Miyelin Oligodendrosit Glikoprotein (MOG
1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF), Münster, 3Institute of Physiology – Neuropathophysiology, University of Münster

Published 4/15/2014
5 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection
 

Summary

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), çoklu skleroz kurulmuş bir hayvan modelidir. C57BL / 6 fareleri, merkezi sinir sistemi otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından neden olduğu artan gevşek felce neden, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) peptit 35-55 (MOG 35-55) ile immünize edilir. Hastalığın başlama ve izleme için protokoller tartışılacaktır.

Cite this Article

Copy Citation

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multipl skleroz, güçlü bir nörodejeneratif bileşeni olan merkezi sinir sisteminin kronik nöroenflamatuar demiyelinizan bir hastalıktır. Hastalığın kesin hastalık sebepleri henüz açık olsa da, oto-reaktif T lenfositleri ile patofizyolojisinde merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. MS tedavisi şimdiye kadar sadece kısmen etkili olduğunu ve araştırma çabaları hastalığın patofizyolojisi üzerine bilgimizi genişletmek ve yeni tedavi stratejileri geliştirmeye devam ediyoruz. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), MS bir çok klinik ve patofizyolojik özelliklerini paylaşmak için en yaygın hayvan modelidir. Insan MS'in farklı klinik immünolojik ve histolojik yönlerini yansıtan EAE modelleri geniş bir çeşitlilik vardır. Farelerde aktif kaynaklı EAE sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar ile kolay uyarılabilir modelidir. Özellikle otoimmün neuroi meydan transgenik fareler kullanılarak ilaçların ya da belirli genlerin etkilerini araştıran için uygundurnflammation. Bu nedenle, farenin merkezi sinir sistemi miyelin homojenatı veya proteinlerin peptidlerle immünize edilir. Nedeniyle, bu peptitlerin az imünojenik potansiyel, güçlü yardımcı maddeler kullanılmaktadır. EAE duyarlılık ve fenotip seçilen antijen ve kemirgen gerginlik bağlıdır. C57BL / 6 fareleri, transjenik fare yapımında yaygın olarak kullanılan gerilme ve miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) diğerleri arasında yanıt verir. İmmünojenik epitop MOG 35-55 iki gün sonra aşılama gününde uygulanır ve tam Freund katkı maddesi (CFA) önceden bağışıklığın ve pertussis toksinine içinde süspanse edilmektedir. Fareler aşılamadan sonra 9-14 gün içinde gevşek felç artan bir "klasik" kendini sınırlayan monofazik EAE gelişir. Fareler 25-50 gün boyunca bir klinik skorlama sistemi kullanılarak günlük olarak değerlendirilmekte. Bakım EAE ile hayvan alma yanı sıra, bu modelin potansiyel uygulamalar ve sınırlamalar için özel hususlar ele alınmıştır.

Introduction

Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sisteminin demiyelinizan kronik inflamatuar hastalık olduğu heterojen ve biriken klinik belirtilerde oligodendrositler ve nöronlar, sonuç yok. MS merkezi sinir sistemi (MSS) bir prototipi otoimmün bozukluk olarak kabul edilir ve hayvan modelleri karmaşık patogenezi aydınlatmak için geliştirilmiştir. Ayrıca, mevcut tedaviler sadece kısmen etkilidir ve nörodejeneratif bileşeni muhtemelen gelecekteki terapötik kullanımlar için önemli bir sorun ise esas olarak hastalığın enflamatuar aşamasını hedef 1,2 yaklaşır.

Hastalığın kesin hastalık sebepleri henüz açık iken, CNS'de aksonların miyelin kılıfının üzerinde bulunan epitoplara karşı bir otoimmün tepki, hastalığın başlangıcını kışkırtmak varsayılır. Bağışıklık sistemi, genetik yatkınlığın ve çevresel faktörler (örn. enfeksiyon, D vitamini) düzensizliği inanılmaktadırMS patofizyolojik mekanizmalarının etkisi merkezi yönleri.

Hayvan modellerinde üç farklı tipi şu anda MS patolojik modellerinin araştırılması için kurulan: Theiler kemirgen encephalomyelitis virüsü (TMEV) gibi viral modelleri, cuprizone gibi toksik ajanlar tarafından uyarılan modelleri ve deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) 3 nihayet farklı varyantları, 4. Hepsi MS özelliklerini taklit rağmen, adaptif bağışıklık sisteminin katılımı gibi temel patolojik özellikleri son derece farklıdır. Bu nöroenflamatuar yolları araştırmak için özellikle yararlıdır ve sık sık yeni tedavi stratejileri 5,6 etkinliği için bir "kanıtı ilkesi" bir model olarak hizmet olarak EAE en yaygın bir hayvan modelidir. EAE çok farklı hayvan (örneğin, fare, sıçan, miniswine, guinea domuz, tavuk veya primatlar) olarak indüklenebilir. Ancak, fareler, en azından kısmen nedeni, en yaygın kullanımı türler haline gelmiştirsofistike transgenik veya nakavt farelerin 7 repertuar genişleyen.

EAE patofizyolojisi Beyin spesifik antijenlere karşı bağışıklık sisteminin reaksiyona dayanır. Bu reaksiyon karşılaştırılabilir nörolojik ve patolojik özellikleri ile sonuçlanır, bu antijeni taşıyan yapıların iltihabı ve yok uyarmaktadır MS hastalarında gözlenen. Üç farklı yaklaşımlar ayırt edilebilir: Aktif kaynaklı EAE (a EAE, aktif bağışıklık kazandırma), otoimmün çalışma sağlar ve daha yakın zamanda kendiliğinden EAE fare modelleri (SEAE) pasif olarak transfer EAE, (bir bağışıklık kazandırılmış hayvandan ensefalitojenik hücre transferi pEAE) Eksojen manipülasyon olmayan mekanizmaları. En kolay indüklenebilir modeli hızlı ve sağlam sonuçlar elde farelerde a EAE olduğunu. Bu model alanda 8 birçok araştırmacı tarafından nöroimünolojik hayvan modelleri "altın standart" olarak kabul edilir.

A EAE indüksiyonu için, hayvanınSeçilen antijen içeren bir emülsiyon, bir deri altından enjeksiyon ile bağışıklı kılınmış ve aşılama gün ve iki gün sonra pertussis toksininin intraperitoneal bir enjeksiyonu ile birlikte Freund'un yardımcı maddeler (CFA) tamamlanır. Sonuç olarak, miyelin spesifik T lenfositlerin periferde aktif ve kan-beyin bariyeri boyunca merkezi sinir sistemi içine nüfuz edilir. CNS girmesinden sonra, T hücreleri, monositler veya makrofajlar ve sonunda demiyelinasyon ve aksonal hücre ölümü 9'daki gibi diğer inflamatuar hücrelerin daha sonraki kaskadlar katılımı ile sonuçlanan, yerel ve infiltre antijen sunan hücreler tarafından aktive edilir. Immünizasyon protokolü ve fare soyunun kombinasyonuna bağlı olarak (örneğin, C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) ve antijen (örneğin miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG), miyelin bazik protein (MBP), miyelin proteolipid protein (PLP)) hastalık Tabii akut, kronik, ilerleyici ya da nükseden remitting hastalık ders alabilir.

35-55 peptid 10 ile C57BL / 6 farelerin bağışıklama için bir protokol açıklar önümüzdeki 10-20 gün içinde. Tek başına MOG 35-55 peptidin immünojenik potansiyel hastalık oluşturmak için yeterli olmadığı için, bu gibi CFA gibi yardımcı maddeler gereklidir. Bu CFA bileşenleri, bu moleküllerin fagositoz ve sitokinlerin salgılanmasını uyaran mononükleer fagositler aktive olduğu varsayılmaktadır. Bu antijenlerin mevcudiyeti ve lenfatik sistem, bu daha verimli bir taşıma uzaması ile sonuçlanır. EAE indüksiyon diğerleri arasında modüle etmek üzere önerilmiştir pertussis toksin (PT) uygulanması kolaylaştırılmıştırKan-beyin bariyeri ve immünolojik yanıt kendisi 11. Hastalık indüksiyonundan sonra, özel bir dikkat hastalık belirtileri için farelerin her gün değerlendirme için alınmalıdır.

Protocol

Fare Deneyleri 1. Genel Yorumlar

  1. Fareler kullanan tüm deneyler ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi kurallarına uygun olarak yapılmalıdır.
  2. Patojen içermeyen koşullar altında farelerin Ol ve yiyecek ve su ad libitum erişmesini sağlayacak. Not: hastalığa yatkınlık, yaş ve cinsiyet ile değişebilir çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet eşleştirilmiş fareler kullanmak önemlidir.
  3. MOG 35-55 peptit antijen veya bir nonencephalitogenic peptitsiz şekilde PBS ile değiştirilmiş olduğu seçilmiş deneysel koşullara bağlı olarak, gerçek olmayan bağışıklık kazandırılmış kontrol grubu olarak kabul edilebilir.
  4. (Ayrıca aşağıya bakınız) öncesinde başlangıç ​​deneyleri metodolojik yönlerini düşünün lütfen. Biz EAE puanlama için bir ya da iki kör gözlemci dahil öneririz.

MOG 35-55 Emülsiyon 2. Hazırlanması

  1. MO bir 1:1 oranında, 200 ulG 35-55 peptit solüsyonu ve CFA her bir fareye enjekte edilmelidir. Hazırlanması ve enjekte ederken viskoz emülsiyon bazı kaybı vardır. Bu nedenle, gerekli olan miktarın 1,5-2x hazırlar. MOG 35-55 peptit solüsyonu ve CFA hem de ihtiyaç duyulan miktarlar için 2 ile emülsiyon ve bölünmenin toplam hacmi hesaplayın.
  2. 2 mg / ml 'lik bir son konsantrasyona GKD 2 O liyofilize MOG 35-55 seyreltin. Biz genellikle 200 mikrogram MOG fare başına 35-55 peptid kullanın. Bu miktar, stok çözeltisi 100 ul içinde ihtiva edilmektedir. Peptid solüsyonu -20 ° C 'de muhafaza edilmelidir
  3. Bir harç içine kurutulmuş Mycobacterium tuberculosis H37Ra (100 mg) 1 flakon içeriğini yerleştirin.
    1. Ince bir toz elde etmek için harç ve havan tokmağı ile zemin.
    2. 4 ° C 'de muhafaza edilebilir, 10 mg / ml CFA stok çözelti elde etmek için eksik Freund yardımcı madde 10 ml ekleme
    3. Bağışıklandırma öncesi, CFA stok solüsyon zekâ sulandırmak2 mg / ml 'lik bir son konsantrasyona h IFA. Parçacık malzemeyi tekrar süspansiyon ve deneysel hazırlıkları sırasında viskoz çözümün bazı hacim kaybını dikkate her kullanımdan önce iyice karıştırınız.
    4. 1 mg nihai konsantrasyonu / ml elde edilinceye kadar MOG 35-55 peptit çözeltisi ile 1:1 oranında karıştırınız.
      DİKKAT: Isı ile öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis doğuştan gelen bağışıklık tepkisini uyarır. Inhalasyon, yenmesi ve cilt ve gözlerle temastan kaçının.
  4. Buz üzerinde çözümleri önceden soğutmak.
    1. Iki adet 2 ml şırıngalar içine 1 2 mg / ml CFA ml ve 1 ml 2 mg / ml MOG 35-55 çözelti hazırlayın. Bağışıklık kazandırılmış hayvanların sayısına göre gerekli şırınga sayısını hesaplayın.
      DİKKAT: Kesinlikle bu granülomlara yol veya otoimmün reaksiyonlara neden olabilir gibi adjuvan hazırlanması sırasında dikiş kaçının.
    2. MOG 35-55 çözüm ve CFA için bir 20 G kanül için bir 27 G kanül kullanın. Hava kabarcıklarını önlemek ve en hem şırınga bağlamakhree yollu vana.
    3. Diğer bir şırıngadan emülsiyonu gönderme ve iyi emülsiyonlaştırma kritik bir adım olduğu için, en az 10 dakika boyunca iyice karıştırın. Emülsiyonlaşmasını desteklemek için üç yollu vana-yakın-kapatın. Çözelti, beyaz bir katı ve fazların Ayırmasız viskoz olmalıdır.
    4. Emülsiyon aşılamadan önce birkaç gün süreyle saklanabilir. Bu kararlı olup olmadığını incelemek için emülsiyonları hazırlamak sonra en az 30 dakika bekleyin. Bağışıklandırma öncesi, iki şırınga birine çözüm çizin ve 27 G kanül bağlayın.

Pertussis Toksin 3. Hazırlanması

  1. Pertussis toksin farklı miktarlarda tatbikat yoldan (örneğin damar içine ya da periton boşluğu içine) bağlıdır literatürde bulunabilir. Bizim laboratuar intraperitoneal bağışıklama gününde PBS içinde 200 ul pertussis toksin 400 ng kullanır ve iki gün sonra. DİKKAT: Pertussis toksini birçok biyolojik etkileri vardır. Soluma, yutma, deri ve göz temasından kaçının.
  2. 100 ug / ml stok çözeltisi için 500 ul GKD 2 O pertussis toksin 50 ug sulandırın. 4 ° C'de saklayın
  3. PBS ile 1:50 seyreltin. 200 ul PBS ile hemen 400 ng içerir. Şırınga gerekli miktarda hazırlayın ve her iğne hub için ~ 100 ul bir ek aşırı hacim düşünün.

4. Hayvan Bağışıklama

  1. Gerekli kısa vadeli ötenazi için belirli kriterler için kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi bakınız. Böyle ketamin / ksilizin enjeksiyon veya halotana gibi diğer protokoller de mümkün iken, bizim laboratuvar izofluran ile kısa uyuşturma kullanır. Anestezi için bekleyin ve anestezi düzeyini değerlendirmek için bir ön ayak ayak tutam kullanın.
  2. Aşılama hayvanlar için stresi en aza indirmek ve en uygun bağışıklama sağlamak için, deneyimli bir kişi tarafından yapılır emin olun.
  3. Anti enjekte 100 ulHer arka kanadında iki farklı sitelerin içine gen / CFA emülsiyonu deri altına. Deri altına, bir bombeli kütle form, deney boyunca devam gereken emin olun.
  4. Intraperitoneal pertussis toksin 200 ul enjekte edilir.
  5. Bireysel fareler kolayca kuyruk bazında renkli işaretler, örneğin, günlük değerlendirme için tespit edilebilir emin olun.
  6. Aşılamadan sonra iki gün pertussis toksin ikinci bir doz yönetmek.

5.. EAE İzleme

  1. Ağırlık ve klinik skor günlük değerlendirilmelidir. EAE başlangıcı tipik olarak hastalık aktivitesinin bir göstergesi olarak kullanılabilir kilo kaybı ile ilişkilidir. Kurumsal hayvan bakımı bakın ve bireysel fareler deneyler dışına alınması gereken zaman kriterleri önceden için komite kullanın. Kilo kaybı 20 başlangıçtaki vücut ağırlığının% veya zaman ciddi klinik belirtiler (EAE 7 ya da kötü puan) meydana aştığında bu dikkate alınmalıdır. Yeniden başvurunİzin verilen maksimum puanları için ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi retrospektif kurallar.
  2. Fareler EAE klinik belirtileri varsa, o su şişesi hala ulaşılabilir ve gıda kafes katta yer sağlamak için önemlidir.
  3. Farklı skorlama semptomlar kullanılabilir. Laboratuvarımızda 0-10 ölçek kurulmuştur.
Sınıf Klinik bulgu Yorum
0 Hiçbir klinik belirtiler Fare kuyruk üssünde tutulan eğer normal yürüyüş, kuyruk hareketleri ve yükseltilmiş olabilir, kuyruk yuvarlak bir nesnenin etrafına sarar
1 Kısmen gevşek kuyruk Normal yürüme, kuyruğun ucu droops
2 Felç kuyruk Normal yürüme, kuyruk droops
3 Arka bacakta parezi, koordinasyonsuzluk hareketi Koordinasyonsuzluk yürüyüş, kuyruk limps, arka ayakları sıkıştığı cevap
4 Felçli bir arka bacak Bir arka bacak sürükleyerek koordinasyonsuzluk yürüyüş, kuyruk limps, bir arka bacak çimdik yanıt vermiyor
5 Her iki arka ayakları felç Sürükleyerek her iki arka uzuvları ile koordinasyonsuzluk yürüyüş, kuyruk limps, hem de arka ayakları çimdik yanıt vermez
6 Hind bacaklarda felç, ön bacaklarında zayıflık Ön ayakları ile koordinasyonsuzluk yürüme sıkıştırdıktan sonra vücut, ön ayakları refleks çekmek için mücadele, kuyruk limps
7 Hind uzuvlar bir ön ayakları felç, felç Fare hareket edemez, bir ön ayakları ile ayak tutam, kuyruk limps yanıt
8 Hind uzuvlar hem ön ayakları felç, felç Fare hem ön ayakları ayak tutam yanıt vermez, hareket edemez, kuyruk limps
9 Can çekişen Hiçbir hareket, değişmiş nefes
10 Ölüm

Tablo 1. Klinik skorlama sistemi.

Representative Results

Immünizasyondan sonra, fareler ağırlığı ve klinik semptomlar değişiklikler için günlük olarak değerlendirilmelidir. Hastalık başlangıcı tipik EAE belirtiler görülebilir 1-2 gün önce başlayabilir ağırlığının bir azalma ile ilişkilidir. EAE Klinik belirtiler genellikle günde 9 ve 14 sonrası bağışıklama arasında başlar. Ağırlıklı olarak C57BL / 6 farelerinde MOG-EAE de omurilik lokalize olduğundan, bunlar genellikle rostral desenine bir kaudal ağırlıklı olarak motorik semptomlar geliştirir. EAE semptomları olan bir bağışıklık kazandırılmış fare örnek bir görüntü (6 puan) Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bazı atipik EAE belirtiler aynı zamanda eksenel-döner şekilde haddeleme olarak ortaya çıkabilecek, klasik EAE içinde değil yansıtılır kambur bir görünüm veya aşırı duyarlılık Tablo 1'de tasvir puanına. Motor belirtiler bu modelde temel özelliği olduğundan, bu skor bize veriyor hastalık şiddeti iyi bir göstergesidir. Farklı izleme sistemleri (örneğin 0 puan -Farklı açıkları değerlendirmek 5 veya 0-6) ve daha karmaşık kompozit puanları da yayınlanmıştır. Şiddetli semptomlar ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi göre deney dışına alınmalıdır olan farelerde unutmayınız. Fareler önümüzdeki 10-20 gün içinde belirtiler genellikle kısmi iyileşme göstermektedir. Temsili bir seyri Şekil 1B tasvir edilmiştir. Sonuç parametreleri değerlendirmek için ilgi çekici olan EAE sırasında farklı zaman noktaları vardır. Genellikle bulunabilir Bazı tipik tahlilleri çok kısaca açıklanmıştır. Hastalık en azından, farenin, in vitro olarak MOG 35-55 peptidi (MOG geri çekme deneyi) ile izole edilmiş immün hücrelerin yeniden güdülenmesinden sonra sitokin üretimi ve proliferasyonu için değerlendirilebilir. Bağışıklık hücreleri, EAE semptomları olan beyin ve omurilik farelerden izole edilmesi ve daha fazla işleme, akış sitometrisi ile, örneğin olabilir. Spinal kord bölümleri histolojik analiz hastalığı m yapılabilirlezyon yükü ve demiyelinizasyon için free donanımı, daha sonraki bir zamanda nörobozulmalar ve nöronal hücre ölümü için işaretleri işaret ederken ilgi çekici olabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Örnek EAE sonuçlanır. 30 gün boyunca aşılamadan sonra EAE belirtileri olan bir bağışık C57BL / 6 fare A. Temsilcisi resim (EAE 6 puan). B. Örnek seyri. Veriler ortalama ve ortalamanın standart hatası olarak gösterilmiştir (n = 5). resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Etkin bağışıklık kazandırma protokolleri ile farklı EAE modelleri bir çokluk, son on yıl içinde tarif edilmiştir. Sıçan modelleri yaygın olarak yakın zamana kadar kullanılmış olsa da, fareler şimdi EAE araştırma için en popüler model organizma vardır. Bu gelişme, mevcut transgenik farelerin, geniş ve artan repertuarına diğerleri arasında yer almaktadır. MOG 35-55 peptidi ile C57BL / 6 farelerinin immünizasyonu, en yaygın olarak dağıtılan EAE modelleri biridir ve güvenilir, yinelenebilir ve iyi kullanımlı bir hayvan modeli olarak kabul edilebilir. Diğer EAE modelleri daha spesifik deneysel sorular için kullanılır ise çok nöroimünolojik laboratuvarlarda, MOG 35-55 uyarılan EAE seçim modeli olarak kurulmuştur.

Dikkate kritik bir nokta EAE deneyleri metodolojik doğru yapılmaktadır sağlamak için deneysel ayarları planlıyor. Iç geçerliği için, hastalık belirtileri kör puanlama şiddetle tavsiye edilir. Experimental grupları olmalıdır yaş, ağırlık-ve cinsiyet eşleştirilmiş ve fareler, tedavi gruplarına rastgele tahsis edilmelidir. Deneyler her zaman hayvan refahı düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. EAE çalışmalar genellikle yeterince güçlü ve dikkate istatistiksel tip II hataları yapmayız. Bu nedenle, önceki deney için, örnek büyüklüğü hesaplamalar yapılmalıdır. Gerekli grup boyutları beklenen etkisi boyutuna bağlıdır. İstatistiksel analiz için bir uzman danışma EAE deneyler başlamadan önce düşünülebilir.

Protokolün bazı sınırlamaları göz önünde tutulması gerekir. En önemlisi, a EAE verilerin yorumlanması immünolojik reaksiyonu hem de ek bir etkiye sahip katkı maddesi ve pertussis toksininin kullanımı ile bağışıklık modu tarafından ele almaktadır. Ayrıca MOG 35-55 EAE modeli esas olarak bağışıklık tepkisi tahrik edilen bir CD4 + T hücre gösterir dikkate alınmalıdır. CD8 + T hücreleri ve B hücreleri oynamakBu hücre tipleri ele alırken, daha az önemli rolü ve, alternatif protokoller düşünülmelidir. Beklenen hastalık seyri, akut monofazik ve kendi kendini sınırlar. Seçenek olarak ise, bir nüks-remisyon seyri de, alternatif EAE modellerinde elde edilebilir. Protokolün bir diğer önemli kısıtlılığı MS patofizyolojinin immünolojik bileşeni karşı belirli bir önyargı olduğunu. Son yıllarda, MS güçlü bir nörodejeneratif bileşeni olduğu giderek daha açık hale gelmiştir. Nörolojik açıklarının ilerici birikimi oligodentrositler ve nöronlar sonuçları ölümü. Bu EAE modeli tam otoimmun inflamasyonu nörodejeneratif mekanizmaları ile ilgili deney soruları için uygun olmayabilir dikkate alınmalıdır. CNS patoloji odaklanarak alternatif hayvan modeller düşünülebilir - çevresel bağışıklık sisteminin tutulumu olmaksızın toksik demiyelinizasyonu ödün cuprizone modeli örneğin.

Açıklanan protokol, temel nöroimmünolojik deneysel model olarak ve diğer uygulamalar için modifiye edilebilir. Yukarıda tarif edilen deney prosedürü, kolayca değişen farenin suşlar diğer EAE protokoller uygulanabilir ya da türü ve miktarı, protein (örn., terapötik değerlendirilmesi için özellikle uygun olan bir nüks-remisyon EAE, hastalığın seyri için PLP 139-151 peptidi ve SJL mice kullanımı nükslerin üzerindeki etkileri). Açıklanan protokol, adoptif transfer deneyleri (pasif EAE) için kullanılabilir. Bu modelde, C57BL / 6 fareleri MOG 35-55 peptit ve yukarıda tarif edildiği gibi CFA ile bağışık hale getirilir. Bunun aksine, pertussis toksin gerekli değildir. 7-15 gün, dalak ve lenf düğümleri izole edilir ve bağışıklık hücreleri C57BL/6se farelerin yeni bir grup içine aktarmak için önce MOG 35-55 peptidi ve çeşitli sitokinler ile in vitro yeniden uyarılmıştır sonra. Bu alıcı fareler birkaç gün önce CLAS üzerine daha EAE geliştirmekSical aşılama. In vitro koşullarda, belirli immünolojik soru için (T H 1, H ya da T 17 hücrelerine, örneğin polarizasyon) değiştirilebilir.

Bazen, düşük hastalık insidansı veya zayıf semptomlar deneysel bir meydan okuma olabilir. Sorun giderme için bazı öneriler şunlardır:

- Hastalık şiddeti peptid / fare farklı miktarları ile çeşitlendirilebilir.

- Optimal CFA konsantrasyon 1-5 mg / ml arasında değişebilir. Deneyler kurarken CFA titrasyonu düşünün. Gibi birçok düzenlemeler 2 mg / ml aşan CFA konsantrasyonlarını korusun izin CFA konsantrasyonları için ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi ilgili uyarılara dikkat ediniz.

- Farklı yöntemler emülsiyonun hazırlanması için tarif edilmektedir. Zayıf emülsiyon possib olarak kabul edilir, örneğin 1 saat veya sonikasyon için girdap gibi alternatif yöntemler düşünülebilirle hata kaynağı.

- Yaş, cinsiyet, yıl ve hayvan tesis içindeki çevre koşulları sezon EAE duyarlılığını etkileyen önemli faktörlerdir. Bu koşullar, bağımsız deneyler arasında karşılaştırılabilir olması sağlanmalıdır.

Yukarıda tarif edildiği gibi, söz konusu protokol adoptif EAE deneyleri için başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. Bu model, özellikle (vahşi tip alıcı farelere ensefalitojenik knockout hücre aktarımı ile) genetik bir fenotip periferik ve merkezi sinir sistemi etkileri ayırmak için ve aktarılan hücrelerin fenotipi iyice karakterize edilebilir gibi belirli immünolojik soru için uygundur. Son yıllarda EAE araştırma son gelişme T hücre reseptör transgenik fareler vardır. Bu fareler dış etki adjuvan aşılama sorunu engellemeyi olmadan kendiliğinden EAE belirtiler gelişir. Ancak, bu model breedi için hayvanların büyük miktarlarda gerektirirYeterli grup boyutları sağlamak ng. Knockout farelerde değerlendirilmesi önce a EAE aksine EAE deneyleri için melezleme gerektirir. Her bir fare, farklı bir günde hastalık semptomlarını geliştikçe, yeni maddelerin değerlendirilmesi oldukça karmaşık olabilir. Bu nedenle, nöroimünolojik için klasik EAE değeri tartışmasız kalır.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgements

Bu çalışma Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi (IZKF) Münster (TOHUM 12/3, SB) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats