Imagerie intracellulaire de Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

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Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

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Abstract

Introduction

Les astrocytes sont des cellules gliales omniprésents et abondantes du cerveau. Il est bien établi que les astrocytes servent soutien vital et rôles homéostatiques y compris tampon de concentration de K + dans l'espace extracellulaire, recaptage des neurotransmetteurs, ainsi que fournir des éléments nutritifs. Cependant, des études récentes montrent qu'ils affichent aussi [Ca2 +] i signaux, qui se produisent spontanément et sont augmentés de l'activité neuronale 1. L'existence d'astrocytes [Ca 2+] i la signalisation a été de plus en plus pensé à déclencher leur communication avec les neurones, et en tant que tel a été interprétée comme une forme de "Ca 2+ excitabilité" dans les astrocytes. Les données disponibles au cours des deux dernières décennies suggèrent deux contextes dans lesquels les astrocytes et les neurones peuvent communiquer, peut-être d'une manière bidirectionnelle. Tout d'abord, les astrocytes réagissent souvent avec une augmentation de la [Ca 2+] i lorsqu'il est activé par les neurotransmetteurs etneuromodulateurs libérés par les neurones 2. Deuxièmement, [Ca 2+] i augmente dans les astrocytes provoquer la libération de molécules de signalisation des astrocytes qui peuvent à leur tour affecter les neurones et les vaisseaux sanguins. Les preuves suggèrent que les molécules libérées par les astrocytes conduisent à des changements dans les fonctions de synapses, les circuits et en fin de compte le comportement de signalisation par l'intermédiaire de 3 à 5 astrocyte-à-neurone. Cependant, cela reste un domaine de recherche en plein développement, et il a été avancé que d'une meilleure compréhension et détaillée des astrocytes [Ca 2+] i est nécessaire pour résoudre certaines des incertitudes actuelles 6.

Dans le travail passé, il a été démontré que le chargement en vrac de Ca 2+ organiques colorants indicateurs dans les astrocytes ne parvient pas à détecter de manière fiable [Ca 2+] i signaux dans les astrocytes entiers de la culture et in situ 7-10. Ces résultats ont été discutés par nous et d'autres 6,11,12. Le Emerging image est que [Ca 2+] i signaux au sein des processus d'astrocytes (par exemple, les branches et rameaux), qui sont les premiers sites d'interactions avec les neurones et les vaisseaux sanguins, ont rarement été étudiée en détail. Récemment, l'utilisation d'indicateurs de calcium génétiquement codées (GeCIS) comme GCaMP3 cytosolique, GCaMP5G et GCaMP6 et membrane plasmique versions captif (par exemple, Lck-GCaMP3) a permis l'étude de [Ca 2+] i signaux dans de petits compartiments de astrocytes ces processus minces, près de la membrane plasmique et dans des territoires entiers 7,8. Cependant, GeCIS ont un inconvénient plus organiques Ca 2+ colorants indicateurs et qui est l'exigence des méthodes génétiques pour livrer les gènes codant sélective pour les astrocytes in vivo pour des périodes de plusieurs semaines pour la GeCIS être appropriée exprimé. Expression in vivo est généralement réalisé en utilisant des souris transgéniques, souris knock-in ou par le virus basé livraison appcafards. Dans l'article présent JoVE nous présentons les méthodes et procédures utilisées pour fournir GeCIS à astrocytes striataux utilisant des virus adéno-associés. Nous nous concentrons sur cyto-GCaMP3 comme un exemple, mais la même procédure de base fonctionne pour tout autre GECI ou fluorescent reporter à base de protéines.

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Protocol

Tous les protocoles d'animaux étaient en conformité avec les Instituts nationaux américains de la santé Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'UCLA.

1.1) Préparer Micropipette et AAV2 / 5 Virus de chargement

  1. Utilisation de fines micropipettes en verre borosilicaté pour l'injection du virus. Tirez la micropipette en utilisant un programme de traction en deux étapes avec un extracteur vertical. Biseau la pipette à un angle de 40 ° en utilisant un broyeur de pipette. La pipette qui est idéal pour être utilisé aura un diamètre de pointe de 20 à 40 um et une longueur de tige de 6-7 mm. Autoclaver la pipette et instruments chirurgicaux. Le foret est stérilisée par essuyage avec 70% d'éthanol.
  2. Stocker le virus AAV2 / 5-GfaABC une D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), à -80 ° C dans des aliquotes de 10 pi. Juste avant la chirurgie, prendre les aliquotes du congélateur et stocker sur la glace jusqu'à son utilisation pour le remplissage ee micropipette.
  3. Remplir la micropipette avec le virus en utilisant une pompe à seringue. Relier hermétiquement une extrémité d'un morceau de tuyau, à travers un tube de compression raccord de taille appropriée, d'une seringue en verre avec un piston renforcé. Attacher la micropipette autoclave à l'autre extrémité du morceau de tube par l'intermédiaire d'une compression de l'aiguille de taille appropriée raccord amovible.
  4. Avant de charger le vecteur viral, d'éliminer les bulles d'air du système de pompage comprenant un tube, seringue et micropipette par remplissage de l'installation avec une huile minérale de couleur avec du Soudan IV rouge (~ 1 mg / 50 ml) dans une seringue de 1 ml avec une aiguille (27 G ).
  5. Placez un morceau de parafilm propre sous la micropipette de verre, et distribuer 5 - 10 pi du vecteur viral sur le parafilm.
  6. Sucer le vecteur viral en déplaçant le piston de la seringue vers l'arrière à 0,5 pi / min, et marquer la limite entre le vecteur et l'huile sur la pipette de verre.

1.2) Anesthésie, coupe de cheveux, HEAD fixation et préparation pour Craniotomy

  1. Mettre une souris (P49-63, C57BL / 6) dans la chambre rempli de N 2 O et O 2, et 5% d'isoflurane. Évaluer la profondeur de l'anesthésie par une perte de mouvement intentionnel et un rythme respiratoire ralenti (~ 60-90 / min). Couper les cheveux sur la tête quand la souris est anesthésiée.
  2. Monter la souris dans le cadre stéréotaxique, avec sa tête fixé par des barres d'oreille émoussées et son nez placés dans un système d'anesthésie et de ventilation. Maintenir l'isoflurane continu à 2 - 3%. Appliquer des larmes artificielles pommade pour les deux yeux puisque les souris perdent leur réflexe de clignement sous anesthésie.
  3. Administrer 0,05 ml de buprénorphine (0,1 mg / ml) par injection sous-cutanée pour le soulagement de la douleur.
  4. Zone chirurgicale pur avec 10% de povidone iode et 70% d'alcool trois fois, en alternant entre les deux solutions de départ et avec de la povidone iode. Commencez par l'avant et vers l'arrière essuyer pour enlever les poils déjà coupées.
  5. Faire une incision de la peau sur le dessus of la tête qui commence entre les yeux et se termine entre les oreilles.

1.3) Craniotomy et microinjections

  1. Retirez le périoste en balayant avec un coton-tige, puis sécher la surface du crâne avec des boules de coton dentaires. Faire une marque sur le site d'injection, et percer sur le pourtour de la marque à l'aide d'une petite fraise en acier alimenté par un forage à grande vitesse.
  2. Retirer l'os et nettoyer la surface avec une solution saline.
  3. Placez la pipette dans la dorsale latéral gauche striatum avec les coordonnées suivantes (mm): 0,8 antéro-postérieur, médio-latérale: 2,0, dorso-ventral de la surface piales: -2,4 13. A noter que ces coordonnées signifie que la pointe de l'aiguille de micro-injection se trouve juste au-dessus du striatum dorso-latéral (figure 1A, B), ce qui signifie qu'il ne pénètre légèrement à l'intérieur de ce noyau. Évitez d'endommager les vaisseaux sanguins. Si la pipette se trouve être à droite sur un vaisseau sanguin, légèrement ajuster lales coordonnées de ~ 0,1 à 0,2 mm.
  4. Lancer injection avec un taux d'injection fixée à 0,2 pi / min, et injecter 1 à 1,5 ul de virus.
  5. Laisser la pipette en place après l'injection pendant 10 min, puis retirer la pipette lentement.
  6. Terminez par la fermeture de la plaie chirurgicale avec suture continue nylon externe suture.

1.4) Recouvrement

  1. Mettez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant pendant 24 heures. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Ne laissez pas la souris sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
  2. Ajouter triméthoprime Sulfamethoxiazole (5 ml par 500 de l'eau, contenant 40 mg de triméthoprime et 200 mg sulfamethoxiazole) dans l'eau pendant une semaine. Administrer buprénorphine deux fois par jour pour un maximum de trois jours après la chirurgie.
  3. Maintenir la souris sur un cycle lumière-obscurité de 12 h, nourris et abreuvés quotidiennement, une est pondéré une fois par jour jusqu'à 3 jours après la chirurgie. Dans ces 3 jours, aucune souris avec une perte de plus de 10% du poids du corps est considérée comme compromise, et sera euthanasiée au lieu d'être soumis à l'expérimentation.
  4. Par ailleurs, changer la cage de la souris deux fois par semaine, et de surveiller la santé générale au moins une fois par jour. En général, la souris est utilisé dans les 2 - 3 semaines après les micro-injections stéréotaxiques.

2. Trancher aiguë cerveau Préparation pour la Imaging confocale Ca

2.1) Préparation de coupe et Solutions d'enregistrement.

  1. Préparer une solution comprenant (mM) de coupe: 194 saccharose, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 le D-glucose, 1 de MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 et NaHCO 3 26, saturé avec 95% O 2 et 5% CO 2.
  2. Préparer la solution d'enregistrement comprenant (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 le D-glucose, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 3; pH 7.3 à 7.4, de 290 à 295 mOsm, saturé avec 95% O 2 et 5% CO 2. Remplir le bécher tranche de cerveau tenue avec une solution d'enregistrement, et les conserver à 34 ° C.

2.2) tranchage

  1. Deux à trois semaines après microinjections stéréotaxiques, profondément et terminale anesthésier la souris, puis décapiter.
  2. Extraire le cerveau, et utiliser une lame pour enlever l'hémisphère droit non injectée, et monter celle de gauche sur le plateau vibratome utilisant la super glue. Remplissez le bac à glace vibratome avec un tampon de coupe froid et gardez-le saturant avec 95% d'O 2 et 5% de CO 2.
  3. Couper les tranches de cerveau striatum coronale ou sagittale à 300 um d'épaisseur. Habituellement, 4-5 coronaire, ou 6-7 tranches striatales sagittales peuvent être collectées.
  4. Transférer les tranches dans le bécher de maintien de tranche réchauffé à 34 ° C, et de les y maintenir pendant 30 min avant de les stocker à température ambiante pendant recordi ultérieureng.
  5. Incuber les tranches de cerveau dans du tampon d'enregistrement oxygénée à la température ambiante pendant au moins 30 min avant de [Ca2 +] i imagerie.

3. L'immunohistochimie (IHC)

  1. Deux semaines après l'injection du virus, la souris perfuser transcardiaque avec du PBS suivi par 10% de formaline dans du PBS.
  2. Retirer, post-fixer nuit, et cryoprotect le cerveau en tampon saccharose à 30% pendant au moins 2 jours.
  3. Préparer 40 um sections à l'aide d'un microtome de cryostat.
  4. Rincer les sections 3 fois avec du PBS à intervalle de 10 min.
  5. Incuber les coupes pendant 1 h dans du PBS avec 10% de sérum de chèvre normal et avec 0,5% de Triton X-100.
  6. Incuber les coupes pendant une nuit à 4 ° C dans l'anticorps primaire préparée dans du PBS avec 0,5% de Triton X-100. Les anticorps primaires utilisés étaient les suivants: anti-GFP poulet 1: 1000, de souris anti-S100β 1: 400, de souris anti-NeuN 1: 600, de souris anti-glutamine synthétase 1: 300.
  7. Rincer les sections 3 fois avec du PBS à 10 mdans les intervalles.
  8. Incuber les coupes avec des anticorps secondaires préparées dans du PBS avec 10% de sérum de chèvre normal pendant 2 h à température ambiante. Les anticorps secondaires étaient les suivants: chèvre anti-souris Alexa546 1: 500, de chèvre anti-poulet Alexa488 1: 500.
  9. Monter les coupes sur des lames de verre, sécher et appliquer quelques gouttes de antifade milieu de montage, puis couvrir lentement les sections avec une lamelle de verre. Conserver les lames à 4 ° C.
  10. Prendre des images sur un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l'huile 40X avec une ouverture numérique de 1,3.

4. confocale [Ca 2+] i Imaging

REMARQUE: [Ca2 +] i a été effectuée en utilisant l'imagerie de microscope confocal avec un objectif 40X à immersion d'eau avec une ouverture numérique de 0,8.

  1. Entre 1 et 5 h après la coupe, tranche lieu dans la chambre d'enregistrement et superfuse avec le tampon d'enregistrement oxygéné à température ambiante avec un débit de 1 - 2 ml parmin. Ensuite, placez une harpe de platine avec des cordes en nylon sur le dessus de la tranche pour minimiser le mouvement pendant l'expérience.
  2. Visualiser et localiser le striatum dorsal avec le champ lumineux luminescence sous un objectif à immersion d'eau 10X.
  3. Passez à l'immersion dans l'eau 40X objectif, et tourner sur la ligne 488 nm du laser Argon. En changeant le plan focal, trouver des cellules situées à environ 20 um sous la surface de la tranche, affichant fluorescence basale à Soma, branches et rameaux. Fait à noter, les cellules compromis affichent généralement le niveau de fluorescence dessus de la moyenne, qui devrait être évité.
  4. Utilisez le mode «balayage d'image» pour lancer la numérisation. En général, l'intensité du laser ajusté à 0,5 à 5% de la puissance maximale est suffisante pour l'image [Ca 2+] i par cyto-GCaMP3. Pour la surveillance de [Ca2 +] i dynamique dans l'ensemble du territoire des astrocytes, le 'balayage d'image »avec une vitesse de balayage de 1 s par châssis ou plus rapide est recommeDEMVSO, mais cela doit être décidé en fonction de l'expérience en question.
  5. Si nécessaire, à l'image de [Ca 2+] i dans les processus, utiliser un grossissement numérique de 2 - 3 fois pour surveiller 1 - 2 astrocytes dans l'ensemble du champ de vue.
  6. Pour éviter pixels saturés pendant l'enregistrement, utilisez le mode de recherche 'HiLo' de pseudo-cellules. Toujours commencer par un "enregistrement de pilote" pendant environ 5 min, à tester si la couleur rouge apparaît comme indication de saturation. Si oui, plus la puissance de sortie de laser, ou abaisser le PMT / Gain / valeurs de décalage et d'effectuer un autre enregistrement de pilote pour tester les valeurs de pixels sont dans la gamme non saturé. En règle générale, les paramètres combinés utilisés pour l'imagerie des astrocytes [Ca 2+] i dans le striatum sont les suivantes: laser de puissance de sortie de 0,5 à 5% (de 10 mW), PMT 550 à 650 Volts, Gain 2.0 - 3.5x, et l'offset 0 - 5%.

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Representative Results

Pour les astrocytes expression spécifique de cyto-GCaMP3 dans le striatum, nous avons utilisé un virus adéno-associé (AAV) du 5 serotype, et la GFAP GfaABC 1 promoteur de D (figure 1A), qui a été précédemment montré pour conduire GCaMP3 robuste et gène rapporteur expression dans l'hippocampe et les astrocytes corticaux 8,14. Deux semaines après le virus de la micro-injection dans le striatum de souris, la souris (~ 10 semaines) a été perfusée et IHC a été réalisée sur des coupes de cerveau minces pour évaluer l'expression cyto-GCaMP3 dans le striatum (figure 1B). Nous avons détecté GCaMP3 cyto-GFP en utilisant des anticorps et également coloré les coupes avec un marqueur d'astrocytes connu, S100β. Expression Cyto-GCaMP3 n'a été trouvé que dans les cellules positives S100β. Aucune expression n'a été trouvée dans les neurones visualisés avec NeuN (Figure 2A et 2B), ce qui suggère une expression spécifique des astrocytes. Surtout, expression cyto-GCaMP3 a été détectée dans environ 60% de cellules positives S100β (Figure 2C).

Les astrocytes répondent aux lésions cérébrales, comme des blessures, l'ischémie et l'infection par l'affichage des changements qui sont devenus connus comme astrocytes réactivité, ce qui représente un spectre de changements potentiels de légère à sévère 15. Nous avons cherché à évaluer si la micro-injection de virus a causé manifeste astrocytes réactivité. Il a déjà été démontré que les niveaux d'expression réduite de la glutamine synthétase (GS) ont été associés avec les astrocytes réactifs 16,17. Par conséquent, l'expression GS dans le striatum de souris WT et de virus injecté a été comparée. Nous avons trouvé aucun changement significatif dans l'expression GS dans les astrocytes du striatum après l'injection de virus (figure 3A - C), indiquant l'absence de réactivité des astrocytes manifeste en utilisant des niveaux GS comme une métrique. Cette approche générale pourrait être étendu dans les travaux futurs pour évaluer la réactivité des astrocytes en utilisant d'autres marqueurs de réactivité. Toutefois, notez que les niveaux de GFAP peuvent ne pas être un bon moyen de mesurer la réactivité dans striatastrocytes al, parce que GFAP est pas exprimée à des niveaux détectables dans la plupart des astrocytes du striatum dans des conditions basales 18. En résumé, en utilisant IHC nous concluons expression cyto-GCaMP3 était robuste et spécifique pour les astrocytes dans le striatum, et que l'injection de virus ne causent pas de réactivité des astrocytes évaluée par GS changements de niveau d'expression.

Nous avons ensuite préparé des tranches de cerveau de courte durée de souris injectées de virus à l'image [Ca 2+] i dans les astrocytes du striatum. 300 um d'épaisseur des tranches coronales ou sagittales aiguë ont été préparés, et après une période de récupération les tranches ont été placées dans une chambre d'enregistrement sur ​​un microscope confocal de [Ca2 +] i en utilisant l'imagerie de la ligne de 488 nm d'un laser à argon. Astrocytes striataux exprimant cyto-GCaMP3 pourraient être facilement identifiés dans la plupart (généralement tous) des tranches du striatum (~ 6 - 7 tranches par la souris), car ils ont montré une fluorescence verte visible dans les cellules ayant une morphologie bien touffue (Figure 4 la figure 4A; au moins 10 astrocytes affichage cyto-GCaMP3 pourraient être imagées et sont représentées dans la figure 4A comme régions d'intérêt (ROI). Images en agrandissement supérieur avec un zoom numérique supplémentaire de 2,0 à 3,0 est nécessaire d'identifier les astrocytes simples (figure 4B). Dans ces circonstances, les territoires d'astrocytes entières ont été révélés par l'expression cyto-GCaMP3, comme le montre la figure 4B. Spontanées Ca 2+ signaux ont été mesurés facilement dans le corps cellulaire ainsi que dans les branches et les rameaux d'astrocytes 6.

Figure 1
Figure 1: livraison virale de GeCIS (par exemple cyto-GCaMP3) par AAV2 / 5 dans le striatum de souris adulte. A. Schéma illustre le protocole de AAV2 / 5 microinjections dans le striatum dorso-latéral.B. Cela montre la position approximative de l'aiguille de micro-injection par rapport au striatum et les coordonnées utilisées pour les injections stéréotaxiques. L'image d'une tranche de Nissl teinté dans la partie B a été téléchargé à partir de ALLEN atlas du cerveau.

Figure 2
Figure 2: Cyto-GCaMP3 expression est spécifique à astrocytes du striatum. A - B. images représentatives montrant que l'expression cyto-GCaMP3 co-localise avec un marqueur pour les astrocytes (S100β) (B), mais pas avec un marqueur pour les neurones (NeuN) (A) C bar Résumé graphique pour des expériences de colocalisation comme ceux montrés. en A et B.

Figure 3
Figure 3: expression Cyto-GCaMP3 dans les astrocytes du striatum ne pas provoquer des changements dans l'expression de GS.A - B. représentatifs d'images et GCaMP3 GS IHC de souris qui avaient reçu VAA2 / 5 pour GCaMP3. Images pour les souris non injectées de contrôle sont également indiquées. C. graphique Bar résume les résultats d'expériences telles que celles de A et B (ns indique pas significatif en utilisant le test t de Student non apparié un, p <0,05).

Figure 4
Figure 4: exemples représentatifs de [Ca2 +] i signaux enregistrés à partir des astrocytes striataux avec cyto-GCaMP3. L'image z-stack montrant 10 astrocytes (numérotés de 1 - 10) A. Une aplati .Le retrace ci-dessous montrent [Ca 2+] i signaux enregistré plus de 5 mn des 10 cellules montré dans une B. A aplatie et agrandie en z. l'image -stack pour un seul astrocyte.The retrace ci-dessous montrent [Ca 2+] isignaux enregistrés plus de 5 min de la cellule unique indiqué dans B.

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Discussion

Les méthodes décrites ici nous ont permis d'exprimer cyto-GCaMP3 dans les astrocytes du striatum in vivo pour la suite [Ca 2+] i imagerie in situ. Cette méthode a des avantages sur l'aide transgénique ou souris knock-in, y compris l'expression robuste de la protéine ciblée, la rapidité et la souplesse de mise en œuvre expérimentale et la spécificité anatomique. L'expression de GCaMP3 utilisant VAA2 / 5 a été trouvé pour être plus précis et robuste. La combinaison de la GFAP GfaABC promoteur 1 D avec AAV de sérotype 5 est essentielle pour parvenir à la spécificité. Une limitation de la technique décrite ici est que l'infection par le virus et la procédure de chirurgie peuvent provoquer des astrocytes réactivité, particulièrement avec les virus à titre élevé 19. Il est important, dans la présente étude, AAV2 / 5 microinjections avec un faible titre relatif ne pas entraîner des baisses de GS qui ont été associés à des astrocytes réactivité 19. Contrôles similaires ont été rapportés pour Hippastrocytes ocampal 8. Cependant, il est important de souligner la nécessité de ces contrôles pour chaque zone du cerveau à étudier, notamment parce que les astrocytes sont hétérogènes 20, et parce qu'ils remplissent probablement différentes fonctions dans des régions distinctes du cerveau.

Un des facteurs importants qui peuvent influer sur la robustesse de l'expression du gène ciblé avec microinjection de virus est les coordonnées d'usage, qui varie selon les souches et les changements sur le développement des animaux souris différentes. Seuls les souris C57BL / 6 de ~ 8 semaines ont été utilisés tout au long de cette étude. Il a été également montré que l'expression virale de la GFP dans les neurones et les astrocytes du striatum des rats n'a pu être détectée après l'injection de 4 jours, a atteint un plateau de 2 - 4 semaines après l'injection, puis est restée stable pendant 9 mois après l'injection 21. Le cours de temps d'expression cyto-GCaMP3 n'a pas été déterminé avec précision, mais au moins deux semaines pour l'expression de virus sontrecommandé.

L'approche de l'aide AAV2 / 5 expression médiation de GeCIS dans les astrocytes du striatum peut maintenant être utilisé pour mieux comprendre astrocytes [Ca 2+] i la signalisation dans le striatum. Plus précisément, le niveau d'expression cyto-GCaMP3 est suffisamment élevée pour permettre l'imagerie de [Ca2 +] i signaux dans les petites populations d'astrocytes (~ 10 cellules) et dans l'ensemble des territoires astrocytes simples. L'analyse détaillée de [Ca2 +] i signaux est toujours en cours, mais à ce jour [Ca 2+] i signaux ont été détectés à partir de processus distaux autant que ~ 50 um loin du soma (Figure 4). Expériences détaillées sur astrocytes [Ca2 +] i signaux et leurs fonctions de corrélation et causalité dans le striatum sont réalisables. Dans l'avenir, les approches raffinés (c.-à-promoteurs) sont nécessaires pour fournir GeCIS à des populations génétiquement définies de sorte que les astrocytes on peutexplorer la signalisation calcique au sein de diverses populations d'astrocytes 20.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à divulguer.

Acknowledgements

La majorité des travaux et le personnel impliqués ont été pris en charge par le NIH subvention NS060677 et en partie par les NIH accorde MH099559 et MH104069 (à BSK). Une partie du travail a également été soutenu par la Fondation CHDI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

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