Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dendritiske celler (DC'er) udskiller IL-1β som reaktion på TLR8 anerkendelse af syntetisk purin, R848, efterfulgt af NLRP3 inflammasome aktivering med nigericin derfor IL-1β kan anvendes til at måle NLRP3 inflammasome aktivitet. Intracellulær cytokin farvning, immunoblotting og ELISA anvendes til præcist at måle NLRP3 inflammasome priming og aktivering via IL-1β udtryk.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fernandez, M. V., Miller, E. A., Bhardwaj, N. Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1β in Human Monocyte-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (87), e51284, doi:10.3791/51284 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inflammatoriske processer som følge af udskillelsen af Interleukin (IL) -1 familie cytokiner immunceller føre til lokal eller systemisk inflammation, vævsremodellering og reparation, og virologisk kontrol 1, 2. Interleukin-1β er et væsentligt element i den medfødte immunreaktion og bidrager til at fjerne invaderende patogener samtidig forhindre etableringen af vedvarende infektion 1-5.

Inflammasomes er nøglen signalering platform for aktivering af interleukin 1-omdannende enzym (ICE eller Caspase-1). NLRP3 inflammasome kræver mindst to signaler i udviklingslandene til at forårsage IL-1β sekretion 6. Pro-IL-1β-protein ekspression er begrænset i hvilende celler; derfor priming signal er påkrævet til transkription af IL-1β og proteinekspression. Et andet signal registreres af NLRP3 resulterer i dannelsen af ​​multi-protein NLRP3 inflammasome. Evnen af ​​dendritiske celler til ansvard til de signaler, der er nødvendige for IL-1β-sekretion kan testes ved hjælp af en syntetisk purin, R848, som afføles af TLR8 i human monocyt dendritiske celler (moDCs) for at prime celler, efterfulgt af aktivering af NLRP3 inflammasome med det bakterielle toksin og kalium ionofor, nigericin.

Monocytafledt DCer let produceres i kultur og give betydeligt flere celler end oprenset humant myeloide udviklingslandene. Metoden præsenteres her adskiller sig fra andre inflammasome assays i, at det bruger humane in vitro, i stedet for mus afledt, DCs således giver mulighed for studiet af inflammasome i human sygdom og infektion.

Introduction

Aktivering af medfødte immunsystem er nødvendig for at styre adaptive immunrespons under infektion, sygdom og vaccination 7.. Dendritiske celler er de mest potente antigenpræsenterende celler i det medfødte immunsystem; de er specialiseret til optagelse af antigener, migration til lymfeknuder, og aktivering af naive CD4 + og cytolytiske CD8 + T-celler 8-10. For at muliggøre hurtig afsløring patogen det medfødte immunsystem udnytter mange kimlinie kodet mønstergenkendelse receptorer (PRR), der genkender bevaret patogen afledte motiver eller værten afledte markører for celle stress og skader. Toll lignende receptorer (TLRs) er membranbundne mønstergenkendelse receptorer, der genkender visse ekstracellulære phagocytized patogen tilknyttede molekylære mønstre (PAMPs) og fare forbundet molekylære mønstre (dæmper). Derimod nik lignende receptorer (NLRs) er cytosol og reagere på en bred vifte af PAMPs og dæmper. Nik lignende receptorer refremlægge en anden linje i forsvaret mod patogener, der unddrage celleoverfladen og endocytiske PRRs. Samspillet mellem patogen afledt eller "fare" i forbindelse faktorer med TLR og NLR ligander fører til en tilstand af DC-modning resulterer i øget DC samspil med andre immunceller og fremme af T-celle-og killer celle aktivering 11 naturlige.

Interleukin-1β er en afgørende komponent i værtens forsvar mod infektion. Ved anerkendelse af en mikroorganisme, det stærkt proinflammatorisk cytokin, IL-1β secerneres og fungerer som et kemo lokkemidler og aktivator af medfødte og adaptive immunceller. In vivo IL-1β er hovedansvarlig for den akutfaserespons herunder feber og inflammatoriske cytokin syntese 12..

De fleste NLRs indeholde en C-terminale leucin rich repeat domæne, der menes at fungere i ligand sensing, en central nukleotid bindingsdomæne (NACHT), som er indførtant for NLRP3 oligomerisering, og en N-terminal effektordomæne (PYD i NLRP3), der medierer signaltransduktion downstream mål gennem protein protein interaktioner. NLRP3 protein definerer mest intenst studerede inflammasome kompleks. Dette protein er et medlem af NLR familien og har evnen til at danne en multi molekylær proteinkompleks består af NLRP3 adapteren protein PYCARD (også kendt som ASC) og ICE. Ved inflammasome aktivering PYCARD binder til NLRP3 N-terminale domæner og rekrutterer ICE via caspaseaktivering og rekruttering domæne (CARD) domæner. Interleukin-1-omdannende enzym indledningsvis genereres som et zymogen indeholdende en CARD motiv ved dets N-terminale ende. Inflammasome dannelse resulterer i at bringe to ICE molekyler tilstrækkelig tæt til at fremkalde deres autokatalytisk aktivering. Inflammasome kompleks er nødvendig for at aktivere ICE hvilket gør det muligt at omdanne cytoplasmisk pro-IL-1β til moden cytokin.

Vellykket sekretion af IL-1β i udviklingslandene kræver sensing af to forskellige og uafhængige faresignaler. Først TLR sensing af PAMPs, dæmper eller cytokin signalering (TNFa eller IL-1β) forårsager en opregulering af cytoplasmisk pro-IL-1β-protein-ekspression. Der kræves en anden, ofte anderledes, signal for inflammasome kompleks dannelse opstrøms af ICE modning. Et par inflammasome stimulerende signaler omfatter bakteriemembran poredannende toksiner (såsom nigericin), lysosomale forstyrre krystaller (såsom mononatrium uratkrystaller, MSU) og ekstracellulær ATP. Den opstrøms mekanisme, der fører til NLRP3 inflammasome aktivering af disse forskellige aktivatorer er uklar. Undersøgelser af signalering opstrøms inflammasome dannelse foreslår, at intracellulære begivenheder, såsom induktion af hypokaliæmi eller reaktive ilt arter (ROS) indirekte aktivere inflammasome 13-28.

Blandt de forskellige virale aktivatorer af NLRP3 inflammasome er influenza, som giver bAn den primære og sekundære signal kræves for IL-1β sekretion 3, 29-33. Brug af mus NLRP3 knockout modeller blev det fundet, at IL-1β-sekretion i DC'er er NLRP3 afhængig 32. Derudover NLRP3 knockout-mus tiltrak færre leukocytter til stedet for infektion og oplevet højere dødelighed 2, 5. To nylige papirer foreslå en mekanisme til NLRP3 inflammasome aktivering under Influenza virus infektion; første priming gennem anerkendelse af viral RNA ved TLR7 eller TLR8 (afhængigt TLR ekspression af den responderende celle) eller ved detektering af kommensale bakterier af andre TLRs at inducere cytoplasmatisk pro-IL-1β ekspression, efterfulgt af et andet signal, aktivering af NLRP3 inflammasome dannelse af viral ionkanalproteinet M2 på det transeuropæiske Golgi netværket 33, 34. I sidstnævnte trin, der udløser den NLRP3 inflammasome opnås ved forstyrrelse af den intracellulære ioniske <em> miljø, der fører til produktionen af ROS, hvilket er simpelthen, afføles af NLPR3 som et signal til at danne inflammasome. Men den præcise mekanisme af inflammasome aktivering opstrøms af ICE aktivitet under Influenza infektion stadig uklart.

Dette arbejde beskriver en teknik værdifuld til at studere NLRP3 inflammasome i menneskelige moDCs, der kan bruges som et fundament for yderligere undersøgelse af vejen bag DC baseret IL-1β sekretion som respons på TLR8 ligatur med R848 efterfulgt af aktivering af inflammasome ved et godt kendt aktivator af NLRP3, nigericin. Variationer af denne fremgangsmåde kan anvendes med andre celletyper, herunder, men ikke begrænset til: monocytter, makrofager, andre DC delmængder og epitelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Statement: Forskning prøverne tages og opbevares til forskning med donorernes samtykke. Alle prøver skal kodes eller anonymiseret før brug. Denne protokol følger retningslinjerne i vores Institutional Review Board.

1.. Differentiering af humane perifere blod-Monocyter i monocytafledt dendritiske celler.

Bemærk: Menneske buffy coats tjene som kilde til humane perifere blodceller (PBMC'er) og blev opnået fra New York Blood Center (New York, NY). Bloddonorer er raske frivillige. 5 dag procedure begynder med udpladning af humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) på vævskulturkolber 35,36. Bemærkelsesværdige forskelle fra de offentliggjorte protokoller er følgende:

  1. Brug 225 cm 2 ikke pyrogene polystyren vævskulturkolber med et filter hætte til at klæbe i alt 2x10 8 PBMC'er per kolbe i stedet for 10 cm polystyren vævskulturplades (58 cm2) (trin 1).
  2. Forbered medier med 5% pooled human serum (PHS; 30 ml) i 500 ml RPMI-1640 + L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES-buffer, og 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicin (5% PHS medier) efterfulgt af filtrering gennem et 20 um filter. Tilføj alt 50 ml 5% PHS medier pr 225 cm2 vævsdyrkningskolbe.
  3. Vask levet celler tre gange med 25 ml frisk RPMI-1640. Ryst kraftigt i 5 sek i hver vask og aspirér ikke adhærente celler (trin 4).
  4. Tilføj 190 pi 400 IE / ul IL-4 og 380 pi 100 IE / ul GM-CSF per kolbe (trin 3) på dag 0, 2 og 4.. Dag 0 er defineret som dagen PBMC'er oprindeligt er belagt i trin 1 (trin 8).
  5. Harvest dag 5 moDCs ved en koncentration på 1x10 6 celler / ml (trin 15).
  6. Brug moDCs straks i deres hviletilstand. Trin 17-22 er aldrig udført. Bemærk: Prøver skal behandles så hurtigt som muligt efter samling for de bedste resultater.
  7. Alikvote moDCs på en fusionning af 2x10 5 celler / brønd (200 ul / brønd af 1x10 6 celler / ml) i en 96 brønds rundbundet plade (western blot, ELISA, FACS) eller på en poly-L-lysin behandlet chamberslide (mikroskopi) til eksperimenter . Bemærk: Der er mindst fire betingelser: Helt ustimuleret (negativ kontrol), priming kun kun aktivering og priming efterfulgt af aktivering. Betingelser kan udvides til at omfatte kontrol solvens til R848 og nigericin hvis det ønskes. Hvis downstream-analysen er ICS, er det nødvendigt dubletter for isotypekontroller.

. 2. Klargøring af Inflammasome - Signal 1

  1. Opløs frysetørret R848 i DMSO i henhold til producentens anvisninger. Fortynd arbejder lager ved RT med RPMI-1640.
  2. Tilføj R848 på en 10 uM slutkoncentration til passende brønde til 18 timer. Placer celler i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.

3. Aktivering NLRP3 Inflammasome -. Signal2

  1. Opløs lyofiliseret nigericin i ethanol i henhold til producentens anvisninger. Fortynd arbejder lager ved RT med RPMI-1640 før du tilføjer til de rette betingelser.
  2. Tilføj Nigericinet på en 20 uM slutkoncentration og vende tilbage til inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 6 timer. Ingen vasketrin opstår mellem priming og under aktivering. Bemærk: Sekretion af IL-1β forøges ved tilstedeværelsen af calciumionoforer, Brefeldin A, monensin, dinitrophenol eller carbonyl cyanid chlorphenylhydrazon 37, 38. Derfor er tilsætning af disse sekretoriske hæmmere frarådes, når man analyserer inflammasome priming eller aktivitet, da det vil ændre sekretion af IL-1β.

4.. IL-1SS Prøvetagning

  1. Centrifugér pladen med celler og supernatanter ved 974 x g i 3 min.
  2. Uden at forstyrre cellepelleten, aspireres supernatanten og overføres til someparate rundbundet plade med henblik på at måle cytokinsekretion fra supernatanterne. Bemærk: Supernatanter kan midlertidigt opbevares ved -20 ° C eller -80 ° C til langtidsopbevaring.
  3. Vask de cellulære pellets tre gange med 200 pi 1x PBS ved 974 x g i 3 minutter for at fjerne eventuelle ekstracellulære IL-1β fra celleprøver. Bemærk: Når du vasker cellepellets fra en plade med 96 brønde, skal du fjerne vask ved hurtig plade inversion i en samling bin så ikke forstyrre prøven.

5.. Måling IL-1SS Fra Cellulær og supernatantprøver

  1. Intracellulær cytokin farvning (ICS): ICS Protokollen er beskrevet under 39, 40. Bemærk: Du må ikke suspendere cellerne hvis downstream-analysen er mikroskopi. Alle vasker og ambitioner bør ske uden at forstyrre cellelag / pellet (afhængigt af downstream assay).
    1. Tilsæt 100 ul 5% PHS medier i passende brønde. Tilføjpassende mængde (ca. 1 μl/2x10 5-celler eller 1 ul / brønd) af fluorescensmærket α-CD11c og α-CD14 (fænotype-markører, klon B-Ly6 og MφP9, henholdsvis) eller isotypekontrol til cellerne i 10 minutter ved RT i mørke.
    2. Vask tre gange med 1x PBS ved 974 xg i 3 min.
    3. Fikseres cellerne ved tilsætning af 100 pi 4% PFA for 20 min ved stuetemperatur i mørke.
    4. Pause Point: Vask med 100 ul 1x PBS ved 974 xg i 3 min og opbevares ved 4 ° CO / N i 1x PBS.
    5. Tilsæt 100 pi permeabilisering puffer til celler i 30 minutter. Bemærk: permeabilisering buffer består af 1x PBS med 0,3% Triton X-100 og 1% bovint serumalbumin (BSA) i permeabilisering. Forstyr ikke vedhængende celler, når downstream-analysen er mikroskopi.
    6. Tilsæt egnet volumen (ca. 62 ng antibody/2x10 5-celler, ca eller 2,5 ul / brønd) af α-IL-1β-FITC (klon 8516) eller isotypekontrol til2 hr i en inkubator ved 37 ° C.
    7. Vask cellerne tre gange med 200 pi permeabilization buffer ved 974 x g i 3 minutter i mørke.
    8. Valgfrit: Stain med DAPI, tilføje mountant, og læg dækglas forsigtigt oven på en glasplade. Tillad effekt til at helbrede O / N inden optagelsen mikroskopi billeder.
    9. Erhverve data ved FACS eller mikroskopi. Bemærk: Sammenlign isotype for hver tilstand til den passende farvning, når man analyserer ved FACS eller mikroskopi.
      1. FAC: Acquire én prøve ad gangen. Sæt FSC / SSC gate på de levende celler, efterfulgt af gating på CD11c + CD14 - celler, før analysere moDC befolkning pro-IL-1β farvning.
      2. Mikroskopi: Indstil eksponeringen tid ved hjælp af positiv farvning prøve - R848 behandles. Brug DAPI + pro-IL-1β + og DAPI + pro-IL-1β - at bestemme procentdel af pro-IL-1β + udtrykker moDCs.
  2. SDS-Side: Immunoblotting er udført for at påvise pro-IL-1β. Bemærk: Teknikken beskrevet nedenfor kombinerer standard immunblotting teknik, gradient 4-20% polyacrylamidgel, og fluorescerende eller kemiluminescerende detektion 41, 42.
    1. Lyserer celler direkte i 10 pi denaturerende lysisbuffer (5 pi β-mercaptoethanol/950 pi Laemmli prøvepuffer efterfulgt af fortynding 1:1 med cellelyse-buffer). Overfør lysatet til 1,5 ml Eppendorf-rør.
    2. Heat lysat på en tør plade i 10 minutter ved 100 ° C.
    3. Spin lysat ved 20.800 xg på en minicentrifuge i 1 min at koncentrere flydende volumen. Pause punkt: prøver kan fryses ved -20 ° C til kortvarig opbevaring.
    4. Indlæse det samlede volumen på polyacrylamidgel. Kør 140 V gennem gelen boks til cirka 1 time, eller indtil farvefronten løber fra bunden af ​​gelen.
    5. Overførsel af proteinet fra polyacrylamidgel på en PVDF Immobilon-FL Membrane i 90 minutter ved 100 V. Block membranen med 5% BSA i Tris-saltvand / 0,1% Tween-20 (TBS-T) i 1 time. Bemærk: PVDF Immobilon FL er bedst til brug med fluorescerende detektion. Der anbefales en membran med en anden sammensætning til andre detektionsteknikker til at øge signal baggrund ratio.
    6. Fortyndet primære og sekundære antistoffer i 10 ml 5% BSA / TBS-T. Udfør primære antistofinkubationer ved 4 ° CO / N under omrystning og sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time under omrystning.
    7. Vask membranen 3 gange med TBS-T i 5 min under omrystning mellem primære og sekundære antistofinkubationer og igen mellem sekundære inkuberinger og billeddannelse. Bemærk: Bands kan detekteres med fluorescerende eller kemiluminescerende detektion. Følg producentens anvisninger for detektion.
  3. ELISA: Prøver, der er fastfrosset til opbevaring nødt til at afbalancere til RT før analysen. Spin ned prøver i en centrifuge til at konsolidere supernatantproteiner kondenserendeation. Følg producentens anvisninger for måling af IL-1β. Bemærk: I denne protokol IL-1β er specifikt målt; dog samtidig måling af TNFa, IL-6 og immunmodulerende cytokin IL-10 sikrer passende betingelser blev primet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse teknikker måler TLR8 priming med R848. Intracellulær cytokin farvning for pro-IL-1β giver mulighed for mikroskopi og FACS udlæsninger fra CD14 - CD11c + moDCs. Begge teknikker kan kvantificeres i forhold til en ikke-primet eller hvile, cellekontrol samt en isotypekontrol (figur 1 og 2). Procent af pro-IL-1β + farvning af celler multipliceres med den geometriske medianen af denne population for at give den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI). MFI kan sammenlignes med mængden af ​​pro-IL-1β til stede i de positive farvning af celler.

Immunoblotting foranstaltninger pro-IL-1β fra cellelysat, som derefter kvantificeres i forhold til en intern cellulære kontrol, såsom β-tubulin eller β-actin (figur 3). Immunoblotting for pro-IL-1β i nigericin behandlede celler vil vise en nedgang i pro-IL-1β. Dette suppleres af ensamtidig forøgelse i IL-1β i supernatanter, målt ved ELISA, kun R848 efterfulgt af nigericin betingelser (figur 3 og 4). Alle andre betingelser bør resultere i nogen ekstracellulære IL-1β til stede. Samtidig måling af andre inflammatoriske cytokiner, såsom TNFa, IL-10 og IL-6, sikre, at nigericin er specifik i forårsager sekretion af IL-1β. Graden af priming tid (Figur 3) og dosis (figur 4) afhængige, en reaktion afspejles i graden af intracellulært pro-IL-1β i R848 grundes og ekstracellulære IL-1β (såvel som TNFa, IL-10, og IL-6)-sekretion i alle R848 behandlede betingelser (figur 4).

Figur 1
Figur 1. Cytoplasmatisk pro-IL-1β detekteres ved f lav cytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2.. Cytoplasmatisk pro-IL-1β er opdaget af mikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Fig. 3. Cytoplasmatisk pro-IL-1β påvises ved SDS-PAGE.res.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. Secreted IL-1β detekteres ved ELISA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Inflammatoriske cytokiner er integreret i styringen af ​​medfødte og adaptive immunrespons til at bekæmpe virusinfektion. Udskilt IL-1β har vist sig at stige i løbet af influenza-infektion, 3, 43, 44. De præcise mekanismer, hvormed disse cytokiner behandles som reaktion på viral anerkendelse humane dendritiske celler er ikke fuldt forstået. Myeloide DC isolation kits er dyrt og tidskrævende. Isolation kits og FAC sortering kan utilsigtet stress eller aktivere cellerne. Derudover er der ofte utilstrækkelig mængde af isolerede celler til eksperimenter. Heldigvis, biologi menneskelige moDCs tæt modeller der af primære humane myeloide DCer in vitro 45, 46. Begge celletyper kræver to signaler, TLR priming og NLRP3 aktiverende, for at opnå moden IL-1β-sekretion. Derfor moDCs levere og overkommelige og enkel DC model celletype at studere og væddemålter forstå relevansen og rolle NLRP3 inflammasome i menneskers sundhed og sygdom.

Påvisning af IL-1β under anvendelse af de her beskrevne metoder giver forskellige enkle og effektive immunassays til at studere sygdomme med inflammatorisk forbundet patologier, herunder virale RNA-infektion; specifikt, hvordan man kan måle IL-1β i en række forskellige måder som respons på R848 og nigericin stimulering. Andre TLR agonister (såsom poly (I: C) og LPS) og NLRP3 inflammasome aktivatorer (såsom ATP og MSU) kan anvendes til at måle denne aktivitet ved stimulering i forbindelse med andre sygdomstilstande patologier; kan dog være nødvendigt at justere stimulation og-forhold. Reagens eksponering gange og koncentrationer vil også skulle justeres, når ændre denne protokol til brug i andre celletyper og arter.

Alle betingelser skal køres i tre eksemplarer og svaret vejes omhyggeligt for kvalitetskontrol; det er fælles forstor donor variation at eksistere. Monocytderiverede DC'er er en celletype, ikke en cellelinie, og heterogenitet findes inden for en moDC kultur.

Priming kan bekræftes med ICS til pro-IL-1β og sammenligne hvilende moDCs til R848-primet tilstand. Resting moDCs ikke bør resultere i positiv farvning. Priming kan også valideres ved immunoblotting til ekspression af pro-IL-1β. Vellykket R848 priming resulterer i sekretion af proinflammatoriske cytokiner TNFa, IL-6 og immunmodulerende cytokin IL-10 med minimal sekretion af IL-1β. Inflammasome aktiverede celler ikke viser en yderligere stigning i TNFa, IL-6 og IL-10-sekretion, men vil have en stigning i secernerede IL-1β koncentrationer i forhold til aktiverede celler.

Pro-IL-1β kan passivt frigives under nekrotisk celledød derfor biotilgængelighed assays kunne være af interesse. Alternativt kan immunoblotting udføres på supernatants at bestemme molekylvægten af ​​secerneret IL-1β til at sikre aktiv IL-1β er den form af cytokinet secerneret; modent IL-1β er 17 kDa mens forstadiet er 31 kDa. Til måling af IL-1β fra supernatanter vil cellekoncentration skulle justeres for at opnå et positivt signal over detektionsgrænsen. Caspase-1-aktivering kan også måles via en række forskellige metoder til at bestemme inflammasome aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter til at videregive.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., og Meagan O'Brien, MD for deres støtte og feedback. Denne forskning blev støttet af National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme og afsluttes med støtte fra NIH giver Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards for Individuelle Predoctoral stipendier (F31) for at fremme mangfoldighed i sundhedsrelateret forskning (AI089030) og RO1 (AI081848 ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IL-4 R&D
GM-CSF Genzyme NDC 58468-0180-2 We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine Cellgro 10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells New York Blood Center PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates Sigma-Aldrich 3516
96 well round bottom tissue culture plates Sigma-Aldrich 3799
α-IL-1β-FITC R&D IC201F
FITC isotype control Miltenyi Biotec 130-092-213
α-β-Tubulin Santa Cruz SC-9014
α-IL-1β R&D mab201
PVDF Immobilon-FL membrane Millipore IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel Bio Rad 161-1159
Laemmli sample buffer Bio Rad 161-0737
BSA Equitech Bio Inc 30% solution sterile/filtered
PFA Electron Microscopy Sciences 15710 16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit BD 551811
Nigericin Invivogen tlrl-nig
R848 3M Corp.
α-CD14 BD 340436
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
TBS On site stock room
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs Thermo Scientific 159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units Thermo Scientific 569-0020
HEPES Invitrogen 15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW Licor 926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD Licor 926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder Thermo Scientific 26634
Tris Glycine SDS 10x Bio Rad 1610732
Tris Glycine 10x Bio Rad 161-0734
Methanol - 4 L Fisher Scientific A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide BD Falcon 354108
Poly-L-Lysine Sigma P4707

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
  2. Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
  3. Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
  4. Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
  5. Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
  6. Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
  7. Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. (2013).
  8. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
  9. Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
  10. Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
  11. Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
  12. Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
  13. Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
  14. Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
  15. Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
  16. Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. (2012).
  17. Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
  19. Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  20. Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
  21. Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
  22. Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
  23. Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
  24. Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
  25. Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
  26. Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
  27. Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
  28. Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
  29. Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
  30. Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
  31. Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
  32. Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
  33. Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
  34. Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
  35. O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
  36. Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
  37. Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
  38. Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
  39. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
  40. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
  41. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
  42. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
  43. Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
  44. Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
  45. Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
  46. Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics