siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

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Bioengineering

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Summary

배달은 작은 간섭 RNA (siRNA의)의 치료 구현을위한 주요 과제로 남아. 이 프로토콜은 아르기닌 및 폴리에틸렌 이민 다공성 실리콘 그래프트 미립자로 구성된 다기능 및 생체 적합성의 siRNA 전달 플랫폼의 사용을 포함한다.

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Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

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Abstract

Introduction

작은 방해 RNA들 (siRNA가)는 유전자의 발현을 억제 할 수있는 이중 가닥 RNA 분자이다. 최근, siRNA는 임상 응용 1-5하는데있어서의 장래의 사용을 위해 치료 가능성을 보여 바이오 의약품의 차세대로서 개발되어왔다. 그러나, siRNA의 치료의 성공적인 구현 인해 클레아 불량 세포 내 흡수, 낮은 형질 감염 효율 및 엔도 / 5 리소좀에서 비효율적 릴리스 저하, 상당한 도전 남아있다. 이러한 장애의 대부분은 안전하고 효율적으로 환부 조직으로 siRNA를 전달을 제공 할 수있는 플랫폼의 개발에 의해 극복 될 수있다. 바이러스 캐리어에 비해 비 바이러스 플랫폼은 안전, 저가 및 원단의 용이성 등 여러 가지 이점을 제공한다. 이러한 폴리머 및 지질 등의 특정 성, 양이온 성 나노 입자에서, siRNA를 전달 3 유용 증명했다.

이전에, 우리는 원반형 닥터 개발전달 시스템 UG, 다단 벡터 (MSV)를 불린다. 이 플랫폼은 하나가 다른 차량으로부터 방출되는 연속 한 단계에 기초한다. 두번째 단계 차량 약물이나 조영제 -6,7- 로케이션 나노 입자 인 반면 제 1 스테이지 차량 생분해 다공성 실리콘 (PSI)에서 만든 미립자이다. 시 8 저하로 PSI 재료에 포함 된 나노 입자는, 서서히 방출된다. 실리콘 입자를 사용하는 이점은 형태 및 표면 특성을 용이하게 최적의 생체 내 분포 및 약물 방출을 달성하기 위해 맞추어 질 수 있다는 것이다. 최근에, 종양 조직에 대한 siRNA를 리포좀의 배달 MSV 플랫폼의 성공적인 사용은 난소 및 유방암 마우스 모델 9,도 10에 도시 하였다.

이 작품에서 우리는 MSV 플랫폼의 원칙에 따라 siRNA를위한 보편적 인 전달 시스템을 제작했다. 본 전달 시스템의 효능은 이전 우릴 입증되었다다른의 siRNA를 보내고 11 개의 분자. 시스템은 폴리에틸렌 이민 (PEI) 및 아르기닌 (의 Arg)로 이루어지는 그래프트 PSI, 폴리 양이온 기능화 된 다공성 실리콘 (PCPS) 담체이다. , 여기서 Arg 및 PSI는 PEI의 독성을 감소시키는 역할을 할 수있는 동안 이전 11 demonstarted로 PEI는 siRNA 로의 정전 기적 ​​상호 작용을 형성하는데 도움을 줄 수있다. PSI 미립자 siRNA를 보호 및 지속 방출을 가능하게하면서 또한, PEI의 존재는 세포 내 흡수 및 엔도 좀 탈출 어시스트 할 수있다. PSI 입자 서서히함으로써 뚜렷한 형태 및 좁은 크기 분포를 갖고 11의 Arg-PEI / siRNA의 나노 입자 (도 1)의 형성의 결과로, 생리적 조건 하에서 분해. PCPS / siRNA의 시스템의 안정성에 관한 자세한 내용은 쉔 등. (11)에 의해 연구를 참조하시기 바랍니다. 두번째 단계의 나노 입자가 초기 prese 나지 않으므로 PCPS 플랫폼은, 종래 MSV 상이1 단 캐리어 (11), (12), NT 퇴화 캐리어하지만 시간에 걸쳐 형성된다. PCPS 시스템의 siRNA의 적재 효율, 세포 독성 유전자 침묵 효율이 시험관 내에서 평가되었다. 형질 전환 효율은 DNA 복구에 관여하는 10 (ATM) 종양 유전자 돌연변이 실조증 확장증 대해 siRNA를 이용하여 측정 하였다. 이전에는, ATM의 억제는 유방암 모델 (10)에서 종양 성장을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

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Protocol

1. 일단 회복 된 입자 준비

  1. 2 시간 동안 95 ° C에서 30 % 과산화수소 용액에서 비 - 작용 화 된 다공성 실리콘 입자를 산화시킨다. 2 % 부드럽게 교반하면서 65 ℃에서 2 일 동안 이소 프로필 알콜 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 용액에 산화 된 입자를 Aminate.
  2. 펠렛을 중단 간단한 초음파 처리를 이용하여, XG 18,800에서 30 분 동안 원심 분리 용액을 이소 프로필 알코올과 에탄올 중 세 번에 두 번 씻어 입자. 단계 1.3 및 1.4을 수행 할 때 에탄올 용액의 입자를 남겨주세요.
  3. 10 ㎖ 동 중성자 원소 희석제 입자 현탁액 (예, 10 μL)의 공지 된 양을 첨가하고, 스톡 용액에 입자의 농도를 결정 입자 계수 분석기 입자를 카운트.
  4. (3- 디메틸 아미노 프로필) - - N '에틸 카보 다이이 미드 하이드로 클로라이드 (EDC, 0.1 nmol의) / N과 N-L 아르기닌 (0.1 nmol의)의 산 그룹을 활성화
  5. 간단히 입자 원액을 초음파 처리하고 L 아르기닌 용액에 10 억 입자를 추가하고 부드러운 교반하면서 실온에서 18 시간 동안 반응을 둡니다.
  6. N의 제 아스파라긴산 기 활성화 - (tert- 부 톡시 카르 보닐) -L- 아스파르트 산 (BOC-의 Asp-OH, 1 nmol의) 4 시간 동안 에탄올 20ml에 EDC (0.1 nmol의) / NHS (0.1 nmol의)과의 부드러운 교반하면서 4 ° C에서.
  7. 10 ml의 에탄올에 50 mg의 폴리에틸렌 이민을 용해 및 BOC-의 ASP-OH 혼합물에 솔루션을 추가합니다. 반응이 부드러운 교반하면서 실온에서 24 시간 동안 진행하자.
  8. 부드러운 교반하면서 6 시간 동안 4 ° C에서 EDC (0.1 nmol의) / NHS (0.1 nmol의)와 BOC-ASP를-OH / PEI 솔루션의 두 번째 아스파르트 산 그룹을 활성화합니다.
  9. 일단 회복 된 입자를 얻으려면, 단계 1.8에서 BOC-ASP를-OH / PEI 솔루션으로 단계 1.5에서 입자 용액을 추가합니다. 반응이 완만 한 성으로 실온에서 18 시간 동안 할 수있게합니다 irring.
  10. 펠렛을 중단 간단한 초음파 처리를 이용하여, XG 18,800에서 30 분 동안 용액을 원심 분리, 에탄올로 입자 용액을 세 번 세척 하였다.

2. 일단 회복 된 입자 특성 분석

  1. 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 입자의 크기를 측정한다.
    1. 깨끗한 실리카 SEM 샘플 스텁에 입자 현탁액의 드롭 (에탄올에 10,000 개 / μL) 놓고 진공하에 실온에서 건조 할 수 있습니다.
    2. 인 - 렌즈 검출기를 사용 3-5mm 작동 거리 8 kV의에서 SEM 이미지를 측정한다.
  2. 입자 분석기 시스템을 이용하여 입자의 제타 전위를 측정한다.
    1. 1 ㎖의 10 mM의 포스페이트 완충액 (pH 7.4)으로 입자 현탁액 10 μL 에탄올 (10,000 개 / μL)를 섞는다.
    2. 절첩 모세관 세포에 샘플을 로딩하여 제조업체의 지시에 따른 제타 전위를 측정한다.
제작 "> 3. 일단 회복 된 입자에서 siRNA의로드

  1. 진공 O / N에서 (PCPS 입자 제조 단계 1.9에서) 일단 회복 된 입자를 건조.
  2. 건조 일단 회복 된 입자와 초음파 처리 살짝 siRNA를 핵산 분해 효소가없는 물 (20 μL) (4 μg의)를 추가합니다. siRNA의 비율로 다음과 같은 입자를 사용하여 2 × 105 개 / 0.2 μg의 siRNA를, 4 × 10 5 개 / 0.2 μg의 siRNA를, 6 × 10 5 개 / 0.2 μg의 siRNA를, 8 × 10 5 개 / 0.2 μg의 siRNA를, 10 × 10 5 개 / 0.2 μg의 siRNA를 12 × 105 개 / 0.2 μg의 siRNA의.
  3. siRNA를가 입자에 결합 할 수 있도록 통에 4 ° C에서 3 시간 (1000 RPM)에 대해 품어.

siRNA를 / PCPS 입자 비율 4. 최적화

  1. siRNA의 비율에 다른 입자 (PCPS 입자에서 siRNA의로드 참조) PCPS / 제어 siRNA의 입자의 20 μL에 DNA 로딩 염료를 추가합니다.
  2. 샘로드다 음과 DNA 겔 얼룩을 함유하는 2 % 아가로 스겔로.
  3. 유동 완충액에서 20 분 동안 120 V의 정전압으로 전기 영동을 수행한다.
  4. 이미지 획득 및 분석 소프트웨어 겔 분석.

일단 회복 된 입자에서의 siRNA의 5 출시

  1. 소듐 도데 실 설페이트 (SDS, 2 %)에서 siRNA의 비율 (단계 3)와 상이한 입자 PCPS / 제어 siRNA를 입자의 20 μL를 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 정치하자.
  2. 샘플 DNA 로딩 염료를 추가합니다.
  3. DNA 젤 얼룩을 포함하는 2 % 아가 로스 젤에로드 샘플.
  4. DNA 전기 영동 장치 및 전원 공급 장치를 사용하여 유동 완충액에서 20 분 동안 120 V의 정전압으로 전기 영동을 수행한다.
  5. 이미지 획득 및 분석 소프트웨어 겔 분석.

일단 회복 된 입자의 6 공 초점 현미경

  1. PCPS / 형광 제어 siRNA의 입자 (10 × 10 5 개 / 0의 5 μl를 추가합니다.유리 커버 슬립 2 μg의 siRNA를 / 20 μL).
  2. 공 초점 현미경으로 입자 층을 시각화.

의 Arg-PEI / 제어의 siRNA 나노 입자의 7 특성

  1. 실리콘 물질을 저하시키고의 Arg-PEI / 제어 siRNA의 나노 입자를 형성하기 위해, 포스페이트 완충 염수 100 ㎕로 PCPS / siRNA의 입자 (10 × 106 PCPS 입자 / 2 μg의 siRNA를)를 첨가하고, 37 ℃에서 (1000 RPM) 흔들 이일.
  2. 18,800 XG에서 30 분 동안 샘플을 원심 분리기 상층 액을 수집합니다.
  3. 동적 광산란 (DLS)으로 형성의 Arg-PEI / siRNA의 나노 입자의 크기를 측정한다.
    1. 1 ml의 10 mM의 인산염 완충액 (pH 7.4)으로 뜨는 10 μl를 혼합하고 플라스틱 큐벳에 배치합니다.
    2. 제조업체의 지시에 따라 입자 분석기 시스템을 이용하여 입자의 크기를 측정한다.
  4. 형성의 Arg / PEI-의 siRNA의 크기와 형태를 결정원자 힘 현미경으로 나노 입자.
    1. 실리콘 웨이퍼 상에 뜨는 위치의 10 μl를 가라.
    2. 원자력 현미경 (AFM)으로 입자를 시각화.

8. 세포 배양

  1. 세포 배양 배지에서 배양 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 5 % CO 2, 95 % 습도에서 37 ° C로 보충.

일단 회복 된 입자와 라이브 세포의 9 공 초점 현미경

  1. 2 웰 배양 플레이트 세포는 24 시간 동안 / 웰 3 × 10 5 세포의 파종 밀도 슬라이드.
  2. 세포에 형광 제어의 siRNA (10 × 10 5 개 / siRNA의 비율이 0.2 μg의 입자, 50 nM의 siRNA를)로드 일단 회복 된 입자를 추가합니다.
  3. 입자 엑스포 다음 12 시간 동안 (실, 5 % CO 2, 95 %의 습도와 37 ° C로 제공됨) 공 초점 현미경으로 세포의 동영상 촬영확인합니다.

일단 회복 된 입자와 고정 세포의 10 공 초점 현미경

  1. 2 웰 배양 플레이트 세포는 24 시간 동안 / 웰 3 × 10 5 세포의 파종 밀도 슬라이드.
  2. 세포에 형광 제어의 siRNA (10 × 10 5 개 / siRNA의 비율이 0.2 μg의 입자, 50 nM의 siRNA를)로드 일단 회복 된 입자를 추가 1 일 7 일 10 일 동안 배양한다.
  3. 인산염 완충 생리 식염수로 두 번 세포를 세척 한 다음 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 수정합니다.
  4. 인산염 완충 생리 식염수 세포를 씻으십시오.
  5. 10 분 동안 0.1 % 옥틸 페놀에 톡실 레이트와 세포를 Permeabilize 하시려면 다음 그들에게 인산염 완충 생리 식염수로 3 회 세척한다.
  6. 부드럽게 교반하면서 RT에서 10 분 동안 인산 완충 생리 식염수에 소 혈청 (10 ㎎ / ㎖)에서 알부민 세포를 차단.
  7. (1 μL / 40 μl를 형광 표지 팔로이 딘과 세포를 배양, 사상 액틴을 시각화하는 방법부드러운 교반하면서 실온에서 20 분 동안 솔루션을) 차단 한 후 인산염 완충 식염수로 세척한다.
  8. 프레임에서 슬라이드를 제거하고 핵을 시각화하기 위해 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)와 antifade 시약을 추가합니다.
  9. 상단에 커버 유리를 추가하고 공 초점 현미경으로 세포의 이미지를 가져 가라.

PCPS / 형광 제어 siRNA의 입자와 세포의 11 유동 세포 계측법

  1. 24 시간 동안 / 웰 3 × 10 5 세포의 파종 밀도에서 6 웰 플레이트에 플레이트 세포.
  2. 세포에 형광 제어의 siRNA (10 × 10 5 개 / siRNA의 비율이 0.2 μg의 입자, 50 nM의 siRNA를)로드 일단 회복 된 입자를 추가하고 24 시간 동안 배양한다.
  3. 인산염 완충 생리 식염수 세포를 씻고 셀 스크레이퍼로 긁어.
  4. 분석에 앞서 2 % 우 태아 혈청 인산염 완충 생리 식염수에 세포를 보관합니다. 음성 대조군으로 치료 세포를 사용합니다.
  5. 흐름 CY를 수행tometry.

일단 회복 된 입자 및 PCPS / 제어 siRNA의 입자와 세포의 12 세포 생존

  1. 24 시간 동안 / 웰 3 × 10 3 세포의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 플레이트 세포.
  2. PCPS 입자로 세포를 처리 (1.5 × 105 / 웰, 6 × 105 / 웰) 또는 PCPS / 제어 siRNA의 입자 (48) (10 × 10 5 개 / siRNA의 비가 0.2 μg의 입자, 10 nM 내지 100 nM의 siRNA의) 시간과 72 시간. 컨트롤 등의 인산염 완충 생리 식염수 (추가 된 입자와 같은 볼륨)로 처리 처리하지 않은 세포와 세포를 사용합니다. 세중 각 샘플을 분석.
  3. 제조업체의 지시에 따라 세포 증식 분석을 수행한다.
  4. 표준 편차 평균 ± 같은 데이터를 나타냅니다.

PCPS / ATM 변이 된 siRNA의 입자와 세포의 13 서쪽 오점

  1. 셀 밀도 2 × 10 5 세포 / w에게에서 6 웰 플레이트에 플레이트 세포24 시간 동안 엘.
  2. PCPS / 제어의 siRNA (50 ㎚) 입자 또는 PCPS / ATM siRNA를 72 시간 동안 (50 ㎚) 입자와 세포를 품어. 대조군으로 치료 세포를 사용합니다.
  3. 를 Lyse 프로테아제 저해제 칵테일로 보충 단백질 추출 시약을 이용하여 세포.
  4. 14,000 XG에서 10 분 동안 세포 용 해물을 원심 분리기와 뜨는을 복구 할 수 있습니다.
  5. 제조업체의 지시에 따라 단백질 정량 분석​​으로 단백질 농도를 결정한다.
  6. (5 μL 2- 머 캅토 에탄올 / ㎖ 버퍼) 샘플 로딩 버퍼를 추가 샘플 및 99 ° C에서 6 분을 가열한다.
  7. 유동 완충액에서 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서의 단백질 시료 (20 ㎍ / μL)을로드하고, 전기 영동 장치 및 전원 공급 장치를 사용하여 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (1 시간, 120 V)를 수행한다.
  8. 전기 영동 장치를 이용하여 니트로 셀룰로오스 막 (1 시간, 100 V) 내지 (20 % 메탄올로) 전송 버퍼에서 젤 옮기고전원 공급 장치.
  9. 1 시간 동안 5 % 분유와 멤브레인을 차단합니다.
  10. 1000 희석 O / N : 1 (단계 13.9)에서 차단 솔루션에 (토끼)에서 ATM 차 항체와 멤브레인을 품어.
  11. 1 시간 동안 2500 희석 : 1에서 0.1 % 폴리에틸렌 글리콜 소르 비탄 모노 라우 레이트를 함유하는 인산염 완충 식염수로 멤브레인을 세척하고 (단계 13.9)에서 차단 용액에 이차 항체 (항 - 토끼)와 함께 배양한다.
  12. 0.1 % 폴리에틸렌 글리콜 소르 비탄 모노 라우 레이트를 함유하는 인산염 완충 식염수로 세척하고 막을 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 검출 시약과 단백질 밴드를 검출한다.
  13. 부하 제어를 위해, 막 씻어 반복 (마우스에서 1 : 10,000 희석) β - 굴지 차 항체를 사용하여 13.9-13.12 단계 (항 - 마우스 1 : 4000 희석)와 이차 항체를.

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Representative Results

이 프로토콜은 안전하고 효율적인 siRNA를 형질 전환 용 비 바이러스 전달 시스템의 사용 방법에 대해 설명한다. SEM 결과 PCPS 입자는 원통형 형상이고 2.6 μm의 (도 2a)의 직경을 갖는 것을 알 수있다. 입자는 긍정적으로하여 음으로 대전 된 뉴클레오티드 바인딩 정전기를 가능하게 약 8.21의 제타 전위 (그림 2B)로 청구됩니다. 일단 회복 된 입자의 서로 다른 계층의 공 촛점 이미지는 형광 제어의 siRNA는 다공성 실리콘 입자 (그림 2C) 내부에로드되어 있는지 보여줍니다. PSI 입자에서의 Arg-PEI /의 siRNA 나노 입자의 형성과 방출은 DLS 및 AFM으로 확인되었다. 입자 크기 분포는 94 내지 (도 2D)의 평균 크기, 70-120 nm 내지였다. AFM 이미지는 나노 입자는 구형 (도 2e)을 가지고 있음을 보여준다.

라티siRNA를 행 입자 O 높은 결합 친화도 (도 3A)을 보장하기 위해, 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 최적화되었다. siRNA의 비율로 입자의 넓은 범위 (2 × 105 개를 사용하고, 4 × 105, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10, 12 × 5 10 5 μg의 siRNA를 /0.2). 결과는 입자 크기가 8 × 105 이상인 경우의 siRNA 입자에 단단히 결합 할 수 있음을 나타낸다. 10 × 105 PCPS /의 비율이 0.2 μg의 siRNA를 추가 실험을 위해 선택 하였다. 도 3b에 도시 된 바와 같이, SDS로 처리 할 때 또한, siRNA를 성공적 담체로부터 방출시켰다.

다음, PCPS / 형광 제어 siRNA의 입자의 지하실 국제화는 MDA-MB-231 세포에서 평가 하였다. 공 초점 이미지는 입자가 효과적으로 세포에 내장되어 있습니다 치료 쇼의 24 시간 (그림 4 후 촬영 그림 5는 세포의 89 %가 배양 24 시간 후 PCPS / siRNA의 입자를 내면화 한 것을 보여줍니다. 더욱이, 내재화 공정은 12 시간 (비디오 1)에 대해 기록 하였다. 이러한 결과는 PCPS 입자 세포 내로 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있음을 나타낸다. 세포 내부의 siRNA의 장기 축적은 공 초점 현미경에 의해 평가 하였다. 7 일 및 10 일에 siRNA를 여전히 세포 (그림 6) 내부에 나타났다.

siRNA의 전달 시스템을 개발하는 캐리어 (13)의 안전성 때 가장 중요한 요소 중 하나는 고려. PEI는 siRNA를, 엔도 / 리소좀에서 세포 흡수에 도움 트리거 릴리스 폴리 플렉스를 형성하는 것으로 알려져있다. 그러나, PEI 인해 주쇄 14,15에서 양전하 차 아미노기의 존재로, 독성을 가질 수있다. 예를 들어, PEI는 FO 초래할 수 세포 표면에 결합 글리코 칼 릭스큰 클러스터 (16)의 rmation. 이 전하 - 유도 독성을 제거하기 위하여, PEI는 공유 차 아미노기의 수를 줄이기 위해, 브리지 아르기닌 링커를 통해 접합 하였다. 입자의 siRNA는 상 / 웰 및 100 nM의 각각 (도 7A) × 105 (6)의 농도로 사용되었을 때 세포 생존 능력은 48 시간 및 72 시간 후 95 % 이상 남아 있었다. 다음에, ATM 대한 siRNA를 종양 유전자의 형질 전환 효능은 MDA-MB-231 세포에서 평가 하였다. 웨스턴 블롯 결과는 ATM의 단백질 수준이 PCPS / ATM의 siRNA (그림 7B)와 치료 후 감소되어 있음을 보여줍니다. 결과 PCPS 플랫폼 siRNA에 대한 안전하고 효율적인 전달 시스템이다 제안한다.

그림 1
폴리 양이온 기능화 된 다공성 실리콘 (PCPS) 입자의 도식 표현을 그림. 강한> 아르기닌 (ARG) 선수 -polyethylenimine (PEI)을 / 작은 간섭 RNA (siRNA를) 나노 입자는 실리콘의 저하 (SI) 다음 형성된다.

그림 2
PCPS 입자도 2 특성화. PCPS 입자 (A) 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지. (B) PCPS 입자의 제타 전위. (C) PCPS / 형광 제어 siRNA의 입자의 다른 레이어의 공 초점 이미지. 다공성 실리콘 미립자로부터 방출 아르기닌의 Arg-PEI / 제어 siRNA의 나노 입자 (D) 크기 분포. 의 Arg-PEI / 제어의 siRNA 나노 입자 (E) 원자 힘 현미경 (AFM) 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항상 "> :"유지 - together.within 페이지를 = FO "ve_content 그림 3
PCPS /의 siRNA 전달 시스템의 최적화를위한 그림 3. 아가 로스 젤. (A) 일단 회복 된 입자 사이의 결합 친화 및 siRNA를을 제어 할 수 있습니다. 밴드는 언 바운드 된 siRNA를 나타냅니다. (B) siRNA의 자료는 1 시간 동안 2 % SDS와 배양을 다음. 밴드 (언 바운드 및 바운드) 전체의 siRNA를 나타냅니다. 샘플 1 : siRNA의; 샘플 2 : 2 × 105 PCPS 입자 / 0.2 μg의 siRNA와; 샘플 3 : 4 × 10 5 PCPS 입자 / 0.2 μg의 siRNA와; 샘플 4 : 6 × 10 5 PCPS 입자 / 0.2 μg의 siRNA와; 샘플 5 : 8 × 105 PCPS 입자 / 0.2 μg의 siRNA와; 샘플 6 : 10 × 10 5 PCPS 입자 / 0.2 μg의 siRNA의; 샘플 7 : 12 × 10 5 PCPS 입자 / 0.2 μg의 siRNA를.

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그림 MDA-MB-231 세포에서 PCPS / 형광 siRNA의 입자 (적색) (24 시간 배양) 4. 공 초점 현미경 이미지. 핵 및 사상 굴지의 4 가시화되었다 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI, 블루 각각) 및 팔로이 딘 (녹색). 세 가지 다른 층 (상단, 중간 및 기초) 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 PCPS / 제어 siRNA의 형광 입자를 배양 한 후 형광 MDA-MB-231 세포의 세포 계측법 분석 5. 유동 계량. 비 처리 세포를 음성 대조군으로 사용 하였다. 세포의 89 %는 입자를 내재화했다.

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그림 MDA-MB-231 세포 내부에 형광 제어의 siRNA (빨간색)의 6 공 초점 이미지. 세포 PCPS / 형광 제어의 siRNA 1 일 동안 입자 7 일, 10 일간의 배양 하였다. 세포를 공 초점 현미경을 가시화 하였다. 핵 및 사상 굴지 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI, 파란색)과 팔로이 딘 (녹색)으로 시각화하고, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
도 7 및 세포 생존율 시험 관내에서 유전자 침묵. (A) PCPS 입자 및 PCPS / 제어 siRNA의 입자 (SCR) 배양 세포의 세포 생존 분석. 실험은 여행을 실시 하였다licate 및 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시합니다. PBS로 세포를 배양 한 미처리 (공백)과 세포를 대조군으로 사용 하였다. (B) (ATM) siRNA의 입자 돌연변이 PCPS / 실조증 모세 혈관 확장증의 웨스턴 블롯. 세포 PCPS / 제어의 siRNA (SCR) 입자 및 PCPS / ATM siRNA의 입자에 노출시켰다. 미처리 세포 (모의) 대조군으로 사용 하였다. β 액틴은 로딩 대조군으로 사용 하였다.

비디오 1 라이브 MDA-MB-231 세포에서 PCPS / 형광 제어 siRNA의 입자. 시간 의존적 흡수는. 비디오 입자에 세포를 노출 한 후 12 시간 동안 기록했다.

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Discussion

이 프로토콜은 세포로의 siRNA의 형질 감염과 성공적으로 전달하기위한 방법을 설명한다. 특히,의 siRNA 전달 폴리 양이온 - 작용 PSI 입자로 구성된 다기능 플랫폼을 사용함으로써 달성된다. siRNA의 치료의 사용은 여러 종양 유전자가 높은 특이성으로 타겟팅 할 수있는 큰 잠재력 예, 암 치료를 갖는다. 따라서, siRNA의 치료 문제를 완화 할 수있는 siRNA를 전달 비히클을 개발할 필요가 존재한다. 결론적으로, 우리의 siRNA의 안전하고 효율적인 전달을위한 약속을 보여줍니다 프로토콜을 설명했다. 그러나, 기술 된 기법을 수행 할 때 고려되어야 할 중요한 요소는 몇 가지가있다. 예를 들어, PCPS 입자를 제조하는 중요한 고려 사항은 뉴 클레아 제에 의해 분해를 방지하기 위해주의 깊게의 siRNA를 처리하는 것이다. 작업을 할 때 특히, 깨끗한 장갑과의 RNAse에서 무료 튜브와 물이 항상 사용되어야한다siRNA를. siRNA의 형질 전환 효율이 낮은 경우, RNAse가 오염 제거 스프레이 장갑 및 작업 영역을 분무하기 위해 사용될 수있다. 형질 전환이 실패 할 경우뿐만 아니라, si​​RNA의 문제가 된 siRNA 또는 입자에 의해 야기되는지 여부를 결정하기 위해, 상업용 형질 전환 시약으로 시험되어야한다. PCPS /의 siRNA 전달 시스템의 성공적인 구현을위한 또 다른 중요한 고려 사항은 원심 분리 및 세척 단계를 수행 할 때주의를 기울여야하는 것입니다. 즉, 상청액을 완전히 입자 제조 단계에 걸쳐 요구되는 과량의 시약을 제거하는 폐기되어야한다.

PCPS /의 siRNA 전달 시스템의 중요한 장점은 안전하다. 몇 가지 siRNA를 형질 에이전트는 세포 독성 (13, 15)에 기여하는 높은 양이온 전하를 보유하고 있습니다. 실제로, 대부분의 상용 프로토콜 시약 세포 죽음을 피하기 위해, 단지 몇 시간 동안 세포와 함께 배양해야 함을 나타낸다. 반대로, CE에세포 생존율 결과에서 명백한 바와 같이 LLS는 독성의 흔적없이 며칠 동안 PCPS 입자에 노출 될 수있다. PCPS 입자 인해 PEI의 존재에 대하여 친 화성이 높은 siRNA를 바인딩 할 수있다. 그러나 PEI의 전하 - 유도 독성 전달 플랫폼 고유의 설정에 의해 방지된다. 특히 PEI의 Arg로의 공유 결합과 Si를 내부 PEI의 캡슐화는 독성이 감소에 기여 모공. PCPS 플랫폼의 또 다른 장점은 siRNA의 형질 감염은 혈청의 존재 하에서 일어날 수 있다는 것이다. 다른 기존의 방법들은 일반적으로 이에 형질 전환 공정 단계를 추가로 첨가하고, 잠재적으로 보통 세포 신호 전달 경로를 방해, 무 혈청 세포 배양 배지의 사용을 필요로한다.

PCPS 시스템의 부가적인 장점은 siRNA를 임의의 변형을 필요로하지 않는다는 것이다. 일부 현재의 방법은 복잡한 접합 단계 siRNA를 안정화 또는 C를 활성화를 필요로하지만ellular 내재화 (13)는, 일단 회복 된 시스템은 siRNA를 로딩 단순 혼합에 의존합니다. PEI와 결합 된 Si 재료 기공 클레아하여 접촉 환원, siRNA에 대한 보호 환경을 제공한다. PCPS 입자는 건조 된 물질로서 이소 프로필 알코올에 장시간 동안 저장 될 수있다. PCPS / siRNA의 입자는 또한 동결 건조되는 경우, 이들은 4 ℃에서 3 개월 이상 동안 저장 될 수있다. 동결 건조 일단 회복 된 입자는 형질 전환 이전의 RNase없는 물에 현탁되어야하고, 솔루션에 저장 할 수 없습니다. 따라서 이전에 유전자 타겟팅 억제 유지되는 시간을 증가시킨다 (11)를보고 마지막 PCPS 플랫폼 허가, siRNA와의 지속 방출. 따라서, 셀룰러 내재화 후, 실리콘 입자는 점차적의 Arg-PEI / siRNA의 나노 입자의 형성의 결과로 저하. 그 후, siRNA를 천천히가 멧세 결합 할 수 세포질에 해제nger RNA (mRNA의이)로 정제하여 생물학적 활성을 발휘. PCPS 입자는 siRNA의 전달을위한 기존의 방법에 비해 여러 가지 장점을 제공하지만, 기술의 한계는 비 - 작용 PSI 미립자 원료로서 필요하다는 것이다. 입자가 포토 리소그래피 및 전기 화학적 에칭 (17)을 이용하여 합성 할 수 있지만, 이들 기술은 모든 기관에서 즉시 사용할 수 없다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

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References

  1. De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6, (6), 443-453 (2007).
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