इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट विरोध Endothelial प्रसार, बाधा समारोह की मात्रा का ठहराव के लिए सेंसिंग, और गतिशीलता

1Department of Pulmonary Diseases, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, 2Department of Physiology, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center
Published 3/28/2014
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Bioengineering
 

Summary

इस प्रोटोकॉल इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट विरोध सेंसिंग, सेल लगाव, प्रसार, गतिशीलता, और औषधीय और विषाक्त उत्तेजनाओं को सेलुलर प्रतिक्रियाओं की मात्रा का ठहराव के लिए पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिबाधा स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड और विश्लेषण करने के लिए एक पद्धति की समीक्षा. Endothelial पारगम्यता और सेल सेल और सेल सब्सट्रेट संपर्कों के मूल्यांकन की जांच पर जोर दिया है.

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Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

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Abstract

इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट विरोध सेंसिंग (ECIS) पक्षपाती सेल परतों के भीतर कोशिकाओं के व्यवहार को यों तो एक में इन विट्रो प्रतिबाधा माप प्रणाली है. इस प्रयोजन के लिए कोशिकाओं का विरोध करते हुए परिपत्र सोने इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर विशेष संस्कृति कक्षों में बड़े हो रहे हैं. एक निरंतर छोटे बारी वर्तमान इलेक्ट्रोड और संभावित भर में मापा जाता है के बीच लागू किया जाता है. कोशिका झिल्ली की इन्सुलेट गुणों इलेक्ट्रोड के बीच एक वृद्धि की विद्युत क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप विद्युत धारा प्रवाह की दिशा में एक प्रतिरोध पैदा करते हैं. इस तरीके में सेलुलर प्रतिबाधा मापने सेल लगाव, विकास, आकृति विज्ञान, समारोह, और गतिशीलता के स्वचालित अध्ययन की अनुमति देता है. ECIS माप ही सरल और जानने के लिए आसान है, अंतर्निहित सिद्धांत जटिल है और सही सेटिंग्स और सही विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के चयन स्वयं स्पष्ट नहीं है. फिर भी, एक स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक से अलग अलग चरणों का वर्णनतैयारी, अहसास, और प्रयोग के विश्लेषण के लिए डिजाइन उपलब्ध नहीं है. इस लेख बुनियादी माप सिद्धांत के साथ ही संभव अनुप्रयोगों में, प्रयोगात्मक विचार, फायदे और ECIS प्रणाली की सीमाओं चर्चा कर रहे हैं. एक गाइड के प्रसार और प्रसार, सेल लगाव के अध्ययन के लिए प्रदान की जाती है; बाधा समारोह, सेल गतिशीलता, सेल सेल और सेल सब्सट्रेट adhesions की गुणवत्ता के संबंध में एक मिला हुआ परत में सेल व्यवहार की मात्रा का ठहराव, और घाव भरने की मात्रा का ठहराव और vasoactive उत्तेजनाओं को सेलुलर प्रतिक्रियाओं. प्रतिनिधि परिणाम मानव microvascular (MVEC) और मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के आधार पर चर्चा की, लेकिन सभी अनुयायी बढ़ कोशिकाओं को लागू कर रहे हैं.

Introduction

ΩΩΩHere हम ECIS, संस्कृति 1 में पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिबाधा स्पेक्ट्रम उपाय और विश्लेषण करने के लिए एक विशिष्ट पद्धति के रूप में जाना जाता इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट विरोध सेंसिंग, उपस्थित थे. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रतिबाधा आधारित सेलुलर assays के इस विशेष प्रकार के उपयोग के लिए एक आम तौर पर लागू मार्गदर्शन प्रदान करते हैं और आवेदनों की लगातार बढ़ती संख्या से महत्वपूर्ण कार्यों में से कुछ के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करना है. फोकस सेल प्रसार, बाधा समारोह, सेल जंक्शनों, और सेल गतिशीलता के अध्ययन पर किया जाएगा.

ECIS और जैविक रूप से प्रासंगिक मानकों में प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा को बदलने के लिए उसके संबंधित मॉडल 1991 2 में Giaever और Keese से वैज्ञानिक समुदाय के लिए अपने मौजूदा रूप में पेश किया गया था, यह अक्सर (ट्रांस तीर की माप के लिए एक प्रणाली के रूप में भेजा गया है सही नहीं है जो उपकला विद्युत प्रतिरोध),. मतभेद पहली बार में मामूली लगते हैं, लेकिनडेटा व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं. शास्त्रीय तीर माप के लिए, कोशिकाओं उपकला तंग जंक्शनों या endothelial adherens जंक्शनों 3 का प्रभुत्व है जो paracellular परिवहन तंत्र, चिह्नित करने के लिए पारगम्य फिल्टर पर हो रहे हैं. आमतौर पर, फिल्टर ऊपर और नीचे तैनात दो इलेक्ट्रोड एक प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) जिसके परिणामस्वरूप वोल्टेज ड्रॉप 4 को मापने के लिए सेल परत और दो ​​अन्य इलेक्ट्रोड पर प्रवाह को लागू करने के लिए उपयोग किया जाता है. विद्युत प्रतिरोध सेल बाधा की गुणवत्ता की एक संख्यात्मक विवरण देता है जो ओम कानून, उपयोग कर की गणना की जाती है.

ECIS इस बुनियादी सिद्धांत को मानता है और यह फैली हुई है. ECIS प्रणाली में, कोशिकाओं विशेष सेल संस्कृति बर्तन के तल में एम्बेडेड रहे हैं कि विरोध, परिपत्र सोने इलेक्ट्रोड पर हो रहे हैं. संस्कृति के प्रति इलेक्ट्रोड की संख्या अच्छी तरह से चर, आवेदन पर निर्भर है और इलेक्ट्रोड 250 माइक्रोन का एक मानक व्यास है, कुछ मामलों में एक बड़ा काउंटर इलेक्ट्रोडसर्किट पूरा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ECIS बजाय एक प्रत्यक्ष वर्तमान का एक दिया आवृत्ति के साथ 1 μA के एक निरंतर बारी वर्तमान (एसी) का उपयोग करता है. प्रतिबाधा इलेक्ट्रोड के बीच (एम वी में) वोल्टेज में इसी परिवर्तन से गणना की है. ECIS तीर पर कई फायदे हैं और इस लेख में विस्तार से समझाया जाएगा जो आवृत्ति पर निर्भर सेलुलर गुण, अध्ययन करने के लिए आवृत्तियों की एक सीमा से अधिक प्रतिबाधा उपाय करने की संभावना प्रदान करता है. सबसे पहले, जटिल प्रतिबाधा मापने सेल बाधा प्रतिरोध और सेल समाई में समग्र प्रतिबाधा अलग करने की अनुमति देता है. इसके अलावा, कई आवृत्तियों पर डेटा ले रही है और एक गणितीय मॉडल को लागू करने से, एक सेल सब्सट्रेट बातचीत (अंतर्निहित मैट्रिक्स को बेसल सेल झिल्ली की दूरी) के रूप में अच्छी तरह से की वजह से junctional प्रतिबाधा (सेल सेल संपर्कों की जकड़न) और विरोध के बीच अंतर कर सकते हैं कोशिका झिल्ली समाई का योगदान. दूसरा, सेल प्रसार और गतिशीलता सेल के बाद से, मूल्यांकन किया जा सकताएस इलेक्ट्रोड के साथ सीधे संपर्क में हैं. तीसरा, सब्सट्रेट और इलेक्ट्रोड उज्ज्वल क्षेत्र और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से पतले होते हैं.

प्रतिबाधा माप का आधार: जटिल प्रतिबाधा

जैविक वस्तुओं (जैसे कोशिकाओं) की विद्युत प्रतिबाधा की माप के लिए आधार ओम कानून, प्रतिरोध (नि.) के बीच संबंध का वर्णन करता है जो एक बुनियादी विद्युत तकनीकी सिद्धांत, वर्तमान (मैं) और एक बिजली के सर्किट में वोल्टेज (यू) है एक निश्चित समय (टी) पर.
डीसी सर्किट में लागू: आर (टी) = यू (टी) / मैं (टी)

एसी सिस्टम में काम करते हैं, वर्तमान और वोल्टेज उनके आयाम में अलग है, लेकिन यह भी उनके चरण (φ) में न केवल. अब, प्रतिरोध अब इन संबंधों का वर्णन करने के लिए पर्याप्त है. इसके बजाय, जटिल प्रतिबाधा (जेड) या प्रतिबाधा के अधिकांश मामलों में परिमाण (जेड |) फिर से जो पहले वर्णित ohmic प्रतिरोध प्लस मुक़ाबला (एक्स), युक्त, उपयोग किया जाता हैएसी से sults capacitors और वोल्टेज और वर्तमान के बीच 5 चरण में बदलाव ड्राइविंग inductors के माध्यम से प्रवाह.
एसी सर्किट में लागू: | जेड (च) | = √ (नि. + 2 एक्स (च) 2)
φ = arctan (एक्स / आर)

उनके झिल्ली की विशेषताओं की वजह से कोशिकाओं बरकरार, पर प्रतिबाधा माप प्रदर्शन करते हैं, कोशिकाओं अवरोध और संधारित्र की एक समानांतर कनेक्शन के रूप में कार्य. समाई (सी) सेल के ध्रुवीकरण का कारण बनता है कि कोशिका झिल्ली के इन्सुलेट द्वि परत पर बिजली वाहकों की जुदाई का वर्णन करता है जबकि यहां, प्रतिरोध, वर्तमान प्रवाह के विरोध का प्रतिनिधित्व करता है. जिससे एक्स कोशिका झिल्ली के capacitive गुणों का बोलबाला है.
एक्स (च) ≈ (2 * बगुलाभगत * च * सी सेल) -1

एक्स आवृत्ति निर्भर है, माप आवृत्ति की भिन्नता सेल के विभिन्न कार्यात्मक और संरचनात्मक गुणों के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है. ECIS डिवाइस उपायों आर और एक्स, की अनुमति गणना दोनोंकी जेड |, सी और φ.

बिजली के बराबर सर्किट: विरोध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ पूरे सेल परतों बढ़ाता.

एक सेल एक बिजली के क्षेत्र में लाया जाता है, जब पहले से बताया गया है, यह निष्क्रिय इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के गुणों को दर्शाता है. अब, बजाय एक एकल कक्ष की, इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर हो और सेल संस्कृति माध्यम के साथ पूरक एक पूरे सेल परत की जांच की जाती है, तो संघर्ष और संधारित्र की साधारण मॉडल एक पूरी बिजली के नेटवर्क को बढ़ाया जाना चाहिए. इस तथाकथित बराबर सर्किट में, इलेक्ट्रोड / इलेक्ट्रोलाइट बातचीत निस्र्पक संस्कृति मध्यम (आर मेड) और साथ ही समाई (सी Electr) और प्रतिरोध (नि. Electr) के प्रतिरोध 3,6 विचार किया जाना चाहिए.

एक पक्षपाती बढ़ रही सेल परत के लिए इस तरह के एक बराबर सर्किट का एक सरल, सामान्य उदाहरण चित्र 1 में पाया जा सकता है. इस तरह के एक गणितीय एक का लाभएक जैविक प्रणाली का वर्णन करने के लिए pproach उन सर्किट यथेच्छ परिष्कृत और भीतर सेलुलर organelles की वजह से या सेल सेल के प्रभावों (नि. Junc) और सेल सब्सट्रेट adhesions भेद करने के लिए प्रतिबाधा पर विचार द्वारा जैसे विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल, समायोजित किया जा सकता है समग्र प्रतिबाधा 7,8 पर (नि. उप). फिर भी मॉडलिंग के लिए उद्देश्य हमेशा सार्थक सहसंबंध अनुमति देने के लिए मापा प्रतिबाधा स्पेक्ट्रम की सभी सुविधाओं का वर्णन तत्वों की छोटी संख्या का उपयोग करने के लिए होना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक पक्षपाती बढ़ कोशिकाओं की परत. ए) क्रॉस एक ECIS संस्कृति की धारा के लिए अच्छी तरह ECIS प्रणाली और प्रतिनिधि समकक्ष सर्किट के योजनाबद्ध. कोशिकाओं संवेदन और काउंटर इलेक्ट्रोड और एक के शीर्ष पर बढ़ रहे हैंफिर से संस्कृति के माध्यम से कवर किया. इलेक्ट्रोड एक ताला में एम्पलीफायर से जुड़े हैं और एक एसी संकेत एक निरंतर वर्तमान स्रोत बनाने के लिए एक 1 MΩ रोकनेवाला के माध्यम से लागू किया जाता है. उत्तेजनाओं समय में किसी भी बिंदु. बी) ECIS उपायों प्रतिबाधा के लिए सभी व्यक्तिगत योगदान की राशि पर संस्कृति के माध्यम से सीधे जोड़ा जा सकता है. एक रोकनेवाला (नि. Electr) और एक संधारित्र (सी Electr), और भी बिजली के गुणों का एक समानांतर संयोजन के रूप में प्रस्तुत सादगी के लिए है जो इलेक्ट्रोड / इलेक्ट्रोलाइट इंटरफेस है, की वजह से मध्यम संस्कृति (आर मेड) और साथ ही प्रतिबाधा के प्रतिरोध एक समानांतर प्रतिरोध का कनेक्शन (नि. सेल) और समाई (सी मेम) द्वारा वर्णित कोशिका झिल्ली, के, सब पर विचार करने की आवश्यकता है. यह वर्तमान की ओर सेल पारगम्यता पर निर्भर है के बाद से अनुसंधान सेल, चर रहा है. बराबर सर्किट बढ़ाया और यथेच्छ परिष्कृत किया जा सकता है. एक उदाहरण junctional (नि. Junc) के रूप मेंसाथ ही subendothelial (नि. उप) प्रतिरोध सर्किट से जोड़ा गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रतिबाधा मानकों और उनके जैविक अर्थ

प्रतिबाधा माप से निकाली गई दो सबसे सीधा मापदंडों प्रतिरोध और कोशिकाओं की समाई हैं. प्रतिरोध गुणवत्ता और सेल बाधा के समारोह का प्रतिनिधित्व करता है और इसलिए ध्यान में पैरा और पार सेलुलर वर्तमान प्रवाह की दिशा में प्रतिरोध लेता है. समाई इलेक्ट्रोड कवरेज की एक समग्र उपाय प्रदान करता है. ECIS की विशिष्ट सुविधा समकक्ष सर्किट की मदद और मॉडलिंग के साथ उन वैश्विक मानकों इस लेख में बाद में चर्चा की जाएगी जो सेल सेल और सेल सब्सट्रेट adhesions सहित कई सेलुलर गुण,, पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

प्रायोगिक conside: शुरू करने से पहलेराशन

मापन सेटअप - सेटअप कई अलग घटक होते हैं: माप इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ ECIS डिवाइस; -; ECIS सरणियों और पसंद के सेल संस्कृति, डाटा अधिग्रहण के लिए पीसी या 96 अच्छी तरह से सिस्टम 8 सरणी धारक. सरणी धारक एक इनक्यूबेटर में रखा जाता है और इनक्यूबेटर बाहर ECIS डिवाइस से जुड़ा होना चाहिए. पीसी ECIS सॉफ्टवेयर (1.2.123.0 14 फ़रवरी 2013) के साथ सुसज्जित और ECIS डिवाइस से कनेक्ट करने की जरूरत है.

ऐरे चयन - कई आवेदन के लिए बनाया गया ECIS सरणियों की एक लगातार बढ़ विविधता है. मानक सरणियों क्रमशः (ई द्वारा इंगित) 1 या 10 माप इलेक्ट्रोड, जिसमें (डब्ल्यू द्वारा इंगित) 8 संस्कृति कुओं से बना रहे हैं जो 8W1E और 8W10E सरणियों, कर रहे हैं. एक बड़ा काउंटर इलेक्ट्रोड सर्किट पूरा करता है, लेकिन इसके प्रतिबाधा वास्तविक माप 6 में अनिवार्य रूप से नगण्य है. मानक 8 अच्छी तरह से सरणी धारक होस्ट कर सकते हैं दो एकrrays, 16 संस्कृति कुओं की कुल संख्या में जिसके परिणामस्वरूप. सोने इलेक्ट्रोड 50 एनएम, मोटी एक इन्सुलेट फिल्म के साथ चित्रित और एक ऑप्टिकली स्पष्ट Lexan polycarbonate सब्सट्रेट या एक मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) या तो पर बढ़ रहे हैं. पीसीबी सरणियों और अधिक मजबूत हैं और कुशल लागत. पारदर्शी स्लाइड प्रकाश और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति देते हैं. क्या विचार किया जाना चाहिए 1E सरणी सेल गतियों के कारण प्रतिरोध संकेत में उतार चढ़ाव को बढ़ाता है और घाव भरने के अध्ययन के लिए आवश्यक है कि है. इसके अलावा, एक इलेक्ट्रोड बिजली और ऑप्टिकल संकेतों के सहसंबंध अनुमति देते हैं. बहु इलेक्ट्रोड सरणियों में संकेत की वजह से वृद्धि हुई माप क्षेत्र के लिए असमान टीका और कोशिकाओं के विकास से डेटा का पूर्वाग्रह सीमा और कारण सेल करने के लिए संकेत के धुंधला कम कर देता है, माप में अधिक कोशिकाओं शामिल है, जो कई इलेक्ट्रोड पर औसतन गतियों. इसलिए, बहु इलेक्ट्रोड सरणियों सेल प्रसार और बाधा गठन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. के पासमानक सरणियों विशेष chemotaxis 10 अध्ययन करने के लिए कतरनी तनाव 9 के आवेदन के लिए उपलब्ध सरणियों, सेल प्रवास, और प्रसार के साथ ही उच्च throughput प्रदर्शन के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें रहे हैं. समाप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सरणी वैज्ञानिक प्रश्न और सेल प्रकार दृढ़ता पर निर्भर है और चयनित और ध्यान से परीक्षण किया जाना चाहिए.

मापन आवृत्ति - आरबी और अल्फा के मॉडलिंग (डेटा विश्लेषण देखें) बहु आवृत्ति माप (MFT) की आवश्यकता है. अन्यथा प्रतिबाधा डेटा एक उच्च अस्थायी समाधान के साथ एकत्र किया जा सकता है कि लाभ के साथ, एक सेल प्रकार विशिष्ट आवृत्ति (एफ टी) पर समय के साथ मापा जा सकता है. एक विशेष सेल प्रकार के लिए सबसे ज्यादा संवेदनशील माप आवृत्ति आवृत्ति स्कैन से पाया जा सकता है. सेल मुक्त और सेल से ढके इलेक्ट्रोड सबसे बड़ी है के बीच का अंतर कोशिकाओं टी ब्लॉक जहां आवृत्ति है जहां एक लॉग लॉग ग्राफ आवृत्ति में आवृत्ति बनाम क्रमशः प्रतिरोध प्रतिबाधा साजिश रचने जबवह मौजूदा सबसे प्रभावी ढंग से. Endothelial कोशिकाओं (ईसी) के मामले में यह आवृत्ति के बारे में 4 kHz पर है.

बोने घनत्व - नियमित रूप से हर सेल आधारित प्रयोग बोने घनत्व में ही वैज्ञानिक समस्या पर निर्भर करता है. आसंजन का अध्ययन और प्रसार या बाधा गठन कब, endothelial कोशिकाओं, एक मिला हुआ गारंटी करने के लिए / 2 सेमी 40,000-60,000 कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व के साथ 48 घंटे के बाद स्थिर बाधा वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. प्रयोग का ध्यान केंद्रित प्रसार पर है, endothelial कोशिकाओं / 2 सेमी के बारे में 2,000-10,000 कोशिकाओं की एक कम घनत्व के साथ वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए.

Protocol

1. मापन प्रणाली की तैयारी

  1. संक्षेपण को रोकने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन में सरणी धारक Prewarm.
  2. कुओं के सूखने से बचने के लिए आसुत जल के साथ इनक्यूबेटर का पानी कास्केट भरें.
  3. बाँझ शर्तों के तहत एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में कोशिकाओं और सरणियों पर सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन.

2. प्रकोष्ठों की सारणियों और टीका की तैयारी

नोट: ECIS सरणियों अच्छी तरह से अच्छी तरह से reproducibility और संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार करने के लिए, इलेक्ट्रोड बहाव को रोकने के लिए एक प्रयोग से पहले साफ और स्थिर करने की आवश्यकता है. इसलिए दो विकल्प उपलब्ध हैं: एल सिस्टीन और बी) ECIS का स्थिरीकरण समारोह के साथ इलेक्ट्रोड की एक) pretreatment.

एक विकल्प: एल सिस्टीन सबसे लगातार pretreatment के रूप में सिफारिश की है, लेकिन कुछ विशेष मामलों में प्रोटीन coatin के साथ बातचीत हो सकती हैइलेक्ट्रोड पर जी एस. प्रस्तुत संस्करणों मानक 8 अच्छी तरह सरणियों के लिए उपयोग किया जाता है.

  1. 200 μl / अच्छी तरह से 10 मिमी एल सिस्टीन जोड़ें. सिस्टीन साफ ​​और एक उच्च और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इलेक्ट्रोड समाई उपलब्ध कराने इलेक्ट्रोड सतह संशोधित करता है.
  2. कमरे के तापमान (आर टी) पर 15 मिनट सेते हैं.
  3. अति शुद्ध पानी (1 प्रकार) के साथ दो बार 500 μl / अच्छी तरह से धो लें. कुछ प्रोटीन सोखना के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो फॉस्फेट बफ़र्स, का प्रयोग न करें. सोने की सतह संपर्क में लाया पहले बड़े अणुओं सोखना के बाद से ही, कोटिंग से पहले सीरम युक्त समाधान से बचें.
  4. 200 μl / अच्छी तरह से गर्म 1% जिलेटिन के साथ कोट.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते
  6. जिलेटिन निकालें, लेकिन सतह सूखी नहीं है. इस इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकते हैं.
  7. अति शुद्ध पानी (1 प्रकार) के साथ एक बार धोएं.
  8. (सीरम, एंटीबायोटिक दवाओं और सभी वृद्धि कारक युक्त) 400 μl / अच्छी तरह से पूरा सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें.
  9. सरणी धारक एक में स्लाइड सरणीडी सरणी नौ स्वर्ण वर्ग पैड ठीक से वसंत लोड पोगो पिन और तय समायोजन पेंच हाथ तंग से संपर्क कर रहे हैं कि इस तरह तैनात है कि सुनिश्चित करें. पारदर्शी सरणियों के साथ सावधान रहो, सोने की परत आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं.
  10. प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से एक त्वरित प्रतिबाधा माप प्रदर्शन करने के लिए "डेटा एकत्रित" खंड में चेक द्वारा पीछा माप सॉफ्टवेयर और प्रेस सेटअप खोलें. परिणामस्वरूप मूल्यों माप आधारभूत हैं और स्वचालित रूप से "टिप्पणी" में संग्रहीत किया जाएगा.
  11. अच्छी तरह से जांच स्वतः इस्तेमाल किया ECIS सरणियों के प्रकार का निर्धारण करेगा. "ठीक है विन्यास" खंड में चयनित सरणियों सत्यापित करें.
  12. सरणी आरेख खाली या गलत जुड़ा वेल्स के लिए ठीक से जुड़े कुओं के लिए हरे और लाल रोशनी. फिर भी, हमेशा सरणियों धारक में सही ढंग से रखा गया है कि यह सुनिश्चित कर लें.
    नोट: सफाई और कोटिंग सफल रहे थे 8W1E ECIS सरणियों एसी हैलगभग 5 NF और क्रमशः के बारे में 2,000 और 200 Ω के एक आधारभूत प्रतिरोध में जो परिणाम 50 NF, के 8W10E सरणियों की apacitance.
  13. धारक से सरणी निकालें.
  14. 400 μl / अच्छी तरह से पूरा सेल संस्कृति के माध्यम में एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में बीज कोशिकाओं.

विकल्प बी: इलेक्ट्रोड बहाव या अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रतिरोध और समाई में बड़े अंतर के साथ समस्या होती है अगर ECIS का स्थिरीकरण समारोह एल सिस्टीन उपचार के साथ एक विकल्प या संयोजन में के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. प्रोटीन (वैकल्पिक) के साथ सिस्टीन उपचार (वैकल्पिक) और PRECOAT इलेक्ट्रोड प्रदर्शन करना.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा मध्यम के 200 μl / अच्छी तरह से जोड़ें और सरणी धारक में सरणी जगह है.
  3. सरणी का पता लगाने के लिए जांच से पीछा ओपन माप सॉफ्टवेयर और प्रेस सेटअप सी. ठीक से जुड़ा हुआ है और प्रारंभिक जेड, आर मापने के लिए, और
  4. दबाकर इलेक्ट्रोड स्थिर (सीए. 3 मा), उच्च आवृत्ति (64 kHz) पल्स लागू होगी.
  5. फिर इलेक्ट्रोड की जाँच करें. समाई वृद्धि की जानी चाहिए और प्रतिरोध मूल्यों एक तुलनीय सीमा में होना चाहिए.
  6. समाई और प्रतिरोध मूल्यों अभी भी संतोषजनक नहीं हैं, तो स्थिरीकरण दोहराएँ.
  7. धारक से सरणी निकालें और कोशिकाओं टीका लगाना.

3. माप सॉफ्टवेयर और डाटा अधिग्रहण की स्थापना

  1. पहले वर्णित के रूप में सरणी धारक में सरणी रखें.
  2. ओपन माप सॉफ्टवेयर और ECIS साधन को ECIS सॉफ्टवेयर कनेक्ट और अच्छी तरह से जाँच एक और चलाने के लिए "डेटा एकत्रित" खंड में सेटअप बटन दबाएँ.
  3. "ठीक है विन्यास" खंड में चयनित सरणियों सत्यापित करें.
  4. "ठीक है Configurat में मापा जा कुओं का चयन करेंआयन "खंड.
  5. "डेटा एकत्रित" विकल्प से माप मोड का चयन करें:
    1. एक निश्चित आवृत्ति पर एक समय श्रृंखला के लिए, एकल फ्रीक का चयन करें. / समय (एसएफटी) और ड्रॉप डाउन मेनू से माप आवृत्ति का चयन करें.
    2. इलेक्ट्रोड कवरेज और आरबी और अल्फा के मॉडलिंग की माप के लिए, कई फ्रीक का चयन करें. / समय (MFT). ECIS युक्ति सभी उपलब्ध आवृत्तियों पर स्वतः उपाय करेंगे.
    3. Micromotion के लिए (डेटा विश्लेषण देखें) तेजी से समय (आरटीसी) लीजिए चयन और माप आवृत्ति और नमूना आवृत्ति समायोजित करें. यहाँ मानक अस्थायी समाधान सेक (1 हर्ट्ज) प्रति एक नमूना है, लेकिन नमूने आवृत्ति भी (z-थीटा के लिए) 25 हर्ट्ज के लिए ऊपर प्रतिबाधा में तेजी से परिवर्तन ट्रैक करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. महत्वपूर्ण नोट: आरटीसी मोड में केवल एक ही अच्छी तरह से मापा जाता है.
      नोट: micromotion बाद में कई कुओं में मापा जा करने की जरूरत है, मदद करने के लिए जाना> दिखाएँ विशेषज्ञ उपकरण पट्टी / मेनू आइटम> Acquire> बहु ठीक आरटीसी. एकत्र डेटा अनुभाग में समय सीमा (मानव संसाधन) निर्दिष्ट करें; ECIS अब संख्यात्मक क्रम में चयनित कुओं उपाय करेंगे. माप शुरू करने के बाद सॉफ्टवेयर चक्रों की संख्या को निर्दिष्ट करने के लिए कहेगा. माप दोहराया जाना चाहिए कितनी बार के लिए मान दर्ज करें.
  6. एसएफटी और MFT के लिए, माप या के बीच समय अंतराल (एसईसी) का चयन डेटा के रूप में तेजी से संभव के रूप में अनियंत्रित इस विकल्प को छोड़ प्राप्त किया जा करने की आवश्यकता है.
    नोट: ECIS डिवाइस एक न्यूनतम एसएफटी अधिग्रहण 0.25 सेकंड की दर और MFT के लिए 7.5 सेकंड के साथ अच्छी तरह से एक से दूसरे में स्विच करने के लिए एक बहुसंकेतक का उपयोग करता है डेटा प्राप्त करने के लिए. अंतराल मतलब चयनित कुओं और आवृत्तियों की संख्या पर निर्भर है. धीमी गति से proliferating कोशिकाओं पर माप या समय बनाम प्रतिरोध का एक सरल रिकॉर्डिंग के लिए, 600 सेकंड या उससे अधिक के अंतराल का उपयोग करें.
  7. प्रेस शुरू, फ़ाइल नाम और डेटा स्टोर करने के लिए स्थान का चयन करें.
    नोट: फ़ाइल का आकार एक पीआर नहीं होना चाहिएoblem, ECIS डेटा भी सभी माप आवृत्तियों और चयनित कुओं की संख्या के साथ कई सौ एमबी से अधिक है जो कभी नहीं *. ABP बुलाया सादे पाठ प्रारूप का एक प्रकार में सहेज कर रहे हैं के बाद से.
  8. समाप्त करें दबाकर चलाने के बंद करो.

4. मध्यम परिवर्तन और सेल हेरफेर

  1. प्रेस ठहरें, यह डाटा अधिग्रहण बंद करो, लेकिन प्रायोगिक घड़ी को चलाने के लिए जारी रहेगा.
  2. धारक से सरणी निकालें और एक लामिना का प्रवाह बेंच (यानी परिवर्तन मध्यम) के तहत यह हेरफेर.
  3. वापस धारक में सरणी प्लेस और कनेक्शन की जांच या डाटा अधिग्रहण जारी रखने के लिए प्रयोग जारी रखें पर क्लिक या तो. माप सॉफ्टवेयर डेटा सेट में एक समय मार्क जगह होगी.

5. डाटा अधिग्रहण के दौरान तीव्र उत्तेजना

ध्यान दें: एक दूसरा विकल्प तत्काल परिवर्तन का पालन करने के लिए डाटा अधिग्रहण के दौरान कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए है. यह तभी संभव है; नमूने प्रयोग के आगे पाठ्यक्रम में बाँझ होने की जरूरत नहीं है.

  1. सीधे अच्छी तरह से करने के लिए प्रोत्साहन जोड़ें और एक 200 μl विंदुक के साथ सावधान मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें.
  2. मार्क समय मार्क दबाकर मैन्युअल रूप से इशारा करते हैं और एक टिप्पणी जोड़ें.

6. विद्युत घायल

नोट: प्रयुक्त सेल प्रकार के लिए सही सेटिंग्स ढूँढना विद्युत लोग घायल हो गए के लिए महत्वपूर्ण है. घायल लोग घायल हो गए बहुत लंबा है और / या किसी न किसी है अगर यह (विशेष रूप से पारदर्शी सरणियों पर) इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि यह कोशिकाओं की अपर्याप्त हटाने में परिणाम कर सकते हैं बहुत छोटा है. इसलिए, कई छोटे लोग घायल हो गए दालों की सिफारिश की है. HUVEC संस्कृतियों के लिए 60 kHz पर 5 वी के दो 10-20 सेकंड लंबा लोग घायल हो गए दालों प्रत्येक ECIS 1600R उपयोग कर इष्टतम पाया गया है. सामान्य तौर पर यह कोशिकाओं में एक समान उच्च क्षेत्रों को बनाए रखने के लिए और इलेक्ट्रोड को कोई नुकसान से बचने के लिए> 20 kHz उच्च आवृत्तियों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.

  1. Dur लोग घायल हो गए प्रदर्शन करनाएक सक्रिय ECIS माप आईएनजी.
  2. घाव / Electroporate सेटअप सक्षम, फिर घाव क्लिक करें और समय (सेकंड) में भरने, घाव वोल्टेज (1,600 आर के वी) या वर्तमान (जेड और जेड थीटा के लिए μA) और आवृत्ति (हर्ट्ज). प्रदर्शित मूलभूत मान सरणी और ECIS डिवाइस के प्रकार के आधार पर कर रहे हैं.
  3. "ठीक है विन्यास" खंड में घाव करने के लिए कुओं का चयन करें. केवल जाँच कुओं घायल कर दिया जाएगा.
  4. घंटे तक देरी सक्षम और देरी घाव समारोह को सक्रिय करने के लिए देरी समय में भरें. इस समारोह स्टॉप दबाने या स्वयं एक घाव लगाने से किसी भी समय बंद किया जा सकता है. केवल एक देरी कमान एक समय में सक्रिय हो सकता है.
  5. प्रेस सक्रिय और लोग घायल हो गए शुरू करने के लिए पॉप अप विंडो में ठीक क्लिक करें.
  6. अन्यथा लोग घायल हो गए दोहराने, प्रतिरोध संकेत लोग घायल हो गए के बाद ऑफसेट प्रतिबाधा के लिए चला जाता है कि सुनिश्चित करें.

7. डेटा विश्लेषण

  • डेटा प्रतिनिधित्व और निर्यात.
    1. > ओपन - फाइल के माध्यम से सेट खत्म माप या लोड डेटा.
    2. "ठीक है विन्यास" खिड़की से प्रदर्शित करने के लिए कुओं का चयन करें. औसत पेश करने के लिए समूह व्यक्तिगत कुओं.
    3. ऊपरी पट्टी (जेड, आर या सी) से प्रदर्शित करने के लिए पैरामीटर चुना है.
    4. ऊपरी पट्टी (टी = समय, एफ = आवृत्ति, 3 डी = झरना धब्बा) से चुनें ग्राफ प्रकार.
    5. ग्राफ खिड़की से नीचे स्लाइडर्स के साथ ग्राफ ऑफसेट और सीमा निर्धारित करें या आसन्न नियंत्रण में सही मूल्यों में भरें.
    6. डेटा की औसत या सामान्य बनाने के चल रहे हैं, मानक विचलन प्रदर्शन करने के लिए "विश्लेषण" खंड में बुनियादी "समय श्रृंखला विकल्प" से चुना है.
    7. Nyuist साजिश और फूरियर परिवर्तन की तरह और अधिक उन्नत कार्यों के लिए मदद मेनू में विशेषज्ञ टूलबार को सक्रिय करें.
    8. आरए परिभाषित करने के लिए "विश्लेषण" खंड में "प्रदर्शन विकल्प" का प्रयोग करेंएक्स और वाई-कुल्हाड़ियों और निर्यात ग्राफ के nge.
    9. एक्सेल (चयनित) के लिए> और जरूरत के रूप में गहराई से विश्लेषण, सांख्यिकी और प्रतिनिधित्व में के लिए पसंद की एक तीसरी पार्टी सॉफ्टवेयर का उपयोग करें -> निर्यात डाटा - निर्यात फ़ाइल के माध्यम से एक एक्सेल फाइल करने के लिए डेटा का चयन किया.
  • आरबी और अल्फा के मॉडलिंग.
    नोट: मॉडलिंग के लिए यह संदर्भ के रूप में अच्छी तरह से भरा एक सेल मुक्त, माध्यम का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
    1. समाप्त करें MFT माप या लोड MFT ​​डेटा सेट.
    2. एक सेल मुक्त संदर्भ में अच्छी तरह से उपलब्ध प्रेस तो स्वतः संदर्भ मूल्य या "विश्लेषण" खंड में "Freq. स्कैन मॉडलिंग" से मैन्युअल रूप से सेल खाली समय बिंदु का चयन करने के लिए सेट का चयन करने के लिए प्राप्त करें या तो.
    3. कोई सेल मुक्त संदर्भ है, तो एक और डेटा सेट से एक संदर्भ मूल्य आयात करते हैं. संदर्भ डेटा सेट (एक ही सरणी और माध्यम का इस्तेमाल किया गया था कि बनाना) को खोलें और या फिर संदर्भ मान का चयन करने के लिए सेट का उपयोग.तब मापा डेटा और प्रेस पाने के लिए नेविगेट.
    4. उपलब्ध उपयोग कारखाने डिफ़ॉल्ट सेट कोई सेल मुक्त संदर्भ डेटा नहीं है.
    5. गणना शुरू करने के लिए प्रेस मॉडल. मॉडलिंग डेटा सेट के आकार पर निर्भर कई मिनट लग सकते हैं.
  • Micromotion की गणना.
    नोट: इस गणना माप सॉफ्टवेयर का हिस्सा नहीं है, लेकिन किसी भी सिग्नल प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.
    1. आरटीसी माप खत्म या आरटीसी डेटा सेट लोड.
    2. पूरी अवधि का औसत निकाला प्रतिरोध द्वारा निर्धारित डेटा मानक के अनुसार.
    3. 256 डेटा बिंदुओं की लंबाई के साथ खंडों में सेट डेटा तोड़ने और एक Hanning खिड़की से प्रत्येक खंड को साफ.
    4. यादृच्छिक शोर को कम करने के लिए एक तरफा 129 सूत्री सत्ता स्पेक्ट्रम के लिए एक 256 सूत्री फूरियर परिवर्तन और औसत परिणामस्वरूप आवृत्ति स्पेक्ट्रा भागो और जैविक संकेत बढ़ाया.
    5. एक लॉग इन प्रवेश ग्राफ में और लागू आयाम के खिलाफ प्लॉट आवृत्तिकम से कम वर्ग रेखीय फिट.
    6. रेखीय फिट की ढलान समग्र संकेत में शोर और कोशिकाओं की जिससे micromotion का एक उपाय है.
  • Representative Results

    एक प्रयोग स्थापना काफी सरल है और माप में ही पूरी तरह से स्वचालित है, लेकिन अक्सर मामला है, सही विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं. प्रतिनिधि डेटा अनुभाग में एक गाइड ECIS साथ प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों की व्याख्या के लिए प्रदान की जाती है. यह एक ECIS माप मानकों दर्ज किया जाना चाहिए उपयोगी और जो हो सकता है वैज्ञानिक समस्या की तरह है जो के लिए तय करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.

    एक ठेठ प्रयोगात्मक पढ़ने के लिए बाहर आम तौर पर सेल टीका और कोशिकाओं संगम तक पहुँचने जब एक पठार चरण के बाद एक विकास के चरण में विभाजित किया जा सकता है. इन चरणों में से प्रत्येक अलग सेलुलर संपत्तियों के बारे में जानकारी देता है. एक प्रतिनिधि माप चित्रा 2 में दिखाया गया है और ए) सेल आसंजन का विश्लेषण करने के लिए चार subphases में विभाजित, प्रसार और प्रसार कर रहा है, एक परिपक्वता चुनाव आयोग बाधा की बी) के गठन, सी) सेल प्रवास एक बिजली की पीढ़ी के बाद) vasoactive एजेंट थ्रोम्बिन के साथ उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया और डी, अल घाव. चरण विपरीत और immunofluorescence छवियों इलेक्ट्रोड कवरेज, सेल स्थिति, और दर्ज प्रतिबाधा संकेत के बीच की कड़ी को वर्णन करने के लिए अलग subphases दौरान माप इलेक्ट्रोड से सीधे प्राप्त कर लिया गया.

    आसंजन, प्रसार और प्रसार

    हर सेल प्रकार बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन या अन्य उत्तेजनाओं के साथ कोटिंग, बोने घनत्व अलग से हेरफेर किया जा सकता है कि इसकी विशेषता आसंजन और विकास की अवस्था है. उन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बड़ी कठिनाइयों में से एक के प्रसार और प्रसार, आसंजन के बीच अंतर करने के लिए है. वेगनर एट अल. 11 प्रतिरोध और उन मानकों और चित्रा 3 में यह प्रतिरोध और समाई एक दूसरे के पूरक कैसे कर सकते हैं स्पष्ट हो जाता है के बीच अंतर करने में समाई का एक संयोजन का उपयोग के लिए एक विस्तृत विवरण दिया. इसके लिए महत्वपूर्ण हैआसंजन के अध्ययन और यहां बिजली के क्षेत्र की कोशिकाओं के आसपास विशेष रूप से प्रवाह के लिए वर्तमान बलों जो निलंबन 8 में कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली का एक ध्रुवीकरण का कारण बनता है, क्योंकि माप आवृत्ति के प्रभाव को समझने के लिए प्रसार. कोशिकाओं वे इलेक्ट्रोड (आंशिक क्षेत्र) पर खुला क्षेत्र के प्रतिशत के साथ एक रैखिक फैशन में इलेक्ट्रोड और समाई घटने पर फैल द्वारा वर्तमान प्रवाह को सीमित करने के लिए शुरू देते हैं. समाई में कमी इलेक्ट्रोड कवरेज के लिए आनुपातिक प्रत्यक्ष है जहां 40 kHz (3B चित्रा), अधिक से अधिक एक आवृत्ति में समाई जब रिकॉर्डिंग इसलिए, आसंजन, प्रसार और प्रसार, सबसे अच्छा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से अपने सबसे संवेदनशील माप आवृत्ति पर प्रतिरोध मिला हुआ बाधा में भेदभाव और कोशिकाओं की परिपक्वता (चित्रा 3) के लिए एक सीधा उपाय है. आंशिक क्षेत्र के अलावा, वेगनर एट अल. दो अन्य की शुरुआत कीटी 1/2 इलेक्ट्रोड का 50% कोशिकाओं (चित्रा 3 बी, प्रविष्टि) के साथ कवर किया जाता है जब तक समय है, जो (आधा अधिकतम समाई), और समाई वक्र (एस, नहीं की ढलान: आसंजन और इलेक्ट्रोड कवरेज यों तो मापदंडों सेल प्रसार और प्रसार की दर के रूप में) दिखाया.

    बाधा गुणवत्ता के एक उपाय के रूप में प्रतिरोध

    प्रतिरोध यह झिल्ली, इलेक्ट्रोड और मध्यम से capacitive घटकों neglects क्योंकि, बाधा गुणवत्ता और अच्छी समारोह का वर्णन करता है कि प्रतिबाधा का हिस्सा है. पारगम्यता परिभाषा के अनुसार सेल सेल संपर्क पर ही निर्भर है, क्योंकि यहाँ अवधि बाधा गुणवत्ता और नहीं पारगम्यता, प्रयोग किया जाता है. प्रतिरोध हालांकि मौजूदा प्रवाह को ब्लॉक करने के लिए कोशिकाओं और उनके सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत की क्षमता से निर्धारित होता है. तदनुसार विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (क्लोन और मार्ग) उनकी विशिष्ट प्रतिरोध मूल्यों (चित्रा -4 ए) है. प्रतिरोध एक बहुत clea देता हैसेल बाधा के बारे में RER विचार, प्रतिबाधा संकेत हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए.

    आरबी और अल्फा की मॉडलिंग

    ECIS सॉफ्टवेयर एक खास विशेषता बंदरगाहों, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स adhesions (आंकड़े 4 बी और 4 सी) के बीच भेद जो दो मापदंडों, मॉडल की क्षमता. आरबी (2 सेमी एक्स ओम में), वर्तमान प्रवाह और इस तरह शास्त्रीय पारगम्यता की एक व्युत्क्रम उपाय करने के लिए सेल सेल संपर्क की प्रतिरोधकता है. उच्च आरबी वर्तमान प्रवाह की दिशा में कम पारगम्यता निकलता है. अल्फा (में सेमी x ओम 0.5), सेल इलेक्ट्रोड जंक्शनों से उत्पन्न होने वाली प्रतिबाधा योगदान के लिए एक उपाय है. सेल सेल और सेल मैट्रिक्स संपर्क यों को मॉडल Giaever और Keese द्वारा 1991 में पेश किया गया था और कोशिकाओं परिपत्र हैं कि इस धारणा पर आधारित है, एक इन्सुलेट झिल्ली है कि डिस्क के आकार वस्तुओं, इलेक्ट्रोड पर जाएँ और इलेक्ट्रोलाइट 2 का आयोजन करने के साथ भर रहे हैं .कोशिका झिल्ली की संपत्ति इन्सुलेट वर्तमान के लिए केवल तीन रास्ते में छोड़ देता है: एक) कोशिकाओं और इलेक्ट्रोड के उदर की सतह के बीच, ख) सेल सेल संपर्कों, और ग) कोशिकाओं के माध्यम से बीच (केवल संभावना एक उच्च माप आवृत्ति प्रयोग किया जाता है जब ). एक अधिक विस्तृत व्युत्पत्ति और स्पष्टीकरण लो एट अल 3,12 के अखबारों में पाया जा सकता है.

    Micromotion

    यह प्रतिरोध संकेत (चित्रा -4 ए) में छोटे उतार चढ़ाव सूक्ष्म, यादृच्छिक सेल मिला हुआ सेल परतों में आंदोलनों के साथ ही पर चलती कोशिकाओं को और विरल संस्कृतियों 2 में इलेक्ट्रोड बंद की वजह से कर रहे हैं कि दिखाया गया है. लो और ऑप द्वारा वर्णित ECIS समय पाठ्यक्रम आंकड़ों के इस पहलू एट अल. 13,14 अक्सर अनदेखी की और पैरा और subcellular वर्तमान रास्तों के लिए खाते में 1E सरणियों के साथ और सबसे संवेदनशील आवृत्ति पर जब मापने सबसे अच्छा देखा जाता है. इस सेल की गणना शोर (micromotion) वें का हिस्सा नहीं है की वजह सेई मानक माप सॉफ्टवेयर, नवीनतम संस्करण में फास्ट फूरियर परिवर्तन (FFT) एकीकृत है, हालांकि. 4 kHz पर 1 घंटे के लिए 1 हर्ट्ज की एक आवृत्ति नमूना साथ आरटीसी डेटा रिकॉर्डिंग चुनाव आयोग micromotion की गणना के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करता है. इस गणना एक ही मूल्य प्रदान करता है और सीधे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Micromotion के लिए आवृत्ति विश्लेषण के उपयोग पर एक विस्तृत चर्चा कहीं 15 पाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से FFT के लिए अन्य विश्लेषण रणनीतियों वेतन वृद्धि के विचरण की तरह इस्तेमाल किया जा सकता है. विचरण micromotion में छोटे परिवर्तन के प्रति अधिक संवेदनशील है, लेकिन इस वजह से संवेदनशीलता के व्यक्तिगत प्रयोगों की तुलना मुश्किल हो जाता है. बिजली स्पेक्ट्रम की ढलानों micromotion की एक और अधिक मजबूत माप (चित्रा 4D) कर रहे हैं. यहाँ वक्र के अंतर्गत क्षेत्र micromotion या कोशिकाओं को बनाने के शोर की राशि के रूप में देखा जा सकता है. इसलिए, steeper शक्ति स्पेक्ट्रम की ढलान वक्र के अंतर्गत क्षेत्र में छोटेऔर micromotion छोटे.

    इलेक्ट्रिक घाव भरने परख

    कोशिकाओं के प्रवास अध्ययन करने के लिए, आमतौर पर यांत्रिक घाव विंदुक युक्तियाँ, सेल स्क्रेपर्स या विशिष्ट टिकटों के साथ संस्कृति की थाली से दूर कोशिकाओं scratching और microscopically 16 उनके प्रतिप्रवासन पालन से लागू कर रहे हैं. इस विधि खरोंच का आकार बदलता है और आमतौर पर घाव भरने की प्रक्रिया पर सेल प्रसार के प्रभाव उपेक्षा करने के लिए बहुत बड़ी है कि स्पष्ट नुकसान है. ECIS के लोग घायल हो गए समारोह एक सेल मुक्त इलेक्ट्रोड पाने के लिए एक उच्च वोल्टेज, उच्च आवृत्ति पल्स का उपयोग करता है और बाद में मौत कोशिकाओं (चित्रा 5A) की जगह कोशिकाओं पड़ोसी की प्रतिप्रवासन इस प्रकार है. मानक, श्रम गहन खरोंच assays पर इस स्वचालित पद्धति का एक लाभ यह ECIS शुद्ध प्रवास का अध्ययन करने के कुछ ही घंटों के भीतर बंद कर देता है कि 250 मीटर की एक सटीक व्यास के साथ एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घाव,, पैदा करता है. इसके अलावा, बिजली नाड़ी करनातों प्रोटीन कोटिंग और स्रावित बाह्य मैट्रिक्स को दूर नहीं. कोशिकाओं सभी पक्षों से इलेक्ट्रोड पर प्रतिप्रवास करना है कि इस धारणा के तहत, माइग्रेशन दर आसानी से घाव बंद 17 के लिए आवश्यक समय से घाव त्रिज्या विभाजित करके गणना की जा सकती है. विद्युत लोग घायल हो गए करने के लिए एक विकल्प के रूप में, हाल ही में तथाकथित बिजली की बाड़ विधि () नहीं दिखाया पेश किया गया था. यहाँ उच्च वर्तमान दालों टीका के बाद इलेक्ट्रोड पर लगाव और कोशिकाओं के प्रवास को रोकने के. कोशिकाओं माप इलेक्ट्रोड के आसपास हो जाना और अंदर की ओर जैसे ही बिजली दालों बंद कर दिया है के रूप में पलायन शुरू कर देंगे. बिजली घायल हो गए अधिक बिजली की बाड़ का लाभ इलेक्ट्रोड सतह सेल के विकास या सेल प्रवास पर विभिन्न कोटिंग्स के प्रभाव को मापने के लिए महत्वपूर्ण है जो सेल को हटाने, से बदलाव नहीं किया गया है.

    सेल उत्तेजना

    सेल प्रवास के अध्ययन के अलावा, प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी पूरी तरह से अनुकूल हैदवाओं और कोशिकाओं पर विषाक्त पदार्थों के प्रभाव को मापने. चित्रा 5 ब थ्रोम्बिन प्रतिरोध में एक क्षणिक बूंद के रूप में प्रकट होता है जो कोशिकाओं का संकुचन और खाई गठन, से मिला हुआ चुनाव आयोग बाधा में अति पारगम्यता प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जहां एक शास्त्रीय उत्तेजना / निषेध प्रयोग, प्रस्तुत करता है . रो kinase अवरोध वाई 27,632 के साथ preincubation द्वारा थ्रोम्बिन प्रतिक्रिया की सबसे बेसल सेल तनाव 18 कम करने और तनाव फाइबर गठन 19 को अवरुद्ध करके कम है. फिर रो kinase अवरोधक चुनाव आयोग बाधा का एक तत्काल और कुल वसूली के लिए अग्रणी, थ्रोम्बिन इसके बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर इस्तेमाल किया गया था. यहाँ तीव्र सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सतत प्रतिबाधा माप प्रणाली का लाभ स्पष्ट हो जाता है. नियमित endpoint assays (जैसे immunofluorescence धुंधला या macromolecule बीतने) में इस्तेमाल किया अवरोधक को इस तीव्र प्रतिक्रिया का पता लगाने और यों तो बहुत मुश्किल नहीं तो असंभव होगा. नोट करना महत्वपूर्ण है कि साथ मैंmpedance माप आयनों की ओर पारगम्यता बड़े अणुओं की दिशा में वर्णित है और नहीं है. ECIS माप और macromolecule पारित होने के प्रयोगों के बीच एक शानदार तुलना प्रदान की जाती है जहां अमन एट अल. 20, को देखें.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. प्रतिनिधि माप. MVEC 5000 कोशिकाओं / 2 सेमी और MFT रिकॉर्डिंग 10 दिनों में प्रदर्शन किया गया था की एक कम बोने घनत्व के साथ एक जिलेटिन लेपित 8W1E सरणियों पर बड़े हो रहे थे. माप एक ECIS प्रयोग के विभिन्न पढ़ें बहिष्कार दिखाता है: ए) आसंजन, प्रसार और प्रसार, बी) के गठन और एक मिला हुआ सेल बाधा की परिपक्वता, ग) घाव भरने एक बिजली के घाव के आवेदन के बाद, vasoactive साथ डी) उत्तेजना एजेंट थ्रोम्बिन. दो तीर मध्यम से संकेत मिलता है 4 दिनों के अंतराल में प्रदर्शन किया और यांत्रिक उत्तेजनाओं और तापमान और पीएच में परिवर्तन की दिशा में माप की संवेदनशीलता के बारे में एक विचार दे रहे थे जो नाश्ते,. शीर्ष पैनल में छवियों माप के अनुरूप और माप इलेक्ट्रोड से सीधे प्राप्त कर लिया गया. बाईं तरफ चरण विपरीत छवि इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए शुरू, 24 घंटा टीका के बाद endothelial कोशिकाओं से पता चलता है. केंद्र में और मिला हुआ endothelial परत की सही मौजूद एफ actin धुंधला पर immunofluorescence चित्रों से पहले और थ्रोम्बिन (1 यू / एमएल) के साथ उत्तेजना के बाद. थ्रोम्बिन तथाकथित तनाव फाइबर और आधारभूत प्रतिरोध में एक बूंद से ECIS संकेत में पहचानने अंतर - endothelial अंतराल (तीर और छवि डालता है), के क्षणिक उद्घाटन के गठन से endothelial कोशिकाओं का संकुचन का कारण बनता है. यहाँ माप की संवेदनशीलता स्पष्ट हो जाता है और सेल परत में परिवर्तन प्रतिबाधा संकेत के साथ सहसंबंधी कैसे.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. सेल लगाव और विकास. MVEC ही दाता से जिलेटिन लेपित 8W10E सरणियों और सेल के विकास के लिए 60 घंटे के लिए एकाधिक आवृत्तियों पर दर्ज की गई थी पर तीन अलग घनत्व के साथ वरीयता प्राप्त थे. ए) 4 kHz के अपने इष्टतम आवृत्ति पर तीन स्थितियों के लिए मूल्यों के प्रतिरोध को मापने के लिए बाधा गठन. सभी तीन बोने घनत्व सीए के एक मिला हुआ बाधा की स्थापना की. माप के अंत में 1,200 Ω;. हालांकि प्रसार दर (घटता की ढलानों) स्पष्ट रूप से अलग बी) समाई का मापन 64 kHz पर आसंजन और प्रसार पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. आसंजन में है(2-8 घंटे के बीच) समाई वक्र में itial पठार चरण. , इलेक्ट्रोड कवरेज के लिए रैखिक संबंध में है, जो प्रसार वक्र के ढलान का प्रतिनिधित्व करती है और बोने घनत्व के आधार पर 10-30 घंटे के बाद पूरा हो गया है. समय बिंदु टी 1/2 (आधा अधिक से अधिक कवरेज) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. मिला हुआ बाधा की विशेषता. अलग बीतने संख्या (बीतने के 3 और 6) जिलेटिन लेपित 8W1E सरणियों पर वरीयता प्राप्त थे और एक MFT माप चुनाव आयोग बाधा. ए) प्रतिरोध करने के लिए चिह्नित 30 घंटे के लिए प्रदर्शन किया गया था के साथ दो MVEC दाताओं माप छोटी दाता 1 सीए के एक उच्च प्रतिरोध किया है कि पता चलता है. सीए की तुलना में 11,000 Ω. पुराने दाता 2. ई.पू.) ECIS की क्षमताओं मॉडलिंग की 7500 Ω कम प्रतिरोध के लिए कारणों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. मॉडलिंग एक तुलनीय सेल सेल बातचीत आरबी पता चला और एक संभावित कारण. डी के रूप में एक कमजोर सेल मैट्रिक्स संपर्क अल्फा इंगित) आरटीसी वक्र के अंतर्गत क्षेत्र micromotion के लिए आनुपातिक है जहां फूरियर परिवर्तन, से मिला हुआ सेल परत के भीतर micromotion यों को प्रदर्शन किया गया था . स्पेक्ट्रा विश्लेषण पुराने दाता 2 की कम micromotion से पता चलता है और इस तरह पहले से ही प्रतिरोध संकेत (कम विचरण) से माना जा सकता है कि क्या समर्थन करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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    चित्रा 5. सेल प्रवास विद्युत लोग घायल हो गए और थ्रोम्बिन उत्तेजना का प्रभाव के बाद. विरोध रिकॉर्डिंग अधिक से अधिक अस्थायी समाधान के साथ 4 kHz पर प्रदर्शन किया गया. ए) MVEC दाता 1 बीतने के 3 और जिलेटिन लेपित 8W1E सरणियों पर पारित होने के 6 में दाता 2 में इस्तेमाल किया और संगम हो गया था. फिर एक बिजली के घाव 20 सेकंड प्रत्येक की अवधि के साथ 60 kHz पर दो 5 वी दालों के आवेदन के द्वारा बनाया गया था. युवा दाता 1 HUVEC जिलेटिन लेपित 8W10E सरणियों पर बड़े हो रहे थे) को पुराने दाता 2. बी की तुलना में एक तेजी से घाव बंद (माइग्रेशन, घटता की ढलानों) पर आधारित क्षमताओं उपचार बेहतर घाव और लोग घायल हो गए के बाद एक उच्च प्रतिरोध दिखाया. संगम पर कोशिकाओं सीरम बेसल मध्यम प्लस 1% मानव सीरम albumin (HSA) के साथ पूरा मध्यम संस्कृति की जगह से 1.5 घंटे के लिए भूखे किया गया है. हमेंसीरम घटकों थ्रोम्बिन प्रतिक्रिया ब्लॉक के बाद HSA के साथ सादे माध्यम की उम्र, एक महत्वपूर्ण कदम है. जैसे ही एक स्थिर प्रतिरोध पठार का पता चला था, थ्रोम्बिन वेल्स को सीधे जोड़ा गया है और एक 200 μl विंदुक के साथ सावधानी से मिलाया. अधिक से अधिक थ्रोम्बिन प्रभाव आधारभूत और एक सीए के विरोध में एक क्षणिक ड्रॉप द्वारा विशेषता 30 मिनट के बाद दिखाई देता है. वसूली के बाद 30-50% कम प्रतिरोध. कोशिकाओं या तो 30 मिनट या अवरोधक के लिए रो kinase अवरोधक वाई 27,632 के साथ preincubated थे 20, 30, या तुरंत थ्रोम्बिन प्रभाव कम हो जो थ्रोम्बिन इसके बाद 40 मिनट, जोड़ा गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    Discussion

    ECIS सेल गुण और व्यवहार की जांच के लिए और साथ ही ज्ञात और अज्ञात पदार्थों के प्रभाव की मात्रा का ठहराव के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. जिससे कोशिकाओं मानक संस्कृति शर्तों के तहत आयोजित की जाती हैं, प्रतिबाधा लगातार एक उच्च अस्थायी समाधान के साथ नजर रखी और ऑप्टिकल संकेतों के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है. कि जिस तरह से सेल जोड़तोड़ के लिए इष्टतम समय बिंदु रूपात्मक और कार्यात्मक सेल की स्थिति के आधार पर चुना जा सकता है. दुर्भाग्य से, यह उच्च माप संकल्प तापमान, पीएच या कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना (मध्यम परिवर्तन) में छोटे परिवर्तन तुरंत प्रतिबाधा संकेत को प्रभावित करती है कि कीमत के साथ आता है.

    कोशिकाओं के लिए छोटे माप वर्तमान के आवेदन ECIS माप, noninvasive nondestructive, और लेबल से मुक्त करता है, लेकिन एक परिणाम के रूप में केवल निष्क्रिय bioelectrical गुण (कोई कार्रवाई क्षमता) मापा जा सकता है. एक प्रमुख विशेषता मानकों की एक संख्या डेर हो सकता है पारगम्यता या घाव भरने assays जैसे कई शास्त्रीय assays, से जानकारी के संयोजन, एक ही माप से ived. यहाँ विशेष दिलचस्प पहलू गणितीय मॉडलिंग की डेटा प्रतिरोध और समाई में परिवर्तन का पता लगाने और विशिष्ट सेलुलर संरचनाओं (जैसे सेल संपर्कों या कोशिका झिल्ली) के लिए उन्हें उल्लेख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नोट करना महत्वपूर्ण प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी हमेशा एकल कक्षों पर अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं और यह भी गणितीय मॉडल मिला हुआ सेल परतों में ही वैध है जो नहीं करता है संवेदन इलेक्ट्रोड, पर सभी कोशिकाओं से एक औसत का संकेत देता है. इसलिए endothelial कोशिकाओं से पहले परिपक्व सेल adhesions और मौन कोशिकाओं सुनिश्चित करने के लिए मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल कम से कम एक दिन के लिए मिला हुआ राज्य में आयोजित किया जाना चाहिए. समान रूप से, बिजली के घाव केवल इष्टतम लोग घायल हो गए दक्षता प्राप्त करने और इलेक्ट्रोड की क्षति को रोकने के लिए, उच्च आवृत्तियों के साथ कई छोटे लोग घायल हो गए दालों का उपयोग सेल परतों मिला हुआ करने के लिए लागू किया जाना चाहिए.

    jove_content "> हर परख में, इस तरह के व्यक्तिगत सेल प्रकार के लिए सरणी सब्सट्रेट, कोटिंग और बोने घनत्व के संयोजन के रूप में कई मापदंडों के एक प्रयोग से पहले परीक्षण किया है और अनुकूलित करने की आवश्यकता के रूप में, एक ECIS माप से जानकारी की अधिकतम राशि प्राप्त करने के लिए.

    ECIS का एक प्रमुख सीमा माप आणविक स्तर पर प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान नहीं करता है. इस प्रकार ECIS माप सेलुलर संरचनाओं या गुणों के साथ एक वैज्ञानिक समस्या सहयोगी की मदद और एक परीक्षण योग्य परिकल्पना की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण इनपुट प्रदान करने के लिए एक प्रायोगिक श्रृंखला की शुरुआत में आमतौर पर सबसे जानकारीपूर्ण हैं. इसलिए ECIS की मॉड्यूलर डिजाइन दर्जी सरणियों के लिए संभावना के साथ आवेदन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम उपलब्ध कराता है. नवीनतम सरणी घटनाक्रम सेल प्रसार और विद्युत लोग घायल हो गए के लिए उच्च throughput प्रतिबाधा स्क्रीनिंग पर एक भविष्य ध्यान केंद्रित करने और इन विवो के अनुकरण के लिए विशेष प्रवाह सरणियों के अग्रिम संकेत मिलता है

    इसके अलावा साहित्य
    भी आवेदन नोट, webinars और पूरे ECIS स्पेक्ट्रम कवर प्रकाशनों की एक विस्तृत सूची के लिए एप्लाइड बायोफिज़िक्स के वेबपेज (www.biophysics.com) को देखें.

    Disclosures

    संरचना और लेख की सामग्री लेखकों की पूरी जिम्मेदारी बने रहे जबकि एप्लाइड बायोफिज़िक्स इंक, खुले उपयोग शुल्क को कवर किया.

    Acknowledgements

    लेखकों, उनकी सलाह के लिए डॉ. चार्ल्स Keese, डॉ. क्रिश्चियन Renken, ईसाई Dehnert (एप्लाइड बायोफिज़िक्स इंक) और डा. Ulf Radler (Ibidi GmbH) का शुक्रिया अदा करना मदद और इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान उपयोगी विचार विमर्श होगा. इसके अलावा हम अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जनवरी वैन Bezu धन्यवाद देना चाहूंगा.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ECIS Zθ Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E Lexan Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W10E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    L-Cystein Merck Millipore 102838
    Gelatin Merck Millipore 104070
    Bovine Thrombin Merck Millipore 604980
    Albuman (Human Serum Albumin) Sanquin
    Y-27632 Tocris Biosciences 1254
    EGM-2 BulletKit  Lonza CC-3162
    Pen/Strep Lonza 17-602E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    1 Comment

    1. The video is not working before procedure discription.

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      Posted by: Atiya S.
      August 31, 2015 - 2:16 PM

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