 2 +는 망막 신경절에 포함되는 개념에 따라, 우리는 미네소타 2 +가 Angenstein 등에 의해 적용되는, 무료 금속 이온은 침전에 의존 TIMM 염색하여 인 somata에 통풍 관을 보여줍니다. 뇌내 미네소타 2 + 감지를 위해 다음과 같은 그 조직의 응용 프로그램 22. 이전 했습니다만 미네소타 2 + 분포는 쥐 CNS (25)의 연결 회로를 묘사하는 54 미네소타 2 + 동위 원소의 오토 라디오에서 검출 아니라 세포 수준에서했다. 여기에, TIMM 염색에 의해, Mn 2 +의 속성이 우리가 RGC 및 신경 섬유 층에 눈에 띄는 실버 강수량을 찾을 노출 된 망막 내에서 서로 다른 세포 집단에 통풍 관 수 있습니다. 이 프로토콜은 15 nmol의 Mn이 2 +에 비해 150 nmol의의 투여의 도포 후 TIMM 염색법에 의해 방송에게 향상된 검출을 적용 주목해야한다. 미네소타 2 + 통풍 관과 축삭 트랜스 있지만포트가 이미 높은 복용량에서 레티노-tectal 투사 따라 추가 CNR 증가를 부여하지 못함, 따라서 15 nmol의 포화되고, 과도한 섭취는 언 바운드 따라서 미네소타 2 +와 실버 강수량에 대한 접근을 렌더링 무료, 단백질의 가용성을 높일 수 있습니다. 염색 감도 미래의 분류는 정의 된 조직 학적 지역 내 망간 2 + 농축의 세포 위치에 특정 CNS 돌기 MEMRI 기반 CNR 값의 상관 관계를 허용합니다. 이러한 기능은 시각 투사 외부의 다른 CNS의 지역에서 망간 2 + 분포의 특성과 정량화를위한 ​​유용 할 수 있습니다. 마찬가지로, 미네소타 2 +는 해마 이끼 섬유 (26)의 변성과 재생을 시각화하는 kainate 독성 모델에서 사용되어왔다.

미네소타 2 +는 전압 의존성 칼슘 채널에 의해 흡수되고 세포 내 활성 축삭 수송, 배포하는 캘리포니아N 콜히친 처리 25,27 의해 차단 될 수있다. MnCl 2의 복강 내 투여를받은 쥐에 시각적 자극 실험은 내부 및, 특히, 외부 망막 28에서 증가 된 신호 향상을 계시했다. 이것에 의해, 어두운 적응 추가하여 시각적 인 자극 (28)에 통풍 관 망막 미네소타 2 +의 감도를 나타내는 유일한 실내 조명 조건에 노출 된 쥐에 비해 바깥 쪽 망막 층에서 신호 강도를 발생시킵니다. 마찬가지로, 우리는 ivit 미네소타 2 + 신청 후 시각적 인 자극에 노출 된 생쥐에 비해 어두운 적응 쥐의 망막에서 향상된 신호 강도를 찾을 수 있습니다. 이것은 감광체 세포에서 연속 암전류의 망막 및 세대 별 전기 생리 특성과 관련 될 수있다. 광 수용체의 외부 세그먼트로 칼슘 2 + 유입이 크게 어두운 현재의 구성에 기여하기 때문에, 자신의 세대가 동반 될 수 있습니다바이 어두움하에 시각 세포 층에 Mn이 2 + CO의 흡수 강화. 대조적으로, 광 자극은 암전류를 감소하고 감광체 셀 (29)의 과분극을 초래. 이에 따라, 전체 망간 2 + 흡수는 빛 조건에서 감소 될 수 있습니다.

MEMRI의 안정적인 사용을 위해, 그것은 더 발음 미네소타 2 + 시각적 투사 또는 그것의 전체 연장의 다른 부분을 따라 신호 향상을 변경 어두운 적응 망막에 통풍 관 여부를 명확히하는 것이 중요합니다. 뇌 네트워크의 MEMRI 신호 강도의 자극에 의존하는 변화는 복강 미네소타 2 + 응용 프로그램 (30) 후 음향 시스템에 대해 설명하고 있습니다. 로 유 등.이 연구에서, 쥐 MR 스캔과 열등 colliculi의 T 1 가중 신호 향상을 연속적으로 조사되기 전에 변수 노이즈 주파수에 노출되었다. 음향 자극 significan 밝혀졌다TLY 따라서 활동에 의존 미네소타 2 + 축적 (30)의 fMRI와 같은 문자를 예시, tonotopic 표현 MEMRI 신호 강도를 증가시킨다. 대조적으로, 우리의 실험은 LGN, 미네소타 2 + 축적을 설정하고있는 SC는 시각적 자극의 독립이 나타납니다. 그러나 감각 뇌 매핑 시도에서 이러한 차이는 유 (30)에 의해 사용되는 높은 분야 7 T 스캐너에 비해 낮은 자기장하고 3 T 스캐너의 검출 제한 임계 값에서 발생할 수 있습니다.

지금까지, 그것은 범위 생물 리 학적 매개 변수가 선행 성 축삭 미네소타 2 +의 전송 방법 MEMRI 전기 활동의 지표 역할을 수에 영향을 미칠 무엇을 알 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 망막 신경절 미네소타 2 + 송신 독립적 바이폴라 셀로부터 수신 된 광 및 전기 자극의 특정 입력에 적어도 부분적으로 발생하는 것으로 보인다. 다르게는, 전기의 순 효과레티노-tectal 투사 내 ctivity 어두운 응답 'OFF-망막 신경절'의 전기 자극과 'ON-망막 신경절'빛 반응의 결과 일 수 있습니다. 이러한 해석은 레티노-tectal 투사 따라 미네소타 2 + 교통이 같은 망막 변성 (11)를 일으키는 원인이되는 Pde6b 유전자의 RD1 돌연변이를 가지고 CBA 마우스로 시력 저하와 마우스 계통에 손상되지 않았 음을 발견에 의해 지원됩니다. 야생형 시력과 CBA 마우스에 운동 연구에서 비교 운송 요금은 (2.5 시간 포스트 분사의) 초기 유입 단계와 LGN과 SC 11 (24 시간에서) 최종 신호 향상을위한 관찰되었다.

이와 함께, 이러한 관찰은 MEMRI가, 예를 들어, 시각 시스템으로 여기에 예시 된 바와 같이, 오히려 전기 활동에 비해 구조적 무결성 및 대사 안정성에 대한 가치 척도를 나타내는 개념을 지원합니다. 실제적으로, 겉보기에의빛 노출 대뇌 LGN와 사우스 캐롤라이나에있는 신호 향상의 테이블 독립 조명에 관한 특별한주의없이 강력한 처리 및 동물의 주택 수 있습니다. 한편, 망막 신호 향상에 초점 MEMRI 연구를 위해, 그것은 이전에 스캔 강력히 제어 광 조건 하에서 동물을 유지하는 것이 필요하다.

미네소타 2 + 축삭 전송 속도와 후속 MEMRI의 신호 향상에 영향을 미치는 생리 학적 매개 변수 중, 체온의 안정성이 특히 중요 할 수 있습니다. 이는 농축는 크게 30 ° C로 체온의 임시 감소에 감소 할 것으로 나타났다 뇌의 기본 후각 투사 대상의 향상을위한 비강 미네소타 2 +에 대한 연구로 표시됩니다 정상 체온 27에서 개선 신호를 비교. 따라서 체온 이전과 MR 동안 모니터링하고 조정해야합니다 P는하지 만 검색동물의 건강을 rotect, 또한 망간 2 + 전파의 생리 학적 파라미터를 정상화.

병태 생리 학적 변화와 신진 대사 장애는 미네소타 2 +, 프로젝션 센터의 신호 향상의 축삭 수송의 효능에 영향을 미치는 때문에, 예를 들면, LGN 및 SC는, 구조적 무결성 및이 통로의 기능 활동에 대한 척도로 역할을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 ON 변성의 두 가지 조건을 제시하고 시상과 중뇌 센터에서 미네소타 2 + 전파 및 농축이 축삭 무결성의 함수로 달라 보여줍니다. P50 KO 돌연변이 느린 축삭 변성 동안 관련 축삭 재생의 부족으로 인해 사주 내에 복구하지 않습니다 즉시 손상 후 총 신호 손실, 급성 ON 부상의 결과는 LGN의 감소 CNR 값으로 반영됩니다. 세로 이미지의 가능성을 감안할 때, MEMRI이 응용 프로그램은 가치있는 F 수 있습니다또는 ON의 postlesional 성장 반응을 모니터링하고 망막 신경절에 proregenerative 유전자 또는 약물 개입의 조사를 할 수 있습니다.

또한, 우리는 만성 축삭 변성 프로세스와 관련된 신호 향상에 점진적 손상을 감지 할 수있는 매우 민감한 방법으로 MEMRI을 제시한다. 전사 인자 NF-κB는 시각 시스템 (19) 내에서 NF-κB의 디스플레이 나이에 따라 신경 세포의 손실과 축삭 변성의 P50 서브 유닛의 삭제와의 연결을 유지 보수 및 마우스에 참여하고있다. 조직 학적 및 전자뿐만 아니라 현미경은 레티노-tectal 투사의 MEMRI이 생쥐의 형질 변경을 식별 할 수있다, 분석한다. ivit 미네소타 2 + 응용 프로그램을 다음과 같은 일련 T 1 가중 MR 영상의 획득으로, 우리는이 P50의 ​​시각적 통로를 따라 단순히 지연 미네소타 2 + 수송에서 감소 전체를 구별KO 마우스. 따라서, 하나의 망간 2 + 신청 후 MEMRI에 의해 반복적 인 데이터 수집이 가능한 유전자 변형 생쥐의 귀중한 수영장에서 축삭 수송 동역학 및 신경 생리 학적 변화의 정의를 할 수 있습니다. 현재 MEMRI의 몇 가지 수정은 인간의 진단 응용 프로그램에이 기술을 안전하게하는 것을 목표로 조사를 받고 있습니다. 주사를 ivit에 대한 대안을 구성하는 높은 임상 관련성의 유망한 방법은 안약으로 미네소타 2 +의 전달입니다. 이미지가 4.7 T 동물 스캐너 (31)에 인수되었을 때 이것에 의해, 1 M MnCl 2의 국소 투여는 SC의 20 % 상당 신호 향상을 얻었다. 이 방법은 망막 허혈 31 다음 변성에 대한 광범위한를 감지 할 수 있었고, 반복적으로 매달 간격 (32)에 적용 할 때 적용 농도는 안전 증명했다. Mn이 2 +의 비교적 높은 신경 독성 관련 예를 들면, 임상 관련 MEMRI의 응용 프로그램을 지원하는 데 도움이 될 것입니다.

요약하면, 우리의 연구는 MEMRI 따라서 시각 시스템의 기능을 평가하기위한 검안 작업을 확장, 쥐에 레티노-tectal의 회로들을 연구 할 수있는 강력한 실험 방법입니다 보여줍니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

AK는 벨 룩스 재단에서 지원하는 오펜하임 재단과 RH에 의해 지원됩니다. 우리는 조직 학적 지원을위한 기술 및 K. Buder에 I. Krumbein 감사합니다, TIMM 염색에 대한 기술 자문 J. 골드 슈미트 (신경 생물학, 마그데 부르크, 독일 라이프니츠 연구소).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
Gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

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References

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