SiRNA चिकित्सा विज्ञान की डिलीवरी के लिए झरझरा सिलिकॉन microparticles

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Bioengineering

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Summary

डिलिवरी छोटे दखल शाही सेना (siRNA) के चिकित्सीय कार्यान्वयन के लिए मुख्य चुनौती बनी हुई है। इस प्रोटोकॉल arginine और polyethylenimine grafted झरझरा सिलिकॉन microparticles से मिलकर, एक multifunctional और biocompatible siRNA वितरण मंच का इस्तेमाल शामिल है।

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Shen, J., Wu, X., Lee, Y., Wolfram, J., Yang, Z., Mao, Z. W., Ferrari, M., Shen, H. Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics. J. Vis. Exp. (95), e52075, doi:10.3791/52075 (2015).

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Abstract

Introduction

छोटे दखल RNAs (siRNAs) जीनों की अभिव्यक्ति को दबा सकते हैं कि डबल असहाय आरएनए अणु होते हैं। हाल के वर्षों में, siRNAs नैदानिक ​​अनुप्रयोगों 1-5 में भविष्य में इस्तेमाल के लिए चिकित्सीय क्षमता दिखाने कि biodrugs की एक नई पीढ़ी के रूप में विकसित किया गया है। हालांकि, siRNA चिकित्सा के सफल क्रियान्वयन के कारण न्युक्लिअसिज़, गरीब intracellular तेज, कम अभिकर्मक दक्षता और endosome / लाइसोसोम 5 से अक्षम रिलीज से क्षरण करने के लिए, एक काफी चुनौती बनी हुई है। इन बाधाओं में से कई लोग सुरक्षित रूप से और कुशलता से रोगग्रस्त ऊतकों को siRNA वितरित कर सकते हैं, जो वितरण प्लेटफार्मों का विकास, के द्वारा दूर किया जा सकता है। वायरल वाहकों की तुलना में, गैर वायरल प्लेटफार्मों इस तरह की सुरक्षा, कम लागत और सिलाई की आसानी के रूप में कई लाभ प्रदान करते हैं। ऐसे पॉलिमर और लिपिड के रूप में विशेष रूप से, cationic नैनोकणों में, siRNA वितरण 3 के लिए उपयोगी साबित हुई है।

इससे पहले, हम एक चक्रिकाभ डॉ विकसित किया हैवितरण प्रणाली स्नातकीय, multistage वेक्टर (एमएसवी) करार दिया। इस मंच के एक वाहन एक दूसरे से जारी किया गया है, जिसमें अनुक्रमिक चरणों पर आधारित है। दूसरे चरण वाहनों दवाओं या विपरीत एजेंटों 6,7 के साथ भरी हुई नैनोकणों रहे हैं, जबकि पहले चरण वाहन, biodegradable, झरझरा सिलिकॉन (साई) से बने एक microparticle है। सी 8 degrades के रूप में साई सामग्री में एम्बेडेड रहे हैं जो नैनोकणों, धीरे-धीरे जारी कर रहे हैं। सी कणों का उपयोग करने का एक लाभ यह आकृति विज्ञान और सतह विशेषताओं आसानी से इष्टतम biodistribution और नशीली दवाओं के रिलीज को प्राप्त करने के आधार पर किया जा सकता है। हाल ही में, ट्यूमर के ऊतक को siRNA liposomes की डिलीवरी के लिए एमएसवी मंच का सफल प्रयोग एक डिम्बग्रंथि और स्तन कैंसर माउस मॉडल 9, 10 में दिखाया गया था।

इस काम में, हम एमएसवी मंच के प्रिंसिपलों पर आधारित siRNA के लिए एक सार्वभौमिक वितरण प्रणाली गढ़े गए हैं। इस वितरण प्रणाली की प्रभावकारिता हमें पहले प्रदर्शन किया गया हैअलग siRNA आईएनजी 11 अणु है। प्रणाली polyethylenimine (पी) और arginine (ARG) के साथ grafted साई से मिलकर, एक polycation-क्रियाशील झरझरा सिलिकॉन (PCPs) वाहक है। Arg और साई पी की विषाक्तता को कम करने के लिए सेवा कर सकते हैं, जबकि पहले से 11 demonstarted के रूप में पी, siRNA साथ बातचीत electrostatic बनाने में सहायता कर सकते हैं। साई microparticles siRNA के संरक्षण और निरंतर जारी सक्षम है, जबकि इसके अलावा, पी की उपस्थिति, intracellular तेज और endosomal भागने में सहायता कर सकते हैं। साई कणों धीरे-धीरे जिससे एक अलग आकृति विज्ञान और एक संकीर्ण आकार वितरण 11 है जो Arg-पी / siRNA नैनोकणों (चित्रा 1) के गठन में जिसके परिणामस्वरूप, शारीरिक शर्तों के तहत नीचा। PCPs / siRNA प्रणाली की स्थिरता के बारे में जानकारी के लिए, शेन एट अल। 11 से अध्ययन करने के लिए देखें। दूसरे चरण नैनोकणों शुरू में prese नहीं कर रहे हैं के बाद से यह PCPs मंच, पारंपरिक एमएसवी से अलग हैपहले चरण के वाहक 11, 12 degrades के रूप में NT वाहक में है, लेकिन समय के साथ बनते हैं। PCPs प्रणाली की siRNA लोड हो रहा है दक्षता, cytotoxicity और जीन मुंह बंद दक्षता विट्रो में मूल्यांकन किया गया है। अभिकर्मक दक्षता डीएनए की मरम्मत 10 में शामिल है, जो (एटीएम) ओंकोजीन उत्परिवर्तित गतिभंग telangiectasia, के खिलाफ siRNA का उपयोग कर मापा गया था। इससे पहले, एटीएम का दमन एक स्तन कैंसर मॉडल 10 में ट्यूमर के विकास को कम करने के लिए दिखाया गया है।

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Protocol

1. PCPs कण तैयारी

  1. 2 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक 30% समाधान में गैर-Functionalized झरझरा सिलिकॉन कणों oxidize। 2% कोमल सरगर्मी के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए isopropyl शराब में (3 aminopropyl) triethoxysilane समाधान में ऑक्सीकरण कणों Aminate।
  2. गोली निलंबित करने के लिए संक्षिप्त sonication के उपयोग करते हुए, 18,800 XG पर 30 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र और isopropyl शराब और इथेनॉल में तीन बार में दो बार कणों धो लें। कदम 1.3 और 1.4 जब प्रदर्शन इथेनॉल समाधान में कणों को छोड़ दें।
  3. 10 मिलीलीटर isotone मंदक के कण निलंबन (जैसे, 10 μl) की एक ज्ञात मात्रा जोड़ें और शेयर समाधान में कणों की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक कण गिनती विश्लेषक के साथ कणों गिनती।
  4. (3-dimethylaminopropyl) - - एन '-ethylcarbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी, 0.1 nmol) / एन एन के साथ एल arginine (0.1 nmol) की एसिड समूह सक्रिय
  5. संक्षेप में कण शेयर समाधान sonicate और एल arginine समाधान के लिए 1 अरब कणों को जोड़ने और कोमल सरगर्मी के साथ आरटी पर 18 घंटे के लिए प्रतिक्रिया छोड़ दें।
  6. एन के पहले Aspartic एसिड समूह सक्रिय - (tert-Butoxycarbonyl) एल Aspartic एसिड (बीओसी-ASP-ओह, एक nmol) 4 घंटे के लिए इथेनॉल के 20 मिलीलीटर में ईडीसी (0.1 nmol) / एनएचएस (0.1 nmol) के साथ कम से कोमल सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस।
  7. 10 मिलीलीटर इथेनॉल में 50 मिलीग्राम polyethylenimine भंग और बीओसी-ASP-ओह मिश्रण का हल जोड़ें। प्रतिक्रिया कोमल सरगर्मी के साथ आरटी पर 24 घंटे के लिए आगे बढ़ना।
  8. कोमल सरगर्मी के साथ छह घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ईडीसी (0.1 nmol) / एनएचएस (0.1 nmol) के साथ Boc-ASP-ओह / पी समाधान की दूसरी Aspartic एसिड समूह को सक्रिय करें।
  9. PCPs कणों को प्राप्त करने के कदम 1.8 से Boc-ASP-ओह / पी समाधान में 1.5 कदम से कण समाधान जोड़ें। प्रतिक्रिया कोमल सेंट के साथ आरटी पर 18 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति irring।
  10. गोली निलंबित करने के लिए संक्षिप्त sonication के उपयोग करते हुए, 18,800 XG पर 30 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र और इथेनॉल के साथ कण समाधान तीन बार धोएं।

2. PCPs कण लक्षण

  1. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग कर कणों के आकार को मापने।
    1. एक साफ सिलिका SEM के नमूना ठूंठ पर कण निलंबन की एक बूंद (इथेनॉल में 10,000 कणों / μl) प्लेस और वैक्यूम के अंतर्गत आरटी पर दो सूखी।
    2. एक में लेंस डिटेक्टर का उपयोग कर एक 3-5 मिमी दूरी काम के साथ 8 केवी पर SEM छवियों उपाय।
  2. एक कण विश्लेषक प्रणाली का उपयोग कर कणों की जीटा संभावित उपाय।
    1. 1 मिलीलीटर मिमी 10 की फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) के साथ कण निलंबन के 10 μl (इथेनॉल में 10,000 कणों / μl) मिलाएं।
    2. मुड़ा केशिका कोशिकाओं में नमूना लोड और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जीटा संभावित उपाय।
Le "> 3। PCPs कणों में siRNA के लोड हो रहा है

  1. वैक्यूम हे / एन के तहत (PCPs कण तैयारी कदम 1.9 से) PCPs कणों सूखी।
  2. सूखे PCPs कणों और sonicate संक्षिप्त करने के लिए siRNA nuclease मुक्त पानी (20 μl) में (4 माइक्रोग्राम प्रति) जोड़ें। SiRNA के अनुपात के लिए निम्न कण का उपयोग करें: 2 × 10 5 कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA, 4 × 10 5 कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA, 6 × 10 5 कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA, 8 × 10 5 कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA, 10 × 10 5 कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA और 12 × 10 5 कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA।
  3. SiRNA के कणों के लिए बाध्य करने की अनुमति के लिए एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा (1000 आरपीएम) के लिए सेते हैं।

SiRNA / PCPs कण अनुपात 4. अनुकूलन

  1. SiRNA के अनुपात करने के लिए अलग कण (PCPs कणों में siRNA की लोडिंग देखें) के साथ PCPs / नियंत्रण siRNA के कणों के 20 μl डीएनए लोड हो रहा है डाई जोड़ें।
  2. सैम लोडमंदिरों डीएनए जेल दाग युक्त एक 2% agarose जेल में।
  3. चल बफर में 20 मिनट के लिए 120 वी के एक निरंतर वोल्टेज में वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते हैं।
  4. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ जेल का विश्लेषण करें।

PCPs कण से siRNA के 5. रिलीज

  1. सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस, 2%) में siRNA अनुपात (चरण 3 देखें) के लिए अलग कण के साथ PCPs / नियंत्रण siRNA के कणों के 20 μl मिक्स और आरटी पर 1 घंटे के लिए खड़े हो जाओ।
  2. नमूने के डीएनए लोड हो रहा है डाई जोड़ें।
  3. डीएनए जेल दाग युक्त एक 2% agarose जेल में लोड नमूने हैं।
  4. डीएनए वैद्युतकणसंचलन उपकरण और एक बिजली की आपूर्ति का उपयोग कर चल बफर में 20 मिनट के लिए 120 वी के एक निरंतर वोल्टेज में वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते हैं।
  5. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ जेल का विश्लेषण करें।

PCPs कण 6. confocal माइक्रोस्कोपी

  1. PCPs / फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA के कणों (10 × 10 5 कणों / 0 से 5 μl जोड़ें।एक गिलास को कवर पर्ची के लिए 2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA / 20 μl)।
  2. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कण परतों कल्पना।

Arg-पी / नियंत्रण siRNA नैनोकणों 7. विशेषता

  1. सिलिकॉन सामग्री को नीचा दिखाना और Arg-पी / नियंत्रण siRNA नैनोकणों फार्म, फॉस्फेट बफर खारा के 100 μl को PCPs / siRNA के कणों (10 × 10 6 PCPs कणों / 2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA) जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस (1000 आरपीएम) हिला दो दिनों के लिए।
  2. 18,800 XG पर 30 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  3. गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) के साथ बनाई Arg-पी / siRNA नैनोकणों के आकार को मापने।
    1. 1 मिलीलीटर 10 मिमी फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) के साथ सतह पर तैरनेवाला के 10 μl मिक्स और एक प्लास्टिक क्युवेट में जगह है।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक कण विश्लेषक प्रणाली का उपयोग कर कणों के आकार को मापने।
  4. का गठन Arg / पी-siRNA के आकार और आकृति विज्ञान का निर्धारण करते हैंपरमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ नैनोकणों।
    1. एक सिलिकॉन वेफर पर सतह पर तैरनेवाला और जगह के 10 μl ले लो।
    2. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के साथ कणों कल्पना।

8. सेल संस्कृति

  1. सेल संस्कृति मीडिया में संस्कृति एमडीए MB-231 मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता और 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक।

PCPs कणों के साथ जीवित कोशिकाओं के 9. confocal माइक्रोस्कोपी

  1. 2-अच्छी तरह से संस्कृति में प्लेट कोशिकाओं 24 घंटा के लिए अच्छी तरह / 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व में स्लाइड।
  2. कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA (10 × 10 5 कणों / siRNA के अनुपात को 0.2 माइक्रोग्राम प्रति कण, 50 एनएम siRNA) के साथ भरी हुई PCPs कणों जोड़ें।
  3. कण एक्सपो निम्नलिखित 12 घंटे के लिए (एक कक्ष, 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता और 37 डिग्री सेल्सियस के साथ आपूर्ति) एक confocal खुर्दबीन के साथ कोशिकाओं की एक फिल्म रिकॉर्डपक्का।

PCPs कणों के साथ तय कोशिकाओं के 10 confocal माइक्रोस्कोपी

  1. 2-अच्छी तरह से संस्कृति में प्लेट कोशिकाओं 24 घंटा के लिए अच्छी तरह / 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व में स्लाइड।
  2. कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA (10 × 10 5 कणों / siRNA के अनुपात को 0.2 माइक्रोग्राम प्रति कण, 50 एनएम siRNA) के साथ भरी हुई PCPs कणों जोड़ें और एक दिन, 7 दिन और 10 दिनों के लिए सेते हैं।
  3. फॉस्फेट बफर खारा के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और फिर 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde समाधान के साथ उन्हें ठीक।
  4. फॉस्फेट बफर खारा के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  5. 10 मिनट के लिए 0.1% octyl फिनोल ethoxylate के साथ कोशिकाओं permeabilize और फिर उन्हें फॉस्फेट बफर खारा के साथ तीन बार धोएं।
  6. कोमल सरगर्मी के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर खारा में गोजातीय सीरम (10 मिलीग्राम / एमएल) से एल्बुमिन के साथ कोशिकाओं को अवरुद्ध करें।
  7. (1 μl / 40 μl fluorescently लेबल phalloidin के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, filamentous actin के कल्पना करने के लिएकोमल सरगर्मी के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए समाधान) अवरुद्ध और फिर फॉस्फेट बफर खारा में धो लें।
  8. फ्रेम से स्लाइड्स निकालें और नाभिक कल्पना करने के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ antifade अभिकर्मक जोड़ें।
  9. शीर्ष पर एक कांच कवर जोड़ें और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ कोशिकाओं की छवियों को ले लो।

PCPs / फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA के कणों के साथ कोशिकाओं के 11. फ्लो

  1. 24 घंटा के लिए अच्छी तरह / 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व में 6 अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं।
  2. कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA (10 × 10 5 कणों / siRNA के अनुपात को 0.2 माइक्रोग्राम प्रति कण, 50 एनएम siRNA) के साथ भरी हुई PCPs कणों जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. फॉस्फेट बफर खारा के साथ कोशिकाओं को धो लें और एक सेल खुरचनी के साथ उन्हें कुरेदना।
  4. विश्लेषण करने से पहले 2% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ फॉस्फेट बफर खारा में सेल की दुकान। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं का प्रयोग करें।
  5. प्रवाह cy सम्पन्नtometry।

PCPs कणों और PCPs / नियंत्रण siRNA के कणों के साथ कोशिकाओं के 12. सेल व्यवहार्यता

  1. 24 घंटा के लिए अच्छी तरह / 3 × 10 3 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व में एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं।
  2. PCPs कणों के साथ कोशिकाओं का इलाज (1.5 × 10 5 / अच्छी तरह से और 6 × 10 5 / अच्छी तरह से) या PCPs / नियंत्रण siRNA के कणों 48 के लिए (10 × 10 5 कणों / siRNA के अनुपात को 0.2 माइक्रोग्राम प्रति कण, 10 एनएम और 100 एनएम siRNA) घंटा और 72 घंटा। नियंत्रण के रूप में फॉस्फेट बफर खारा (जोड़ा कणों के रूप में एक ही मात्रा) के साथ इलाज अनुपचारित कोशिकाओं और कोशिकाओं का प्रयोग करें। तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूना परख।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सेल प्रसार परख प्रदर्शन करते हैं।
  4. मानक विचलन ± मतलब के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व।

PCPs / एटीएम उत्परिवर्तित siRNA के कणों के साथ कोशिकाओं के 13. वेस्टर्न ब्लाट

  1. एक सेल घनत्व 2 × 10 5 कोशिकाओं / डब्ल्यू में 6 अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं24 घंटा के लिए पक्ष।
  2. PCPs / नियंत्रण siRNA (50 एनएम) कणों या PCPs / एटीएम siRNA के 72 घंटे के लिए (50 एनएम) कणों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। एक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं का प्रयोग करें।
  3. Lyse एक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ पूरक एक प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग कोशिकाओं।
  4. 14,000 XG पर 10 मिनट के लिए सेल lysates अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला ठीक हो।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रोटीन मात्रा का ठहराव परख के साथ प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
  6. (साथ 5 μl 2-मर्केप्टोइथेनाल / एमएल बफर) नमूना लोड हो रहा है बफर जोड़ें नमूने लिए और 99 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए उन्हें गर्मी।
  7. बफर चलाने में एक 12% एसडीएस polyacrylamide जेल में प्रोटीन के नमूने (20 माइक्रोग्राम प्रति / μl) लोड और वैद्युतकणसंचलन उपकरण और एक बिजली की आपूर्ति का उपयोग कर polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (1 घंटा, 120 वी) प्रदर्शन करते हैं।
  8. वैद्युतकणसंचलन उपकरण का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली (1 घंटा, 100 वी) (20% मेथनॉल) के साथ स्थानांतरण बफर में जेल स्थानांतरण औरएक बिजली की आपूर्ति।
  9. 1 घंटे के लिए 5% सूखा दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक।
  10. 1,000 कमजोर पड़ने हे / एन: एक एक पर (कदम 13.9) से अवरुद्ध समाधान में (खरगोश) से एटीएम प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं।
  11. 1 घंटे के लिए 2,500 कमजोर पड़ने: एक एक पर 0.1% पॉलीथीन ग्लाइकोल Sorbitan monolaurate युक्त फॉस्फेट बफर खारा साथ झिल्ली धो लें और फिर (कदम 13.9) से अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी खरगोश) के साथ सेते हैं।
  12. 0.1% पॉलीथीन ग्लाइकोल Sorbitan monolaurate युक्त फॉस्फेट बफर खारा साथ झिल्ली धो लें और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पश्चिमी धब्बा पता लगाने अभिकर्मक के साथ प्रोटीन बैंड का पता लगाने।
  13. लोड हो रहा है नियंत्रण के लिए, झिल्ली धोने और दोहराने (माउस से एक: 10,000 कमजोर पड़ने) एक β-actin के प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग 13.9-13.12 कदम (विरोधी माउस 1: 4000 कमजोर पड़ने) और एक माध्यमिक एंटीबॉडी।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल सुरक्षित और कुशल siRNA अभिकर्मक के लिए एक गैर-वायरल वितरण प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है। SEM के परिणामों PCPs कणों आकार में बेलनाकार हैं और 2.6 माइक्रोन (2A चित्रा) की एक व्यास है कि पता चलता है। कणों सकारात्मक जिससे नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लियोटाइड के साथ बंधन इलेक्ट्रोस्टैटिक, सक्रिय करने के लिए लगभग 8.21 की एक जीटा संभावित (चित्रा 2 बी) के आरोप हैं। PCPs कणों की विभिन्न परतों के Confocal छवियों फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA झरझरा सिलिकॉन कण (चित्रा -2) के अंदर भरी हुई है कि प्रदर्शित करता है। साई कणों से Arg-पी / siRNA नैनोकणों के गठन और रिहाई डीएलएस और AFM से पुष्टि की गई। कणों के आकार वितरण 94 एनएम (चित्रा 2 डी) के एक औसत आकार के साथ, 70-120 एनएम से बताया गया। AFM छवियों नैनोकणों एक गोलाकार आकृति (चित्रा 2 ई) है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना।

रतिsiRNA के लिए कणों की ओ उच्च बंधन आत्मीयता (चित्रा 3A) सुनिश्चित करने के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अनुकूलित किया गया था। siRNA के अनुपात के कण की एक विस्तृत श्रृंखला (2 × 10 5 इस्तेमाल किया गया था, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 और 12 × 10 5 /0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA)। परिणाम कण राशि 8 × 10 5 से ऊपर है जब siRNA के कणों को कसकर बाध्य कर सकते हैं कि संकेत मिलता है। 10 × 10 5 PCPs / के अनुपात 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA के आगे के प्रयोगों के लिए चुना गया था। 3B चित्रा में सचित्र के रूप में, एसडीएस के साथ इलाज किया जब इसके अलावा, siRNA सफलतापूर्वक वाहक से जारी किया गया था।

अगला, PCPs / फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA के कणों के तहखाने internalization के एमडीए MB-231 कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया था। Confocal छवियों कणों को प्रभावी ढंग से कोशिकाओं में भली भाँति रहे हैं कि इलाज के शो के 24 घंटा (चित्रा 4 के बाद लिया चित्रा 5 कोशिकाओं का 89% ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद PCPs / siRNA के कणों भाँति है कि दर्शाता है। इसके अलावा, internalization प्रक्रिया 12 घंटा (1 वीडियो) के लिए दर्ज की गई थी। इन परिणामों के PCPs कणों कुशलता से कोशिकाओं में siRNA वितरित कर सकते हैं कि संकेत मिलता है। कोशिकाओं के अंदर siRNA के लिए लंबी अवधि के संचय भी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। 7 दिन और 10 दिन में siRNA अभी कोशिकाओं (चित्रा 6) के अंदर detectable था।

एक siRNA वितरण प्रणाली के विकास के वाहक 13 की सुरक्षा है जब सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक विचार करने के लिए। पी siRNA, endosome / लाइसोसोम से सेलुलर तेज करने में सहायता और ट्रिगर रिलीज के साथ पॉलीप्लेक्सेस फार्म करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, पी के कारण रीढ़ की हड्डी 14,15 में सकारात्मक आरोप लगाया प्राथमिक एमिनो समूहों की उपस्थिति के लिए, विषाक्त प्रभाव हो सकता है। उदाहरण के लिए, पी के लिए कर सकते हैं परिणाम कोशिका की सतह पर glycocalyx के लिए बाध्यबड़े समूहों में 16 की rmation। इस आरोप प्रेरित विषाक्तता को खत्म करने के लिए, पी covalently प्राथमिक एमिनो समूहों की संख्या को कम करने के लिए, एक पुल के संयोजक के माध्यम से arginine संयुग्मित किया गया था। कणों और siRNA अप / अच्छी तरह से और 100 एनएम, क्रमशः (चित्रा 7A) × 10 5 से 6 की एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया है जब सेल व्यवहार्यता 48 घंटा और 72 घंटे के बाद 95% से अधिक बनी रही। अगला, ओंकोजीन एटीएम के खिलाफ siRNA के अभिकर्मक प्रभावकारिता एमडीए MB-231 कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया था। पश्चिमी धब्बा परिणाम एटीएम के प्रोटीन का स्तर PCPs / एटीएम siRNA (चित्रा 7B) के साथ इलाज के बाद कम कर रहे हैं कि प्रदर्शित करता है। परिणाम PCPs मंच siRNA के लिए एक सुरक्षित और कुशल वितरण प्रणाली है सुझाव देते हैं।

चित्रा 1
Polycation-क्रियाशील झरझरा सिलिकॉन (PCPs) कणों के 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा। मजबूत> Arginine (ARG) -polyethylenimine (पी) / छोटे दखल शाही सेना (siRNA) नैनोकणों सिलिकॉन की गिरावट (सी) निम्न गठन कर रहे हैं।

चित्रा 2
PCPs कणों की चित्रा 2. विशेषता। PCPs कणों की (ए) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवि। (बी) PCPs कणों की जीटा संभावित। (सी) PCPs / फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA के कणों की विभिन्न परतों के Confocal छवियों। झरझरा सिलिकॉन microparticles से रिहा arginine Arg-पी / नियंत्रण siRNA नैनोकणों (डी) आकार के वितरण। Arg-पी / नियंत्रण siRNA नैनोकणों (ई) परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) छवियों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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PCPs / siRNA वितरण प्रणाली के अनुकूलन के लिए चित्रा 3. agarose जेल। (ए) PCPs कणों के बीच आत्मीयता बाइंडिंग और siRNA नियंत्रित करते हैं। बैंड अनबाउंड siRNA प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) siRNA रिहाई 1 घंटे के लिए 2% एसडीएस के साथ ऊष्मायन के बाद। बैंड (अनबाउंड और बाध्य) कुल siRNA प्रतिनिधित्व करते हैं। नमूना 1: siRNA; नमूना 2: 2 × 10 5 PCPs कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA; नमूना 3: 4 × 10 5 PCPs कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA; नमूना 4: 6 × 10 5 PCPs कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA; नमूना 5: 8 × 10 5 PCPs कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA; नमूना 6: 10 × 10 5 PCPs कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA; नमूना 7: 12 × 10 5 PCPs कणों / 0.2 माइक्रोग्राम प्रति siRNA।

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चित्रा एमडीए MB-231 कोशिकाओं में PCPs / फ्लोरोसेंट siRNA के कण (लाल) (24 घंटा ऊष्मायन) 4. confocal खुर्दबीन छवियों। नाभिक और filamentous actin के 4 के साथ कल्पना की गई थी, '6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, नीला क्रमशः) और phalloidin (हरा),। तीन अलग अलग परतों (शीर्ष, मध्य और बेसल) imaged थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा PCPs / नियंत्रण फ्लोरोसेंट siRNA के कणों के साथ ऊष्मायन के बाद फ्लोरोसेंट एमडीए MB-231 कोशिकाओं के cytometry विश्लेषण 5. मात्रात्मक प्रवाह। अनुपचारित कोशिकाओं एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। कोशिकाओं के 89% कणों भाँति था।

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चित्रा एमडीए MB-231 कोशिकाओं के अंदर फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA (लाल) 6. Confocal छवियों। प्रकोष्ठों PCPs / फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA के एक दिन के लिए कणों, 7 दिन और 10 दिन के साथ incubated रहे थे। कोशिकाओं तो confocal माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना कर रहे थे। नाभिक और filamentous actin के 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, नीला) और phalloidin (हरा) के साथ कल्पना की गई थी, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. सेल व्यवहार्यता और इन विट्रो में जीन मुंह बंद। (ए) PCPs कणों और PCPs / नियंत्रण siRNA के कणों (SCR) के साथ incubated कोशिकाओं के एक सेल व्यवहार्यता परख। प्रयोग की यात्रा में प्रदर्शन किया गया थाlicate और परिणाम मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। पीबीएस के साथ incubated अनुपचारित कोशिकाओं (रिक्त) और कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। (बी) (एटीएम) siRNA के कणों उत्परिवर्तित PCPs / गतिभंग telangiectasia के पश्चिमी धब्बा। प्रकोष्ठों PCPs / नियंत्रण siRNA (SCR) कणों और PCPs / एटीएम siRNA के कणों से अवगत कराया गया। अनुपचारित कोशिकाओं (नकली) एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। β-actin के एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

वीडियो एक लाइव एमडीए MB-231 कोशिकाओं में PCPs / फ्लोरोसेंट नियंत्रण siRNA के कणों की। समय पर निर्भर तेज। वीडियो कणों के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के बाद 12 घंटे के लिए दर्ज की गई थी।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की कोशिकाओं में siRNA के सफल प्रसव और अभिकर्मक के लिए एक विधि का वर्णन है। विशेष रूप से, siRNA के वितरण polycation-क्रियाशील साई कणों से मिलकर एक multifunctional मंच का उपयोग करके हासिल की है। siRNA चिकित्सा के उपयोग के विभिन्न ओंकोजीन उच्च विशिष्टता के साथ लक्षित किया जा सकता है के रूप में जैसे महान क्षमता, कैंसर के इलाज है। इसलिए, siRNA चिकित्सा की चुनौतियों को कम कर सकते हैं, जो siRNA वितरण वाहनों को विकसित करने के लिए एक मांग मौजूद है। अंत में, हम siRNA के सुरक्षित और कुशल प्रसव के लिए वादा दिखाता है कि एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया है। हालांकि, वर्णित तकनीक जब प्रदर्शन को ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कुछ प्रमुख कारक हैं। उदाहरण के लिए, PCPs कणों की तैयारी जब एक महत्वपूर्ण विचार न्युक्लिअसिज़ द्वारा गिरावट से बचने के क्रम में, ध्यान से siRNA संभाल करने के लिए है। जब साथ काम विशेष रूप से स्वच्छ, दस्ताने और RNase में मुक्त ट्यूब और पानी के लिए हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिएsiRNA। SiRNA अभिकर्मक प्रभावकारिता कम है, तो RNase संदूषण को हटा कि एक स्प्रे दस्ताने और कार्य क्षेत्र स्प्रे करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अभिकर्मक असफल है इसके अलावा, अगर, siRNA समस्या siRNA या कणों के कारण होता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए। PCPs / siRNA वितरण प्रणाली के सफल क्रियान्वयन के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण विचार centrifugation और वाशिंग चरणों का प्रदर्शन जब ख्याल रखना है। अर्थात्, सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह कण तैयारी कदम भर के लिए आवश्यक हैं कि अतिरिक्त अभिकर्मकों दूर करने के लिए त्याग किया जाना चाहिए।

PCPs / siRNA वितरण प्रणाली का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि सुरक्षा है। कई siRNA अभिकर्मक एजेंट सेलुलर विषाक्तता 13,15 के लिए योगदान देता है, जो एक उच्च cationic आरोप है। दरअसल, सबसे वाणिज्यिक प्रोटोकॉल अभिकर्मकों कोशिका मृत्यु से बचने के लिए, केवल कुछ घंटों के लिए कोशिकाओं के साथ incubated किया जाना चाहिए कि संकेत मिलता है। इसके विपरीत, CE परसेल व्यवहार्यता परिणामों से स्पष्ट है LLS, विषाक्तता के किसी भी लक्षण के बिना कई दिनों के लिए PCPs कणों से अवगत कराया जा सकता है। PCPs कणों के कारण पी की उपस्थिति के लिए उच्च आत्मीयता के साथ siRNA बाध्य कर सकते हैं। हालांकि पी के आरोप प्रेरित विषाक्तता वितरण मंच की अनूठी सेटअप करने से रोका जाता है। खास तौर पर पी को Arg के बंधन सहसंयोजक और सी के अंदर पी के encapsulation कम विषाक्तता के लिए योगदान pores। PCPs मंच का एक अन्य लाभ यह है कि siRNA अभिकर्मक सीरम की उपस्थिति में जगह नहीं ले सकता है। अन्य मौजूदा तरीकों आमतौर पर इस तरह अभिकर्मक प्रक्रिया के लिए अतिरिक्त कदम जोड़ने और संभावित रूप से नियमित रूप से सेल संकेत दे रास्ते के साथ हस्तक्षेप, सीरम मुक्त सेल संस्कृति मीडिया के उपयोग की आवश्यकता है।

PCPs प्रणाली का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि siRNA के अणुओं के किसी भी संशोधन की आवश्यकता नहीं होती है। कुछ मौजूदा तरीकों जटिल विकार चरणों siRNA को स्थिर करने के लिए या सी को सक्षम करने की आवश्यकता होती हैellular internalization के 13, PCPs प्रणाली siRNA लोड करने के लिए सरल मिश्रण पर निर्भर करता है। पी के लिए बाध्य और सी सामग्री में pores जिससे न्युक्लिअसिज़ के साथ संपर्क को कम करने, siRNA के लिए एक सुरक्षात्मक वातावरण प्रदान करते हैं। PCPs कणों सूखे सामग्री के रूप में या isopropyl शराब में समय की लंबी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है। PCPs / siRNA के कणों lyophilized कर रहे हैं इसके अलावा, अगर वे 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम तीन महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है। lyophilized PCPs कणों सिर्फ अभिकर्मक से पहले RNase मुक्त पानी में निलंबित कर दिया जाना चाहिए, और समाधान में संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए। पहले से फलस्वरूप जीन दबा रहने के जो लक्ष्य में समय की अवधि में वृद्धि, 11 के रूप में रिपोर्ट अंत में, PCPs मंच परमिट, siRNA के रिलीज निरंतर। तदनुसार, सेलुलर internalization के बाद, सी कणों धीरे-धीरे Arg-पी / siRNA नैनोकणों के गठन में जिसके परिणामस्वरूप, नीचा। इसके बाद, siRNA धीरे-धीरे यह Messe करने के लिए बाध्य कर सकते हैं जहां कोशिका द्रव्य में जारी किया गया हैnger शाही सेना (mRNA), जिससे जैविक गतिविधि exerting। PCPs कणों siRNA वितरण के लिए मौजूदा तरीकों की तुलना में कई लाभ प्रदान करते हैं, हालांकि, तकनीक की एक सीमा गैर-क्रियाशील साई microparticles के एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में आवश्यक हैं। कणों photolithography और विद्युत रासायनिक नक़्क़ाशी 17 का उपयोग कर संश्लेषित किया जा सकता है, इन तकनीकों के सभी संस्थानों में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich 408727 Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006 Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH Sigma-Aldrich 408-468 99%
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 30 wt. % in H2O
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741 100.00%
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 ≥99.7%
Ethanol Sigma-Aldrich 459844 ≥99.5% 
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 03449 ≥99%
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A7030-10G Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA  Sigma-Aldrich Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T9650 For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 For Western blot
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 For making phosphate buffer 
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640 For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG Sigma-Aldrich A4416 Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672 98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid Greiner Bio-One 655182 96-well plate
10x Tris-Glycine Liquid Li-Cor  928-40010 Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS  Santa Cruz Sc-281692 Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G5421 Proliferation assay
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP399-500 10x Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) Fisher Scientific  MT-15-017-CM Cell culture media, 1x solution
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass Fisher Scientific 12-530C 
Methanol Fisher Scientific  A412-1 For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes Fisher Scientific  14-377-010  For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant Fisher Scientific 14-754-34 Spray for removing RNAse contamination
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI  Invitrogen P36935 Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 Visualization of RNA
Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555 Qiagen 1027294 Fluorescent control siRNA
Cell scraper Celltreat 229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates Thermo Scientific 130184 6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) Thermo Scientific 84788 Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) Thermo Scientific 78430 Protease inhibitor cocktail, use at 1x
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific  78501 Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R Thermo Scientific 75002440 Centrifuge
Beta Actin Antibody  Thermo Scientific  MA1-91399 β-actin primary antibody (from mouse) for western blot
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Scientific R1161 DNA loading dye
Nuclease-Free Water  Life Technologies AM9938
Non-Fat Dry Milk Lab Scientific M0841 For Western blot
2-well BD Falcon culture slides  BD Biosciences 354102 2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Western blot detection reagent
BA Membranes GE Healthcare Life Sciences 10402096 Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb Cell Signaling 2873S ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling  7074 Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot 
Folded capillary cells Malvern  DTS 1061 For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line ATCC HTB-26 Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-rad 456-1043  For Western blot
Biorad PowerPac HC Bio-rad 164-5052 Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-rad 161-0732 Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 170-4405 Electrophoresis equipment for DNA agarose gel 
Mini-PROTEAN Tetra cell Bio-rad 165-8000 Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software Bio-rad 170-8265 Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer Ted Pella  16007 Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R Eppendorf 22670107 Shaker 
Isoton II diluent Beckman Coulter 8546719 Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076 Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles  Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS Malvern Particle analyzer system for size and zeta potential 
Scanning Electron Microscope FEI Particle size and shape 
Atomic Force Microscope Bruker Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope Olympus Visualization of fixed and live cells

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References

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