प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय Dextramers का उपयोग कर मस्तिष्क और दिल में autoreactive CD4 टी कोशिकाओं सीटू का पता लगाने में

Immunology and Infection

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Summary

प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय dextramers के साथ सीधे धुंधला द्वारा मस्तिष्क और हृदय में आत्म - प्रतिक्रियाशील CD4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल इस रिपोर्ट में वर्णित किया गया है. व्यापक विश्लेषण के लिए, बगल में प्रतिजन विशेष सीडी 4 + टी कोशिकाओं की आवृत्तियों गणना करने के लिए एक विश्वसनीय विधि भी तैयार कर लिया है.

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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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Abstract

Introduction

प्रमुख उतक अनुरूपता परिसर का उपयोग प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए (MHC) वर्ग द्वितीय tetramers एक चुनौती 1-7 कर दिया गया है. MHC वर्ग द्वितीय tetramers का पता लगाने संवेदनशीलता को बढ़ाने, अनुसंधान दल नामित अगली पीढ़ी tetramers, "dextramers" 8 पैदा कर दी है. Dextramers ऐसे कई पेप्टाइड सीमित, biotinylated MHC monomers एक dextran अणु 9 से जुड़ा हो सकता है कि कई streptavidin-फ्लोरोफोरे moieties संयुग्मित जिसमें dextran अनिवार्य जरूरतों, होते हैं. इस प्रकार, कई MHC-पेप्टाइड परिसरों होते हैं कि MHC dextramers के बड़े समुच्चय कई टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) के साथ बातचीत कर सकते हैं.

इस समूह ने हाल ही में विभिन्न स्वयं एंटीजन के लिए dextramers उत्पन्न और dextramers का पता लगाने संवेदनशीलता लगभग tetramers 8 से अधिक पांच गुना था कि प्रदर्शन किया. प्रायोगिक प्रणाली प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस शामिल (ईएई) proteolipid प्रोटीन (पीएलपी) SJL चूहों में 139-151 से प्रेरित; EAE माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) C57BL 6 / चूहों में 35-55 से प्रेरित; और प्रयोगात्मक autoimmune मायोकार्डिटिस (विदेश मंत्री) हृदय मायोसिन भारी श्रृंखला-α (Myhc) ए / जम्मू चूहों में 334-352 के साथ प्रेरित किया. इस अध्ययन पीएलपी 139-151 के उपयोग को दर्शाता है -, और Myhc 334-352 जिससे fluorophore एंटीबॉडी का उपयोग करने से संकेत बढ़ाना नष्ट करने की जरूरत है, एक प्रत्यक्ष धुंधला प्रोटोकॉल विकसित करके विशिष्टता के साथ बगल में प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए dextramers एक दृष्टिकोण आमतौर tetramers के उपयोग के साथ कार्यरत हैं. इसके अलावा, ऊतकों के मूल्यांकन के लिए एक व्यापक विधि भी मज़बूती से सीटू 10 में प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्तियों गणना करने के लिए तैयार किया गया है. बगल में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाने दर्शक सक्रियण की वजह से उन से विशिष्ट प्रतिजनी उत्तेजनाओं की वजह से घटनाओं का चित्रण परमिट. इसी तरह, में सीटू तकनीक भी प्रदान करतालक्ष्य अंगों में प्रतिजन विशेष टी सेल घुसपैठ की कैनेटीक्स ट्रैक करने के लिए तों अवसरों.

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Protocol

आचार विवरण:

सभी पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित की और नेब्रास्का के लिंकन, लिंकन, पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.

EAE की 1. प्रेरण

  1. 1.1 कदम: EAE प्रेरित करने के लिए निम्न संशोधनों के साथ 11 में वर्णित के रूप में पेप्टाइड / पूरा Freund के सहायक (सीएफए) पायस तैयार करते हैं. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में पीएलपी 139-151 तैयार कदम 1.4:. पशु प्रति पीएलपी 139-151 की 100 ग्राम युक्त सीएफए पायस के 200 μl उपयोग 1.4.1 कदम:, दस पशुओं को पोलियो 1 पीएलपी 139-151 मिलीलीटर (1 मिलीग्राम / एमएल में 1x मिश्रण द्वारा पायस के 2 मिलीलीटर तैयार करने के लिए . पीबीएस) और सीएफए के एक बराबर मात्रा 1.5 चरण: दो वंक्षण क्षेत्रों (~ 75 μl प्रत्येक) और पांच से छह सप्ताह पुराने के sternal क्षेत्र (~ 50 μl) में subcutaneously विभाजित खुराकों में पायस की 200 μl इंजेक्षन विदेशी मुद्रा प्रबंध अधिनियमLe SJL / जम्मू चूहों. 1.7 और 1.8 EAE के शामिल होने के लिए लागू नहीं कर रहे कदमों.

EAE चूहे और Cerebrums की फसल काटने की 2. क्लीनिकल स्कोरिंग

  1. नैदानिक ​​लक्षण की उपस्थिति के लिए जानवरों पर नजर रखने, और के रूप में दिन 9 postimmunization से दैनिक रोग की गंभीरता स्कोर: 0 - स्वस्थ; 1 - पूंछ या पिछले अंग कमजोरी लंगड़ा, लेकिन दोनों नहीं; 2 - पूंछ और पिछले अंग कमजोरी लंगड़ा; 3 - हिंद अंग का आंशिक पक्षाघात; 4 - हिंद अंग की पूरी पक्षाघात; 5 - मरणासन्न या 12 मृत.
  2. वे सीओ 2 का उपयोग 3 या 4 के एक स्नायविक स्कोर तक पहुँचने जब ​​चूहों euthanize. चूहों euthanize करने के लिए, नहीं 6 साई से अधिक सीओ 2 टैंक की नियामक बदल कर सीओ 2 के साथ पहली इच्छामृत्यु चैम्बर पूर्व भरना और जानवरों पूरा दम घुटना प्राप्त करने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए कक्ष के भीतर रहने के लिए अनुमति देते हैं. 70% शराब में euthanized जानवरों भिगोएँ. इसके तत्काल बाद, एक शोषक पैड पर जानवरों जगह और के लिए बाँझ की एक जोड़ी का उपयोगCEPS और कैंची वक्ष गुहा के माध्यम से कटौती करके दिल बेनकाब. सही अलिंद पंचर और दिल के बाएं निलय में ठंड 1x पीबीएस के 10 एमएल इंजेक्शन द्वारा छिड़कना.
  3. घुमावदार कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर एक परिपत्र फैशन में कपाल snipping द्वारा खोपड़ी खुदाई, और ध्यान से, संदंश के साथ खोपड़ी की हड्डियों फ्लिप. विच्छेदन ब्लंट और एक स्वच्छ स्केलपेल, सेरिबैलम से अलग मस्तिष्क का उपयोग कर मस्तिष्क हार्वेस्ट. ठंड 1x पीबीएस युक्त ट्यूब में मस्तिष्क प्लेस और प्रसंस्करण तक बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें.

3. MHC वर्ग द्वितीय (आइए एस) / पीएलपी 139-151 Dextramers साथ सेरेब्रल धारा सीटू धुंधला में

  1. 4% पीबीएस बफर कम पिघलने agarose, 50 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से पिघला और उपयोग करें जब तक एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में छोड़ तैयार करते हैं.
  2. एक डिस्पोजेबल गहरी आधार ढालना ऊतक विज्ञान कैसेट में मस्तिष्क जगह बर्फ पर रखा है, और पिघला हुआ (40 डिग्री सेल्सियस) agarose डालना. इसके तत्काल बाद, धीरे मस्तिष्क प्रेससंदंश ऊतक डूब के साथ. Solidification पूरा हो गया है जब तक 15-20 मिनट के लिए बर्फ पर कैसेट छोड़ दें.
  3. ठंडा 1x पीबीएस के साथ vibratome स्नान भरें. 0 और 2 के बीच पीबीएस का तापमान बनाए रखने के लिए बर्फ घन के साथ vibratome स्नान के चारों ओर अंतरिक्ष भरें डिग्री सेल्सियस Vibratome में एक स्वच्छ धार फिक्स और 15 डिग्री के लिए ब्लेड कोण सेट.
  4. Vibratome में ऊतक के स्थान. एम्बेडेड ऊतक के सभी पक्षों से अतिरिक्त agarose ट्रिम और थोड़ा मस्तिष्क के उदर सतह बेनकाब.
    1. सुपर गोंद के साथ vibratome ऊतक ब्लॉक धब्बा और अनुप्रस्थ सेक्शनिंग के लिए गोंद से अधिक मस्तिष्क के संपर्क में उदर सतह रखकर चिपके सतह पर agarose एम्बेडेड ऊतक स्थानांतरण. ऊतक खंड पर सेट किया जाता है, एक बार ऊतक कदम नहीं है.
    2. बर्फ पर agarose एम्बेडेड ऊतक युक्त vibratome ब्लॉक, जगह और गोंद 15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
  5. इस बीच, ऊतक चाम जगह24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक Bers. ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ ऊतक कक्षों युक्त कुओं भरें, और बर्फ पर थाली छोड़ दें.
    1. एक पतली नायलॉन सुपर गोंद का उपयोग कर एक 25 मिलीलीटर polypropylene पिपेट की कटौती समाप्त करने के लिए जाल संलग्न द्वारा ऊतक कक्षों तैयार करें; पिपेट के आसपास अतिरिक्त जाल trimming के बाद, जाल से 1 सेमी की लंबाई के लिए पिपेट काटा.
  6. ऊतक के ऊपर की सतह के स्तर पर vibratome ब्लेड कम; 0.22 मिमी / सेकंड vibratome गति सेट और 200 माइक्रोन मोटी वर्गों बनाने के लिए एक आगे आंदोलन के साथ सेक्शनिंग शुरू करते हैं. अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं के भीतर रखा ऊतक कक्षों में एक पानी के रंग का नरम ब्रश का उपयोग कर प्रति एक प्रमस्तिष्क खंड स्थानांतरण. ऊतक गिरावट को रोकने के लिए पूरा हो गया है जब तक बर्फ पर थाली रखें. नोट: उदर की सतह के लिए मस्तिष्क पृष्ठीय के तीन अलग अलग क्षेत्रों (चित्रा 2) से कुल तीन बनती वर्गों में प्राप्त करने के लिए इन चरणों का पालन करें. से एक अनुभागतीन व्यक्ति ऊतक कक्षों में रखा (कुल तीन वर्गों में) प्रत्येक जोड़ी विशिष्ट dextramers साथ धुंधला करने के लिए नामित (आइए एस / पीएलपी 139-151) और विरोधी सीडी 4 कर रहे हैं. इसी तरह, तीन व्यक्ति ऊतक कक्षों में रखा जाता है कि तीन वर्गों का एक और सेट नियंत्रण dextramers साथ धुंधला करने के लिए नामित कर रहे हैं (आइए एस / TMEV 70-86) और विरोधी सीडी 4.
  7. एक कक्ष के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में तीन कुओं में विशिष्ट dextramers साथ धुंधला प्रति कुएं में लिए नामित वर्गों युक्त तीन ऊतक कक्षों स्थानांतरण, जो allophycocyanin युक्त कॉकटेल के 300 μl (एपीसी) संयुग्मित पीएलपी 139-151 dextramers (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) और विरोधी सीडी 4-phycoerythrin (पीई;) 2% सामान्य बकरी सीरम के साथ समाधान (1x पीबीएस को रोकने में / एमएल 5 ग्राम) पहले से जोड़ा गया है. एक ढक्कन के साथ कुओं को कवर किया.
  8. इसी प्रकार, हम प्रति एक कक्ष के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में तीन कुओं में नियंत्रण dextramers साथ धुंधला करने के लिए नामित वर्गों युक्त तीन ऊतक कक्षों का स्थानांतरणकरूँगा जो में, एपीसी संयुग्मित TMEV 70-86 dextramers (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) और अवरुद्ध समाधान में विरोधी सीडी 4-पीई (5 ग्राम / एमएल) युक्त एक कॉकटेल के 300 μl पहले से जोड़ा गया है. एक ढक्कन के साथ कुओं को कवर किया. नोट: Massilamany का संदर्भ लें एट अल, 8 dextramers की तैयारी, और dextramers कृपया Immudex, कोपेनहेगन, डेनमार्क द्वारा प्रदान किया गया तैयार करने के लिए dextran अणुओं के लिए..
  9. कुओं लेबल, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली लपेटो और आरटी पर अंधेरे में 1.5 घंटे के लिए कोमल घुमाव के लिए सेट एक कमाल मंच पर थाली जगह.
  10. ऊष्मायन अवधि के बाद, अच्छी तरह से ठंड 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त एक ताजा करने के लिए ऊतक कक्षों के हस्तांतरण से, कमाल मंच पर ऊतक वर्गों धो लें और अच्छी तरह से दूसरे में एक की सामग्री ड्रिब्लिंग से बचें. धोने के अनुसार कम से कम 10 मिनट की अनुमति, तीन बार धोने दोहराएँ. वे कक्ष के पक्षों के लिए छड़ी कर सकते हैं के रूप में ऊतक वर्गों सूख नहीं मिलता सुनिश्चित करें.
  11. ऊतक चाम स्थानांतरित करके वर्गों फिक्सकोमल घुमाव के साथ 2 घंटे के लिए एक कमाल मंच पर फ़िल्टर्ड 4% पीबीएस बफर paraformaldehyde (7.4 पीएच) के 1ml युक्त 24 अच्छी तरह से थाली में एक ताजा कुएं में Bers.
  12. कदम 3.10 में वर्णित के रूप में तीन बार धोने दोहराएँ.
  13. एक पानी के रंग का नरम ब्रश का उपयोग कर एक स्वच्छ सूक्ष्म स्लाइड पर दाग और तय वर्गों रखें. अनुभाग को छूने के बिना अतिरिक्त पानी को साफ कर लें, और बढ़ते माध्यम का उपयोग कर खंड माउंट. एक सूक्ष्म coverslip के साथ कवर और स्लाइड अंधेरे कमरे में आर टी ओ / एन में सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकाश प्रूफ स्लाइड भंडारण बॉक्स में स्लाइड्स स्टोर

दिल के विदेश मंत्री और संग्रह के 4. प्रेरण

  1. संदर्भ 11 में वर्णित के रूप में विदेश मंत्री प्रेरित.
  2. सीओ 2 गैस सिलेंडर के साथ फिट स्वच्छ कक्ष का उपयोग 21 दिन postimmunization पर चूहों euthanize और 70% शराब में पशुओं लेना. इसके तत्काल बाद, एक शोषक पैड पर जानवरों जगह और संदंश और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग दिल का पर्दाफाशवक्ष गुहा के माध्यम से काटने के द्वारा है. सही अलिंद पंचर और दिल के बाएं निलय में ठंड 1x पीबीएस के 10 एमएल इंजेक्शन द्वारा छिड़कना. ठंड 1x पीबीएस युक्त ट्यूबों में दिल और जगह ले लीजिए.

5. MHC वर्ग द्वितीय (आइए कश्मीर) / Myhc 334-352 Dextramers साथ हार्ट धारा सीटू धुंधला में

  1. तैयार करें 4% कम पिघलने agarose, 50 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से पिघला और एक 40 में छोड़ पीबीएस बफर   उपयोग करें जब तक सेल्सियस पानी के स्नान °.
  2. बर्फ पर रखा एक डिस्पोजेबल गहरी आधार ढालना ऊतक विज्ञान कैसेट में दिल को रखें, और 3.2 कदम के रूप में वर्णित ऊतकों पूरी तरह से डूबे हुए हैं जब तक agarose पिघला हुआ 40 डिग्री सेल्सियस डालना.
  3. 3.3 कदम का पालन करें.
  4. एम्बेडेड ऊतक के सभी पक्षों से अतिरिक्त agarose ट्रिम और थोड़ा दिल के आधार बेनकाब. सुपर गोंद के साथ vibratome ऊतक ब्लॉक धब्बा और के उजागर सतह रखकर चिपके सतह पर agarose एम्बेडेड ऊतक स्थानांतरणगोंद से अधिक दिल. ऊतक खंड पर सेट किया जाता है, एक बार ऊतक कदम नहीं है.
    1. बर्फ पर agarose एम्बेडेड ऊतक युक्त vibratome ब्लॉक, जगह और गोंद 15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
  5. कदम 3.5 और 3.6 का पालन करें.
  6. 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं के भीतर रखा ऊतक कक्षों में एक पानी के रंग का नरम ब्रश का उपयोग दिल वर्गों स्थानांतरण. ऊतक की गिरावट को रोकने के लिए पूरा हो गया है जब तक बर्फ पर थाली रखें. नोट:, दिल के आधार पर शीर्ष से आठ बनती वर्गों (चित्रा 2) में कुल प्राप्त करने के लिए इन चरणों का पालन करें. चैम्बर प्रति 3 वर्गों के लिए ऊपर का आवंटन, ऊतक कक्षों में सभी वर्गों रखें. (कुल आठ वर्गों में) प्रत्येक जोड़ी से एक अनुभाग विशिष्ट dextramers (आइए कश्मीर / Myhc 334-352) और विरोधी सीडी 4 के साथ धुंधला करने के लिए नामित किया गया है. इसी तरह, आठ वर्गों का एक और सेट नियंत्रण dextramers (आइए कश्मीर / RNase 43-56) और विरोधी सीडी 4 के साथ धुंधला करने के लिए नामित किया गया है.
  7. स्थानांतरणमें अच्छी तरह से प्रति एक कक्ष के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में तीन कुओं में विशिष्ट dextramers साथ धुंधला करने के लिए नामित वर्गों युक्त तीन ऊतक कक्षों, जो 300 APC संयुग्मित Myhc 334-352 dextramers (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त एक कॉकटेल के μl और अवरुद्ध समाधान में विरोधी सीडी 4-पीई (5 ग्राम / एमएल) पहले से जोड़ा गया है. एक ढक्कन के साथ कुओं को कवर किया.
    1. इसी तरह, अच्छी तरह से प्रति एक कक्ष के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में तीन कुओं में नियंत्रण dextramers साथ धुंधला करने के लिए नामित वर्गों युक्त तीन ऊतक कक्षों हस्तांतरण, जिसमें 43-56 dextramers (2.5 माइक्रोग्राम एपीसी संयुग्मित RNase युक्त कॉकटेल के 300 μl अवरुद्ध समाधान में / एमएल) और विरोधी सीडी 4-पीई (5 ग्राम / एमएल) पहले से जोड़ा गया है. एक ढक्कन के साथ कुओं को कवर किया.
  8. कुओं लेबल, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली लपेटो और आरटी पर अंधेरे में 1.5 घंटे के लिए कोमल घुमाव के लिए सेट एक कमाल मंच पर थाली जगह.
  9. कदम, 3.10-3.11 का पालन करें
  10. दोहराएँ धोने thrकदम 3.10 में वर्णित के रूप में बर्फ.
  11. एक पानी के रंग का नरम ब्रश का उपयोग कर एक स्वच्छ सूक्ष्म स्लाइड पर दाग और तय वर्गों (अप करने के लिए तीन वर्गों / स्लाइड) रखें. वर्गों को छूने के बिना अतिरिक्त पानी को साफ कर लें, और बढ़ते माध्यम का उपयोग कर वर्गों माउंट. एक सूक्ष्म coverslip के साथ कवर और स्लाइड अंधेरे कमरे में आर टी ओ / एन में सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
  12. 4 पर एक प्रकाश प्रूफ स्लाइड भंडारण बॉक्स में स्लाइड्स स्टोर डिग्री सेल्सियस

6. Dextramer + का विश्लेषण (मस्तिष्क और हृदय दोनों वर्गों के लिए आम) लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन (एल एस सी) द्वारा (dext +) सीडी 4 + टी कोशिकाओं

  1. दिनचर्या स्कैनिंग और चित्रों के अधिग्रहण के लिए Nikon A1-ग्रहण 90i confocal खुर्दबीन प्रणाली का प्रयोग करें. शुरू करने के लिए खोलें क्लिक करें, एनआईएस तत्वों ए.आर. सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.13).
    1. "TRITC" और पैनल से "Cy5" चैनल चुनें. TRITC और Cy5 चैनलों के लिए क्रमश: / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, 561.5 एनएम / 553-618 एनएम और डिफ़ॉल्ट रूप से दिखाई देते हैं एनएम 640.7 एनएम / 663-738.
    2. क्रमशः, TRITC (सीडी 4-पीई) और Cy5 (dextramer-एपीसी) चैनलों के लिए pseudocolors "हरी" और "लाल" निरुपित.
    3. सूक्ष्म मंच पर जांच की जा स्लाइड प्लेस और 100X बढ़ाई तहत मैन्युअल रूप से ध्यान केंद्रित. 110 को "एचवी" सेट और "0" करने के लिए ऑफसेट. "फोकस" क्लिक करें और पराबैंगनीकिरण अनुकूलन करने के लिए "वोल्टेज" समायोजित.
    4. "फोकस" पर क्लिक करें; ऊपर से नीचे तक खंड स्कैन, और छवि के अधिग्रहण के लिए 'जेड' स्तर निर्धारित किया है. "दर्पण श्रृंखला" पर क्लिक करें और छवि क्रमिक रूप से अधिग्रहण. Dext पहचानें + सीडी 4 + टी कोशिकाओं लाल (dextramers) और हरी (सीडी 4) चैनल दोनों से उत्पन्न संकेतों के सह स्थानीयकरण पर आधारित के रूप में पीले कबरा कोशिकाओं दिखाई दे.
  2. Dext + सीडी 4 + टी कोशिकाओं की आसान मात्रात्मक गणना के लिए ओलिंप FV500-BX60 confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. शुरू करने के लिएखुला क्लिक करें, FluoView सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.3).
    1. ड्रॉप डाउन मेनू से रंजक "Cy3" और "Cy5" का चयन करें, और संबंधित लेज़रों लोड करने के लिए "लागू" पर क्लिक करें. नोट: Cy3 के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (543 एनएम / "हरी" pseudocolored, सीडी 4-पीई) और Cy5 (633 एनएम / "लाल" pseudocolored; dextramer-एपीसी) चैनल.
    2. सूक्ष्म स्लाइड पर जांच की जा स्लाइड, जगह और कम बढ़ाई (4X या 10X) के तहत स्वयं इसे ध्यान केंद्रित. Cy3 लेजर पर है, जबकि "फोकस" क्लिक करें, और भड़काऊ ध्यान केंद्रित ध्यान केंद्रित.
    3. 100X बढ़ाई उद्देश्य बदलें. ड्रॉप डाउन मेनू से करने के लिए "512/512" फ़ाइल का आकार निर्धारित करें. "फोकस" पर क्लिक करें और "पी एम टी", "लाभ" के लिए मूल्यों को समायोजित करने और Cy3 और Cy5 के लिए अलग से लेज़रों अनुकूलन करने के लिए पैरामीटर "ऑफसेट".
    4. "जेड मंच" पर क्लिक करें और पराबैंगनीकिरण दोनों पर कर रहे हैं, जबकि इसके बाद "फोकस" पर क्लिक करें. समूह"ऊपर" और "नीचे" तीर क्लिक करके "जेड मंच" की मोटाई. 2 माइक्रोन के लिए "जेड" अंतराल सेट.
    5. "बंद करो" क्लिक करें, और "Seq123" चुनें. फिर, "XYZ" पर क्लिक करें और भड़काऊ फोकस भीतर चयनित क्षेत्र के लिए "जेड" श्रृंखला छवियों को प्राप्त करने लगते हैं. AVI फ़ाइलों के रूप में "Z धारावाहिक छवियों" सहेजें. , छवि फ़ाइलों को बचाने के लिए "जेड धारावाहिक छवि" से छवि का चयन करें, और फिर "झगड़ा" प्रारूप के रूप में सहेजने के लिए.
  3. तीन वर्गों में से एक सेट आइए एस / पीएलपी 139-151 dextramers/anti-CD4 और आइए एस / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 प्रदर्शन करने के साथ तीन वर्गों के दूसरे सेट से सना हुआ था जहां मस्तिष्क से तीन बनती वर्गों की जांच मात्रात्मक विश्लेषण.
    1. इसी तरह, जिसमें आठ वर्गों में से एक सेट आइए कश्मीर / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 और एक अन्य एसई के साथ सना हुआ था, दिल के लिए आठ बनती वर्गों का विश्लेषणRNase 43-56 dextramers/anti-CD4 साथ आठ वर्गों के टी.
  4. मस्तिष्क में अनुभाग प्रति 10 से 15 भड़काऊ foci की जांच, और प्रत्येक फोकस में, 15 से 25 धारावाहिक छवियों क्रमिक रूप से एक सेट प्राप्त.
    1. दिल की सभी आठ वर्गों से और प्रत्येक फोकस से 20 भड़काऊ foci के एक कुल की जांच क्रमिक रूप से 10 से 15 धारावाहिक छवियों का अधिग्रहण. एक ही ध्यान केंद्रित के भीतर 'जेड' श्रृंखला की पुनरावृत्ति से बचा जाता है ताकि एक 'क्षैतिज खड़ी अप क्षैतिज खड़ी नीचे' आंदोलन में स्लाइड स्कैनिंग से 'जेड' धारावाहिक छवियों ले लो.
    2. 'जेड' धारावाहिक छवियों पर कब्जा कर रहे हैं, स्लाइड संख्या, वर्गों का नाम, और लिया 'जेड' धारावाहिक छवियों की संख्या की पहचान के द्वारा फाइल नाम.
      1. सीडी 4 + टी कोशिकाओं की कुल संख्या के संबंध में dext + सीडी 4 + टी कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 'ImageJ' सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. ImageJ 'में' काउंटर के प्रकार 'का चयन करें, जाँच और# 8216; सभी शो 'और प्रत्येक कोशिका के केंद्र क्लिक करके गिनती शुरू और विभिन्न में गिनती जारी रखने के पक्ष तीरों का उपयोग करके जेड' धारावाहिक छवियों. सभी सीडी 4 टी कोशिकाओं की गिनती के बाद, काउंटर की एक और प्रकार का चयन और + टी कोशिकाओं CD4 + dext गिनती. दो अलग काउंटरों के साथ गिना कोशिकाओं की कुल संख्या पाने के लिए परिणाम टैब पर क्लिक करें.
      2. कुल संख्या प्राप्त करने के लिए, सभी तीन मस्तिष्क वर्गों या सभी आठ दिल वर्गों का प्रतिनिधित्व सभी 'जेड' धारावाहिक छवियों में कोशिकाओं की संख्या में जोड़ें.

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Representative Results

इस रिपोर्ट में, MHC वर्ग द्वितीय dextramers के साथ सीधे धुंधला द्वारा विशिष्ट प्रतिजन, autoreactive CD4 टी कोशिकाओं की सीटू का पता लगाने में वर्णन किया गया है. ताजा कटौती मस्तिष्क वर्गों EAE चूहों से ली गई है और (नियंत्रण) dextramers और विरोधी सीडी 4 (विशिष्ट) या TMEV 70-86 पीएलपी 139-151 युक्त कॉकटेल के साथ दाग रहे थे. चित्रा 1 में शीर्ष पैनल डबल सकारात्मक कोशिकाओं पीला दिखाई दिया जहां पीएलपी 139-151 dextramers (लाल) और सीडी 4 एंटीबॉडी (हरा), के साथ costained मस्तिष्क वर्गों के एल एस सी विश्लेषण से पता चलता है. ऐसी सुविधा TMEV 70-86 (नियंत्रण) dextramers (नीचे पैनल) के साथ दाग वर्गों में अनुपस्थित था. costained (dext + सीडी 4 +) कोशिकाओं परिधि के आसपास कबरा डॉट्स दिखाया. मस्तिष्क वर्गों में पीएलपी विशेष टी कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण निम्नलिखित कदम (चित्रा 2) शामिल हैं: 1) तीन जोड़े की धारा किए गए थे, और प्रत्येक जोड़ी से एक अनुभाग विरोधी सीडी 4 और पीएलपी 139-15 के साथ व्यक्तिगत रूप से सना हुआ था1 dextramers. इसी तरह, तीन वर्गों का एक और सेट विरोधी सीडी 4 और नियंत्रण (TMEV 70-86) dextramers साथ दाग रहे थे. 2) किसी दिए गए खंड से, भड़काऊ foci (10 से 15) विरोधी सीडी 4 धुंधला के आधार पर पहचान की गई. 3) 'जेड' धारावाहिक छवियों (15 से 25) का एक सेट प्रत्येक के बीच 2 माइक्रोन के अंतराल के साथ ऊपर से नीचे तक प्रत्येक फोकस क्रमिक रूप से लिया गया था. संक्षेप में, भड़काऊ foci के बराबर संख्या का प्रतिनिधित्व 'जेड' धारावाहिक छवियों के 10 से 15 के लिए इसी तरह के सेट हर खंड में विश्लेषण किया गया. 4) व्यक्तिगत छवियों में सीडी 4 + कोशिकाओं (हरा), दोनों dextramers (लाल) और सीडी 4 के रूप में पीले कबरा कोशिकाओं अंततः खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, ImageJ का उपयोग उन्हें व्यक्तिगत रूप से अंकन द्वारा प्रगणित थे, और जो दिखाई (हरा) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं, एक भव्य कुल सब 'जेड' धारावाहिक छवियों में गिना कोशिकाओं की संख्या जोड़कर प्रत्येक खंड के लिए प्राप्त हुई थी. हैं कि कई छवियों में कोशिकाओं देखते की कोशिकाओं को चिह्नित किया गया है, संभावना है क्योंकिओवरलैपिंग हटा दिया गया. इस प्रकार, सीडी 4 व्यक्त कोशिकाओं की कुल संख्या के सापेक्ष dext + कोशिकाओं की विश्वसनीय गणना से प्राप्त किया जा सकता है.

इस अध्ययन के आगे भी एक टी सेल की मध्यस्थता रोग 13,14 है जो ए / जम्मू चूहों में Myhc 334-352 से प्रेरित विदेश मंत्री के बगल में प्रतिजन अवगत टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए dextramer अभिकर्मकों के उपयोग के प्रदर्शन के लिए बढ़ा दिया गया था. आठ बनती दिल वर्गों विदेश मंत्री ने चूहों (चित्रा 2) से, प्रत्येक 200 माइक्रोन मोटी, प्राप्त किया गया. वर्गों (कुल 8) का एक और सेट RNase 43-56 dextramers (नियंत्रण) और विरोधी के साथ सना हुआ था जबकि प्रत्येक जोड़ी से, (8 वर्गों की कुल के साथ) एक अनुभाग, Myhc 334-352 dextramers और विरोधी सीडी 4 से सना हुआ था -सीडी 4. सभी आठ वर्गों का प्रतिनिधित्व है कि कई भड़काऊ foci के लिए इसी 'जेड' धारावाहिक छवियों के बीस सेट क्रमिक रूप से ऊपर के रूप में (चित्रा 2) का अधिग्रहण कर लिया गया. मूलतः, 'जेड' धारावाहिक आईएम के एक सेट दियाउम्र के एक एकल भड़काऊ फोकस प्रतिनिधित्व 10 से 15 व्यक्ति शामिल थे. एल एस सी द्वारा इन चित्रों के विश्लेषण Myhc 334-352 dextramers (लाल) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति देखी गई, और सीडी 4 (हरा) और उम्मीद के मुताबिक, dextramers और CD4 दोनों के साथ ही कोशिकाओं (चित्रा 3, शीर्ष पैनल) के रूप में पीले कबरा कोशिकाओं दिखाई दिया . नियंत्रण dextramers के लिए पृष्ठभूमि धुंधला (चित्रा 3, नीचे पैनल) नगण्य था. dext + सीडी 4 + टी कोशिकाओं की कुल संख्या और सीडी 4 + टी कोशिकाओं की कुल संख्या सभी वर्गों से प्रत्येक अनुभाग और गिनती के लिए निर्धारित किया गया है प्रत्येक सबसेट (dext + सीडी 4 + टी कोशिकाओं के लिए कुल संख्या प्राप्त करने के लिए एक साथ जोड़ा गया था; सीडी 4 + टी कोशिकाओं).

चित्रा 1
चित्रा 1. में सीटू द्वारा पीएलपी विशेष CD4 टी कोशिकाओं की जांच रोंग>. EAE सीएफए में पीएलपी 139-151 के साथ जानवरों immunizing द्वारा SJL चूहों में पीएलपी 139-151 dextramers साथ धुंधला प्रेरित किया गया था. समापन पर, EAE चूहों से एकत्र cerebrums agarose 4% में एम्बेडेड थे, और वर्गों vibratome का उपयोग किया गया. पीएलपी 139-151 dextramers/anti-CD4 या TMEV 70-86 dextramers (नियंत्रण) / विरोधी सीडी 4 और 4% पीबीएस बफर paraformaldehyde के साथ फिक्सिंग जिसमें या तो कॉकटेल के साथ धुंधला के बाद, वर्गों धोया गया और एल एस सी द्वारा परीक्षा के लिए मुहिम शुरू की. शीर्ष पैनल: पीएलपी 139-151 dextramers/anti-CD4 साथ दाग दो अलग अलग वर्गों. नीचे पैनलों: TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 साथ दाग दो अलग अलग वर्गों. बाएं पैनल: सीडी 4, हरी; मध्य पैनल: dextramers, लाल; राइट पैनल: (तीर, dext + सीडी 4 + टी कोशिकाओं) का विलय कर दिया. मूल बढ़ाई 1,000 एक्स (अपनाया.:. प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय Dextramers साथ Massilamany एट अल, 2014 सीधी धुंधला विशिष्ट प्रतिजन, autoreactive सीडी 4 टी सेल की जांच परमिट. सीटू वन PLOS 9 में है (1):. e87519) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
(पैनल 1) के रूप में दिखाया चित्रा 2. दिमाग और दिल में dext + कोशिकाओं quantitate के लिए एक दृष्टिकोण है. बनती वर्गों मस्तिष्क या अलिन्द-excised दिल से बना रहे हैं. संकेत अंगों को इसी प्रत्येक जोड़ी से एक अनुभाग विशिष्ट dextramers (मस्तिष्क, पीएलपी 139-151 dextramers, दिल, Myhc 334-352 dextramers) के साथ धुंधला करने के लिए नामित किया गया था, और नियंत्रण dextramers के लिए वर्गों के अन्य सेट (मस्तिष्क, TMEV 70 - 86; दिल, RNase 43-56). फिक्सिंग और बढ़ते के बाद, वर्गों एल एस सी द्वारा सीडी 4 के साथ धुंधला के आधार पर भड़काऊ foci (मूल पत्रिका का पता लगाने के लिए जांच की गईnification, 40X) (पैनल) 2. तीन आयामी (3 डी) दृश्य (पैनल 3) में कल्पना के रूप में प्रत्येक भड़काऊ फोकस 'जेड' धारावाहिक छवियों क्रमिक रूप से (पैनल 4) का एक सेट के अधीन था. सभी छवियों में, अकेले विशिष्ट या नियंत्रण dextramers और सीडी 4, या सीडी 4 दोनों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं अपनाया 'ImageJ' सॉफ्टवेयर (गिनती का उपयोग कर रहे थे.. Massilamany एट अल, 2014 प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय Dextramers साथ सीधी धुंधला एंटीजन की जांच परमिट विशिष्ट सीटू वन PLOS 9 में autoreactive CD4 टी कोशिकाओं (1):.. e87519) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
सीटू के द्वारा हृदय मायोसिन विशेष CD4 टी कोशिकाओं की चित्रा 3. जांच + सीडी 4 + (अपनाया... प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय Dextramers साथ Massilamany एट अल, 2014 सीधी धुंधला सीटू PLoS में विशिष्ट प्रतिजन, autoreactive CD4 टी कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है एक 9 (1): e87519). यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

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Discussion

MHC वर्ग मैं tetramers के विपरीत, दिनचर्या अनुप्रयोगों के लिए MHC वर्ग द्वितीय tetramers का उपयोग विशेष रूप से उनके सक्रियण निर्भरता 6,15-17 के कारण भाग में कम समानता autoreactive सीडी 4 टी कोशिकाओं के अग्रदूत आवृत्तियों गणना करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना हुआ है. हाल ही में, इस समस्या को इस तरह पीएलपी 139-151, MOG 35-55 और Myhc 334 के रूप में autoantigens, के एक नंबर के लिए प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए हमें की अनुमति ", dextramers" कहा जाता tetramers की अगली पीढ़ी, बनाने के द्वारा उन्हें धोखा दिया था - 352 8. इस रिपोर्ट में, पहली बार के लिए, बगल में आत्म - प्रतिक्रियाशील CD4 टी कोशिकाओं का पता लगाने और यों तो MHC वर्ग द्वितीय dextramers की उपयोगिता EAE चूहों से मस्तिष्क वर्गों, और विदेश मंत्री चूहों से दिल वर्गों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. एक प्रतिक्रिया के आधार पर, dextramers MHC / पेप्टाइड परिसरों की एक छोटी राशि की आवश्यकता का लाभ प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, प्रत्येक प्रतिक्रिया केवल 0.75 माइक्रोग्राम MHC / पेप्टाइड monomers के आवश्यकता है. इसके अलावा, स्टेशन मेंdextramers साथ ining dextramers विरोधी सीडी 4 के साथ coincubated रहे हैं, एक एक कदम की प्रतिक्रिया है, और पूरी प्रक्रिया, ऊतक धुंधला करने सेक्शनिंग से, एक दिन से भी कम समय में समाप्त हो सकता है. इसके विपरीत, पारंपरिक tetramers साथ सीटू धुंधला में प्रकाशित प्रोटोकॉल सामान्यतः फ्लोरोसेंट संकेतों fluorophores के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग परिलक्षित कर रहे हैं जिसमें प्रवर्धन प्रक्रियाओं शामिल है. नतीजतन, धुंधला प्रक्रियाओं 18-20 पूरा करने के लिए तीन दिन का समय लग सकता है.

इसके अलावा, मस्तिष्क वर्गों में dextramers का उपयोग भी 50 माइक्रोन तक के लिए, ऊतक वर्गों में गहरी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए परमिट. यह पीएलपी 139-151 dext + सीडी 4 + कोशिकाओं दोनों perivascularly और भी पैरेन्काइमा भीतर स्थित होना पाया गया है कि नोट किया गया था. मस्तिष्क सेकंड में पीएलपी 139-151 dextramers के साथ तुलना में इसके अलावा, जब Myhc 334-352 dextramers से उत्पन्न संकेतों की तीव्रता हृदय वर्गों में कम थामाहौल (चित्रा 1), और इस तरह के एक रूपांतर प्रत्येक अंग के लिए अद्वितीय विशेषताओं को प्रतिबिंबित कर सकते. ऐसा ही एक चर संभावित भड़काऊ ध्यान में dextramers की आसान प्रसार को सीमित कर सकते हैं जो मुख्य रूप से धारीदार मांसपेशी फाइबर होता है कि हृदय के ऊतकों को विरोध के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों में उच्च मात्रा में मौजूद है जो लिपिड सामग्री है. इस धारणा के समर्थन में, Myhc 334-352 dext + कोशिकाओं केवल हृदय वर्गों के बहुमत में 20 माइक्रोन के लिए एक गहराई ऊपर से पता चला रहे थे. इसके अतिरिक्त, Myhc 334-352 dext + कोशिकाओं सभी myocarditic घावों में भड़काऊ पैठ का दूर तक फैला हुआ प्रकृति का सुझाव मायोकार्डियम के माध्यम से बिखरे हुए उपस्थित थे.

आम तौर पर, दो प्रमुख कारक नकारात्मक एल एस सी द्वारा बगल में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाने को प्रभावित कर सकते हैं. सबसे पहले, fluorophores द्वारा उत्सर्जित अपर्याप्त संकेत fluorophore एंटीबॉडी का उपयोग संकेत बढ़ाना करने की आवश्यकता हो सकती है. दूसरा, इस तरह के एक अप्रत्यक्ष दागनियंत्रण अभिकर्मकों के लिए पृष्ठभूमि धुंधला भी उसी अनुपात में 18,19 बढ़ा सकते हैं के रूप में आईएनजी, विशिष्टता को कमजोर कर सकते हैं. इन सीमाओं dextramers के साथ सीधे धुंधला द्वारा circumvented किया गया. सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के सफलतापूर्वक ताजा वर्गों के साथ दिखाया गया है, हालांकि, जमे हुए ऊतकों में dextramer अभिकर्मकों के उपयोग की वजह से ऊतकों प्राप्त करने के लिए की प्रवृत्ति के लिए मुश्किल हो सकता है ऊतक अखंडता की अवधारण के रूप में एक चुनौती हो सकती है, जो अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है विभिन्न धुंधला दौरान विघटित 18,19 दोहराएँ.

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Disclosures

हितों की कोई संघर्ष की घोषणा की गई.

Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन और बच्चों के कार्डियोमायोपैथी फाउंडेशन (SDG2462390204001), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL114669) द्वारा समर्थित किया गया. मुख्यमंत्री मायोकार्डिटिस फाउंडेशन, एनजे द्वारा सम्मानित किया गया एक postdoctoral शोध फैलोशिप अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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References

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