פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tolonen, A. C., Haas, W. Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (89), e51416, doi:10.3791/51416 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תיוג איזוטופ היציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא שיטה לכמת במדויק הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה. תיוג רדה מבוצע באמצעות אחת רגיל (אור) או בצורות deuterated (כבדות) של cyanoborohydride פורמלדהיד ונתרן להוסיף שתי קבוצות מתיל לכל אמין בחינם. כאן אנו מדגימים פרוטוקול חזק לתיוג רדה והשוואה כמותית של תערובות חלבונים מורכבות. דגימות חלבון לשם השוואה מתעכלים לפפטידים, שכותרתו לשאת אור או תגי תיל כבדים, מעורב, ושיתוף נותח על ידי LC-MS/MS. שכיחותם חלבון יחסית הן לכמת על ידי השוואת אזורי שיא הכרומתוגרמה יון של גרסאות כבדות וקלות שכותרת של הפפטיד המכונן שחולץ מן MS הספקטרום המלא. השיטה המתוארת כאן כוללת הכנת מדגם על ידי מיצוי שלב מוצק התהפך שלב, תיוג רדה על הטור של פפטידים, חלוקה פפטיד ידי Rev-pH הבסיסיכרומטוגרפיה ersed-שלב (BPRP), וטיהור פפטיד StageTip. אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של תיוג רדה ביחס לשיטות אחרות לשילוב איזוטופ יציב. אנו מדגישים יישומי רומן באמצעות תיוג רדה כשיטת מהירה, זולה, ומדויקת כדי להשוות שכיחותם חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

Introduction

מדידת הבדלי ריכוז של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות היא אתגר מרכזי בפרוטאומיקה. יותר ויותר, זה נעשה על ידי תיוג חלבונים בכל דגימה עם תגי איזוטופים שונים, המשלב דגימות, ובאמצעות ספקטרומטריית מסה לכמת הבדלי ריכוז. מספר שיטות קיימות לתיוג איזוטופי יציב של חלבונים ופפטידים. 15 N תיוג 1 וSILAC 2 להציג תוויות איזוטופי מטבולית in vivo, ואילו 3 ICAT, 4 iTRAQ, וdimethylation ההפחתה 5 להוסיף תגיות איזוטופ יציבים לאחר מיצוי חלבון ועיכול. בין השיטות הללו, dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא צובר פופולריות כמו שיטה זולה, לשחזור לכמת הבדלי ריכוז חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

תיוג רדה כרוך פפטידים מגיבים עם פורמלדהיד כדי ליצור בסיס שיף, אשר לאחר מכן מצטמצםעל ידי cyanoborohydride. תגובה זו dimethylates קבוצות אמינו חופשיות ברשתות N-Termini והצד ליזין וmonomethylates prolines N-מסוף. הפרוטוקול המתואר כאן methylates פפטידים במדגם 1 עם תווית "קלה" באמצעות ריאגנטים עם אטומי מימן בתפוצתם הטבעית איזוטופי ומדגם 2 עם תווית "כבדה" באמצעות פורמלדהיד deuterated וcyanoborohydride (איור 1). כל קבוצת אמין dimethylated על תוצאות פפטיד בהבדל המוני של 6.0377 דה בין אור וצורות כבדות, אשר מועסקות להבחין בין שתי צורות באמצעות ספקטרומטר מסה. באופן ספציפי, שכיחותם היחסית פפטיד הן לכמת כיחס בין אזורי הכרומתוגרמה יון MS1 חילוץ (יחס אזור שיא MS1) של אור והגרסה כבדה לכל זוג יונים פפטיד. השפע היחסי של חלבון מחושב כיחס אזור שיא MS1 החציוני בין כל פפטידים בחלבון. בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול חזק על התנהגותing ניסויי תיוג רדה ידי LC-MS/MS הכולל חילוץ התהפך שלב פפטיד מוצק שלב, תיוג רדה על עמודות, חלוקה פפטיד על ידי pH הבסיסי התהפך שלב כרומטוגרפיה (BPRP), וטיהור של תערובות הפפטיד באמצעות StageTips (איור 2) . אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של שימוש בתיוג רדה לפרוטאומיקה כמותית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: שיטה זו תוארה 12 בעבר.

1. בידוד חלבון

הכן 1 מ"ג של חלבון תאי על ידי תאי lysing, רצוי בשיטות פיזיות, כגון עיתונות צרפתית, מכות חרוז, או sonication. הימנע תמוגה תא בתיווך ליזוזים כי האנזים לבלבל מדידות ספקטרומטריית מסה.

2. רטיבות TCA של חלבונים

הוספת חומצת 1 נפח trichloroacetic (TCA) לחלבון 4 כרכים ומקררים על קרח דק 10 כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של אצטון קר כקרח וצנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולהפוך את הצינור על הספסל כדי לייבש את גלולה ל15 דקות. כדורי חלבון חנות ב -80 ° C.

3. חלבונים לפגל וצמצום חוב דיסולפיד

Reלהשעות את החלבונים ל~ 2 מ"ג / מיליליטר ב500 denaturation μl וחיץ ירידה (או אוריאה 4 M או 3% SDS ב50 HEPES מ"מ pH 8.5, 5 מ"מ DTT). לחלופין, כולל מעכבי פרוטאז במאגר. דגירה חלבונים ל30 דקות ב56 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות בטמפרטורת חדר.

4. Aklylate קבוצות sulfhydryl חינם לשבש גיבוש דיסולפיד בונד באופן בלתי הפיך

הכן iodoacetamide 0.3 M הטרי במים. זהירות! Iodoacetamide הוא רעיל ביותר. הוסף 25 μl 0.3 M iodoacetamide (ריכוז סופי 15 מ"מ) ל500 חלבון μl ודגירה של 20 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. להרוות iodoacetamide ידי הוספת 10 μl של 300 מ"מ DTT (5 מ"מ ריכוז DTT סופי). אחסן את חלבוני alkylated ב -80 ° C.

5. עיכול חלבון

TCA לזרז חלבונים (כפי שמתואר בשלב 2) ו resuspend ב 1 מיליליטר של 50 HEPES מ"מ (pH 8.2), האוריאה ז 1. הכן פתרון מניות של endoprotein LysylASE (יס-C) במים בריכוז של 2 מיקרוגרם / μl ולהוסיף 5 μl לפתרון החלבון. דגירה את התערובת ל16 שעות בטמפרטורת חדר. להבטיח את הריכוז ליס-C הסופי הוא 10 ng / μl ויחס חלבון לLysC (w / w) הוא 1/50 עד 1/200. Resuspend 20 טריפסין הכיתה רצף מיקרוגרם ב40 μl של 50 מ"מ חומצה אצטית, להוסיף 5 μl (10 מיקרוגרם טריפסין) כדי לעכל יס-C, ודגירה במשך 6 שעות ב 37 ° C. להשתמש באותו ריכוז פרוטאז ויחסי פרוטאז לחלבון ליס-C כמשמש לטריפסין.

6. הפוך שלב פפטיד הפקה

  1. להפוך לחומצת פפטידים על ידי הוספת חומצת trifluoroacetic (TFA) לריכוז סופי של .0.5% (pH ≈ 2). צרף עמודת C18 לסעפת חילוץ. השתמש בקצב הזרימה הגבוה ביותר האפשרי עבור כל השלבים מלבד טעינה וelution של פפטידים.
  2. עמודה רטובה עם אצטוניטריל מיליליטר 6 (ACN). לשטוף טור עם 6 מיליליטר 80% ACN, TFA 0.1%, ולאחר מכן לאזן עם 6 מיליליטר 0.1% TFA. אל תאפשרעמודה לרוץ יבש בין שלבים.
  3. תפסיק לחץ ואקום ולטעון 500 מיקרוגרם של פפטידים על הטור בקצב זרימה של כ 1 מיליליטר / דקה. ברגע שפפטידים שנקשרים לעמודה, הוואקום מחדש ולשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA, ולאחר מכן עם 3 מיליליטר של חיץ חומצת לימון (0.09 M חומצת לימון, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5).
    שים לב: יכולות להיות מתויגות כמויות פפטיד גבוהות אבל טור C18 מחייב קיבולת צריך להיות לפחות פי שתיים גבוהים יותר מכמות פפטיד כדי למנוע אובדן מדגם.

7. בעמודת פפטיד תיוג ידי Reductive Dimethylation (רדה תיוג)

לבצע שלב זה מתחת למכסת מנוע כימי כמו המימן ציאניד הוא שוחרר בריכוז נמוך במהלך תהליך התיוג.

  1. הכן 12 מיליליטר של ומאגרי "אור", "כבדים" רדה לmethylate אמינים פפטיד בחינם. חיץ רדו אור מורכב מפורמלדהיד 0.8% ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן נשא מימנים בההפצות EIR טבעיות איזוטופי במאגר חומצת לימון. חיץ רדה כבד מורכב מ0.8% פורמלדהיד deuterated ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן deuterated במאגר חומצת לימון.
  2. דגירה עמודה המכילה פפטידים על ידי הוספת 10 מיליליטר בהיר או חיץ רדה כבד לעמודות המכיל פפטיד בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה וחזור על מנת להבטיח תיוג מלא. טור לשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 0.5% חומצה אצטית.
  3. תפסיק ואקום וelute פפטידים שכותרתו ראשון עם 1 מיליליטר 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית באמצעות קצב זרימה של כ 0.5 מיליליטר / דקה. אם תרצה, למדוד את יעילות התיוג של דגימות בודדות על ידי ספקטרומטריית מסה לפני הערבוב כבדה וקלות דגימות (ראה "נציג תוצאות"). מערבבים 01:01 דגימות פפטיד כבדות ושכותרתו אור כדי לכמת על ידי ספקטרומטריית מסה.

8. תערובת פפטיד נפרדת בשלב הבסיסי pH הפוך כרומטוגרפיה (BPRP) </ P>

pH הבסיסי התהפך כרומטוגרפיה שלב (BPRP) להפריד את תערובת פפטיד לשברים מרובים, אשר מנותחים באופן עצמאי על ידי LC-MS/MS להגדיל את כיסוי proteome.

  1. Fractionate תערובת פפטיד על עמודת C18-HPLC ידי יישום הדרגתי של ריכוז ACN גובר ב10 מ"מ אמוניום ביקרבונט (pH 8). התחל עם 5% (v / v) ACN למשך 5 דקות, להגביר 35% ACN ב60 דקות, ולאחר מכן ל90% ACN בדקות 1. לשמר את ACN 90% למשך 4 דקות לפני הפחתת ACN עד 5% מחדש לאזן את העמודה במשך 9 דקות. לאסוף 96 שברים של נפח שווה בצלחת 96 היטב (A1 לH12). לפקח על חלוקה באמצעות גלאי UV ב220 ננומטר ואילו פפטידים משחררי את הטור (10-70 דקות לתנאים שתוארו כאן).
  2. שלב את השברים מבארות A1, C1, E1, ו-G1 (A1 שבריר), מB1 בארות, D1, F1, וH1 (B1 שבריר), מבארות A2, C2, E2, ו G2 (A2 שבריר) ובהתאם ל שברים שנותרו. הסר את solvenלא באמצעות צנטריפוגות ואקום. פפטידים resuspend משברי A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, ו-B12 ב130 μl של 1% urea/0.5 M TFA ולטהר באמצעות StageTips כמתואר בשלב 9. חנות שברים B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, וA12 ב -20 º C.

9. לטהר פפטידים על ידי להפסיק וללכת חילוץ (StageTips)

הכן 7 microcolumns C18-StageTip ידי אריזת 200 טיפים פיפטה μl עם שני C18 דיסקים עם קוטר פנימי (ID) של 1.07 מ"מ. שים טיפים שלב לתוך צינורות Eppendorf. השתמש microcentrifuge לשטוף טיפים עם 130 μl של מתנול, ולאחר מכן 130 80% ul ACN, 0.5% חומצה אצטית. לאזן StageTips עם 130 μl 0.1% TFA. העבר את תערובת פפטיד לStageTips ולשטוף עם 130 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.5% חומצה אצטית. Elute פפטידים ראשון עם 20 μl 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, אז 20 μl 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית. שלב eluatesnd יבש על ידי סינון ואקום.

10. LC-MS/MS microcapillary

  1. ממיסים פפטידים ב1-5 μl 5% חומצה פורמית, 5% ACN לריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl. לפתור ~ 1 מיקרוגרם פפטידים על 100 מיקרומטר × 20 סנטימטר עמודת HPLC שלב עם שיפוע של 6-22% ACN ב0.125% חומצה פורמית, התהפך C18 להחיל על 75 או 100 דקות בקצב זרימה של ~ 300 / דקות NL.
  2. לזהות פפטידים באמצעות LTQ Orbitrap ולוס 12 או פלטפורמה דומה נוזל כרומטוגרפיה מסת ספקטרומטריית עם ספקטרומטר מסת מתן ברזולוציה גבוהה ודיוק מסה גבוה. הפעל את ספקטרומטר מסת נתונים במצב תלוי עם מלאה MS סריקה (ברזולוציה של 60,000) שנרכשה במנתח Orbitrap. ליצור מלכודת היונים יניארי MS / MS ספקטרום ל20 יונים הנפוצים ביותר שזוהו בספקטרום MS המלא. הגדרת שליטה אוטומטית מטרות (AGC) עד 1 x 10 6 עבור MS המלא ו -2,000 עבור MS / MS. הגדר פעמים הצטברות יון המרביות ל1,000 אלפיות שנייםלטרשת נפוצה ו150 msec עבור MS / MS. תכלול יונים מבשר פפטיד מקוטעים מבחירה נוספת מ-MS / MS ל20-60 שניות.

11. MS / MS רכישת נתונים

לזהות פפטידים על ידי השוואת קבצי RAW MS / MS ספקטרום למסד נתונים תיאורטי עם אלגוריתם כגון SEQUEST 8 שימוש בפרמטרים (טבלת 1).

טבלה 1. חיפוש פרמטרים למסד פפטיד.

פרמטרים כלליים עיכול tryptic באופן מלא עם עד 2 החמיץ שסעים
25 סובלנות יון מבשר עמודים לדקה
1.0 סובלנות יון שבר דה
שינויי סטטי 57.02146 דה בציסטאין, carboxyamidomethylation
28.03130 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation אור
שינויים דינמיים 15.99491 דה במתיונין, חמצון
6.03766 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation כבדה
  1. פפטידים מסנן כדי 1% שיעור גילוי שווא עם שיטה כגון אסטרטגית 9 יעד דמה באמצעות מסד נתונים של מסגרות קריאה פתוחות באורינטציות בפועל והתהפכו.

12. פפטיד כימות

לחשב את התחומים כבדים וקלים זוגות MS1 חילוץ יון chromatograms (אזורי שיא MS1) ויחסי פפטיד אות לרעש (S / N) 10. כוללים זוגות פפטיד רק כאשר ממוצע אות לnoiיחס se הוא מעל חמש. לכמת שפע יחסי של פפטיד בשתי דגימות כיחס בין אזורי שיא של MS1 כבדים וקלות גרסאות של אותו פפטיד (יחס אזור שיא MS1). חישוב שכיחות חלבון יחסי כיחס אזור שיא MS1 החציוני לפפטידים בחלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכנו את הדיוק, הדיוק, ושחזור של תיוג רדה באמצעות שמר האפייה וClostridium phytofermentans lysates תא כולו. אנו לכמת את יעילות התיוג רדה מתערובת של ג הראשון phytofermentans lysates חלבון מתאי (שכותרתו כבדה, H) וגלוקוז (תווית אור, L) תרבויות. כאשר מסונן לשיעור גילוי 1% פפטיד שווא, מדגם זה הכיל 11,194 רצפי פפטיד ייחודיים עם 98% יעילות תיוג רדה. Unfractionated ס lysate חלבון cerevisiae היה שכותרתו באופן דומה עם חומרים כימיים H או L, מעורב ביחסים שונים, ונותח. הבדלי ביטוי חלבון (log 2 אזורי שיא (חציון MS1)) reproducibly משקף את היחס שבו דגימות H ו-L היו מעורבות במגוון רחב של ערבוב יחסים (איור 3). באופן ספציפי, מתקפל השינוי של 99% מהחלבונים נמדדו כמו להיות קטנים יותר מאשר 1.6 קיפול ל1:01 דגימות מעורבות. בתוך1:10 ו 10:01 הדגימות, 99% מחלבונים היו בתוך 3.8 קיפול של היחס הצפוי, המראים עלייה בסטיית התקן במרחק גדול יותר מתערובת 1:1. כאשר תיוג רדה היה מוחל על proteome phytofermentans Clostridium, אנו לכמת יותר מ 2,000 חלבונים עם חלבוני 94% שנמדדו ברמות של פי 2 לתרבויות לשכפל גדלה על גלוקוז (איור 4 א). חלבון להתקפל שינויים לזוגות כפולים של תרבויות (גלוקוז לעומת תאית) גם היו בקורלציה גבוהה (r 2 = 0.82), (איור 4). ס השוואות cerevisiae (איור 3) הן מתרבות אחת ובכך להראות שחזור טכני של פרוטאומיקה כמותיים המבוססת רדה. ג מדידות phytofermentans (איורים 4 א ', ב') להשוות לשכפל תרבויות כל כך הבדלי ביטוי מייצגים גם טעות המדידה ווריאציה ביולוגית בין תרבויות. יחד, ניסויים אלהמפעלים תומכים שפרוטאומיקה רדה היא שיטה מדויקת ולשעתק לכמת הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות מורכבות.

איור 1
איור 1. Dimethylation Reductive של פפטידים באמצעות כבדים וקלים ריאגנטים לdimethylate אמינים בחינם. יש אותו פפטיד שכותרתו עם כבד לעומת ריאגנטים אור מעבר המוני דה 6.0377 לאמינים בחינם. פפטיד שמוצג כאן הוא שכותרתו הן בN-סופית ועל שרשרת צד ליזין. תמונה המותאמת מ11 הפניה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סקירה כללית של פרוטוקול לפרוטאומיקה כמותית על ידי dimethylation רדוקטיבי. מספרים אדומים מעל החצים מתאימות לשלבים המתוארים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הערכה של תיוג רדה באמצעות Saccharomyces lysates תא השלם cerevisiae. דוגמאות מתרבות אחת תויגו עם או כבד (H) ואור ריאגנטים (L), מעורבים ביחסים שונים (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1 ליטר, ו 10H: 1 ליטר), והבדלים בין דגימות חלבון H ו-L היו לכמת כיחס אזור שיא יומן 2 חציון MS1 (log 2 יחס H / L). R הערך של קו מגמה ליניארי 2 עד כל הנתוניםנקודות היו 0.96 (קו שחור); מתאם פירסון היה 0.98. גבולות ביטחון (קווים אדומים) להראות את המרחק בניצב המוחלט מקו המגמה שבמסגרתו 95% מנקודות נתונים נמצאו עבור כל דגימה. תמונה המותאמת מ12 הפניה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
Clostridium איור 4. כימות רדו כותרת phytofermentans חלבונים מתרבויות הולכות וגדלה של מקורות פחמן שונים. א) ביטוי חלבון ברמת סוכר בתרבות ביחס לתרבות גלוקוז לשכפל, תרבות hemicellulose, ותרבות תאית. את החלק היחסי של חלבונים המתבטאים ברמות כפולה: גלוקוז גלוקוז (94%), גלוקוז hemicellulose (80%), וglucosדואר תאית (49%). ב ') מקפלים שינויים בביטוי חלבונים לגלוקוז לעומת תרבויות תאית מתואמים מאוד (r 2 = 0.82) לזוגות כפולים של תרבויות. תמונות הותאמו מ 12 הפניה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמה נקודות לעשות תיוג איזוטופ יציב של פפטידים באמצעות dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) שיטה אטרקטיבית לפרוטאומיקה כמותיים: ריאגנטים זולים תיוג (ריאגנטים עולים פחות מ 1 $ לדגימה), קצב תגובה מהיר (10 דקות ~), היעדר מוצרי לוואי, גבוהים שחזור (איורים 3, 4), תוצרי תגובה יציבה, יכולת להשתמש בכל פרוטאז, ויעילות גבוה יינון של פפטידים שכותרתו. תיוג כימי על ידי רדה הוא גם יתרון יחסי לתיוג מטבולית שכן הוא אינו דורש זנים או שורות תאים עם auxotrophies ספציפי חומצת אמינו או צמיחה על מדיום סינטטי. ככזה, ניתן ליישם רדו לכמעט כל סוג של מדגם חלבון כוללים חיידקים רומן 12 שלכמה זנים מוטנטים זמינים 13 ותאי גזע אנושיים 14, בין יתר 15.

הגבלה של תיוג רדה היא יכולת נמוכה יותר זמנית דגימות יחסית לotשיטותיה כגון תיוג isobaric (למשל, iTRAQ או TMT), שעבורו כרגע עד 8 ​​דגימות יכולות להיות בו זמנית לכמת 16. השיטה שאנו מתארים כאן מאפשרת השוואת כמותית של שתי דגימות שכותרתו דיפרנציאלי. שילובי איזוטופים נוספים של פורמלדהיד וcyanoborohydride יכולים לשמש לייצור של עד 3 תוויות שונות על ידי לפחות 4 דה 17 ולאחרונה תיוג רדה הורחב 5 דגימות מרובבות 18. אתגר נוסף של תיוג רדה הוא שפפטידים deuterated elute מעט לפני אור אלה בעת השימוש בכרומטוגרפיה התהפך שלב. כדי לשלוט על "אפקט דאוטריום" הזה, כימות פפטיד תמיד צריך להיות מבוסס על הכרומתוגרמה כל חילוץ יון (אזור שיא MS1) במקום עוצמות מסריקה אחת.

פרוטאומיקה רדה הפרוטוקול המתואר כאן כולל שיפורים רבים 11,15,17 נעשו מאז התיאור הראשון של תיוג דימתיל ההפחתהשל פפטידים לספקטרומטריית מסה 5. תארנו שיטה "בטור" תיוג כדי לאפשר כמויות פפטיד גבוהות יותר ויעילות התיוג יכולים להיות מאומתת לפני ערבוב מדגם, אבל "בפתרון" ושיטות תיוג "מקוונות" קיימים גם 19. בנוסף לכימות proteome, תיוג רדה מיושם לקביעת איזופורם 20 ויכול להיות משולב עם שיטות אחרות לניתוח שלאחר translational שינויים כגון זרחון acetylation 11,18 21, וglycosylation 22. בגלל הרבגוניות שלו וכימיה זולה, כמוני, תיוג רדו ייושם יותר ויותר לפרוטאומיקה כמותיים בדרכים חדשות ומרגשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T9159 protein precipitation
Acetone Sigma-Aldrich 650501 protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71736 denature, reduce protein
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43816 denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail Roche 4693124001 denature, reduce protein
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 alkylate protein
HEPES Sigma-Aldrich H7523 resuspend, extract, label protein
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 resuspend protein
Lysyl Endoprotease Wako Chemicals 129-02541 protein digestion
Sequencing grade trypsin Promega V5111 protein digestion
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 protein digestion
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges Waters WAT054960 Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold Waters WAT200609 Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile Sigma-Aldrich 14261 various
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 “light” peptide labeling
Cyanoborohydride Sigma-Aldrich 71435 “light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde Sigma-Aldrich 492620 “heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride CDN isotopes D-1797 “heavy” peptide labeling
MES Sigma-Aldrich M3671 peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) Agilent 770450-902 basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid Sigma-Aldrich 399388 various
C18 Empore Disks 3M 14-386-3  STAGE tips
Methanol Sigma-Aldrich 494437 STAGE tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74, (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1, (5), 376-386 (2002).
  3. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17, (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75, (24), 6843-6852 (2003).
  6. Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7, (3), 1036-1045 (2008).
  7. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75, (3), 663-670 (2003).
  8. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5, (11), 976-989 (1994).
  9. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4, (3), 207-214 (2007).
  10. Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7, (11), 4756-4765 (2008).
  11. Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). (2013).
  12. Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
  13. Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74, (6), 1300-1313 (2009).
  14. Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
  15. Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404, (4), 991-1009 (2012).
  16. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  17. Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, (22), 4624-4632 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). (2014).
  19. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  20. She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12, (3), 369-379 (2012).
  21. Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12, (7), 3277-3287 (2013).
  22. Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84, (20), 8452-8456 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics