脊髄圧縮傷害の校正済み鉗子モデル

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McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martínez-Cerdeño, V. Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury. J. Vis. Exp. (98), e52318, doi:10.3791/52318 (2015).

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Abstract

マウス脊髄の圧迫損傷、脊髄損傷(SCI)および脊髄再生治療の研究のための貴重な動物モデルである。圧迫損傷の較正された鉗子モデルはSCIのための便利な、低コストで、かつ非常に再現性のある動物モデルである。我々はPlemel によって発表された方法に従って改変一対の鉗子を使用する。(2008)横方向に0.35ミリメートルの距離に脊髄を圧迫する。この動画では、変更された鉗子を用いて、脊髄の圧迫が続く、脊髄を露出させるために、背側椎弓切除術を実証する。ビデオでは、我々はまた、対麻痺実験動物の世話に関連する問題に対処します。この損傷モデルは、感覚の障害、ならびに損なわ後肢運動機能を発揮するマウスを生成する。免疫組織化学的方法によって決定されるようにまた、傷害のこの方法は、SCIの病態に一致する収差を生じる。このVIDを見た後EO、視聴者はSCIの研究および/または損傷後の機能障害を軽減するように設計された治療のために、マウスのさまざまな重大度のSCIを製造するために必要な物資や方法を決定することができるはずです。

Introduction

SCIの動物モデルは、脊髄への外傷の結果としての損傷を軽減するように設計された治療パラダイムの有効性を評価するための貴重なツールである。実験的な必要性から、これらのモデルは、異なる重要度の傷害を生成するために調整可能で、歩行運動における再現性の赤字と感覚行動を提供し、傷害の重症度が観察神経学的欠損の程度と相関することを証明しなければならない。離断、挫傷、および圧縮1:傷害の明確な特徴を持つSCIの3つの主要な種類があります。簡単に述べると、離断損傷が脊髄に裂傷で、挫傷は、背側脊髄に適用短い焦点力に起因して、圧迫損傷は有害な力が脊髄に適用した場合に発生し、またすることができる挫滅損傷2と呼ばれる。

完全離断損傷は挫傷ANながら、人間の3において臨床的にまれであるD圧縮傷害はより一般的である。圧迫損傷は、ヒトSCIに見出されるものと同様の結果を生成することによって、例えば、腫瘍の圧縮または他の有害な圧縮力を引き起こし、およびツールの単純な配列を使用して行うことができる。挫傷圧縮損傷は両方とも圧縮力であり、両方は、細胞構築組織崩壊と同様の病理学的特徴を有することと同様であり、傷害1,4と同様の内因性応答を呼び起こす。挫傷損傷モデルは、通常、脊柱2,5,6-の衝突に起因するSCIの人間の場合と同様に、特殊な装置を用いて、背側脊髄にこの力を加える。対照的に、圧縮損傷は背側または横方向に力を加えて、種々の方法によって生成することができる。圧迫損傷の方法は、キャリブレーション鉗子7、動脈瘤クリップ2、または脊髄8上に直接重みを置くことが含まれる。の利点動脈瘤クリップは、それらが力9の異なる量を提供することができるということである。脊髄の背側表面に重みを付加する方法は直接8大幅に手術の長さを増加し、呼吸に起因する体重移動の配置に起因する不整合が生じた、10分間の代わりになるように重みを必要とする動物。によるマウスのサイズが小さいので、そのような挫傷用インパクタとしてラットでの使用のために設計された特殊な装置は、動物を位置づけることは困難であってもよいし、一貫性のない負傷7になる。しかし、マウスは、SCIの研究のために非常に有用である、ラットやウサギなどの大型動物とは異なり、トランスジェニック株の広い範囲でご利用いただけます。

脊髄を圧迫するように較正鉗子を使用Plemel方法は、傷害の重症度、および神経学的欠損7との間の相関度の高い再現性SCIを生成する。この外科SCIモデルです第5デュモンの鉗子を使用して生成する金属エポキシまたは完全な閉鎖を防止するために、いくつかの他の障害物のいずれかで定義された距離で離れて保持されるように修正。この設計間隔は確実には常に複数の手術中に一定の幅に近く、異なるユーザによって鉗子。 Plemel方法の利点は、較正された鉗子を製造するための材料を容易に特殊な装置を必要とせずに購入し、実験室で組み立てることができることである。これらの鉗子は、オートクレーブ滅菌の複数のラウンドを耐えることができ、かつ独立した、かさばる装置の欠如は、手術を効率化します。

このビデオでは、圧迫損傷を生成するために、マウスの脊髄でのキャリブレーションピンセットの外科的使用を示す。また、手術後の生活の質を改善し、死亡率を減少させるために、脊髄負傷した実験動物のケアに関連する固有の問題に対処する。

Protocol

全ての動物手順や動物のケアの方法には、金融機関の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されるべきである。

1.外科の準備

  1. 鉗子、ヴァナはさみ、roungeurs、リトラクター、メス、ハサミ、縫合糸、皮膚ステープル、Q-ヒント、滅菌生理食塩水、外科スポンジ、およびイソフルラン:すべての必要な手術器具および試薬を組み立てます。手術前に手術器具の完全なパックを準備し、オートクレーブ。複数のマウスの手術を実施する場合は、準備し、オートクレーブ動物あたりのツールのいずれかのパケットを、または手術器具の1パケットをオートクレーブ手術の間でツール·滅菌器で滅菌する。ガラスビーズツールterilizerがで中間手術ツールを洗浄するために使用される場合、一般に、滅菌ツールの一つのパック(5匹の動物の後にツールが使用前に再洗浄し、滅菌しなければならない)までの5匹のマウスを使用することができる。 institutiについては、最寄りの動物実験委員会の管理者に確認してください具体的なガイドラインに。
  2. 70%のイソプロピルアルコールワイプで手術野を滅菌する。無菌のフィールドが手術中に維持されていることを確認するために手術用ドレープを設定します。
  3. 手術前に各マウスを計量。皮下、ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重の用量を投与する。
  4. イソフルラン機械の誘導チャンバ内に4%の用量でイソフルランを投与することによって動物を麻酔する。
  5. 動物を麻酔したら、脱水を防ぐため37℃の加熱パッド上で動物を設定し、マウスの頭部が適切に麻酔コーン内に位置されることを保証するために、目に軟膏を適用する。 (注:熱傷を起こさない加熱源を使用します。 すなわち 、循環水の毛布、湯たんぽ、または同等。。)この時点では、動物に2%のイソフルランの用量を投与。
  6. 意図された切開の位置の周りの約1cm、マウスの背側表面を削る。
  7. 切開Sを駆除ヨウ素溶液(10%ポビドンヨード、1%の有効ヨウ素)、次いで、70%イソプロピルアルコールワイプで洗浄することによって、映像情報メディア学会。 3回繰り返します。

2.背側椎弓切除

  1. 切開を行う前に、動物が適切につま先やテールピンチ方式を使用して、反射神経をチェックして麻酔されていることを確認する。
  2. メスの刃で背側脊柱に沿って切開を行い、再度反射神経をチェックする。アーチ適切にそのような椎骨の間の境界などのランドマークを、視覚化するために戻って。
  3. 皮膚を通ってカット。バック脊髄から皮膚と筋膜を保持するために開創器を挿入します。背骨をカバーするの筋肉を露出させ、脊髄の両側に組織をクリアします。
    注:外科医は、解剖学的に精通している必要があり。例えば、肩甲骨の下角は、T7に対応する。マウスの脊椎の自然な曲線の上部はT12であり、基準点として使用することができる。
  4. Pでローパー照明、椎骨の間のスペースを決定する。 T10の後端を検索し、椎間板スペースに垂直に筋肉や筋膜をカット。 T10の棘突起と後部ラミナを露出するためにちょうど十分なカット。
  5. 細かい傾いてデュモン#5ピンセットを使用して、脊髄の小さなスライバーを露出させラミナと棘突起から組織の一部を削除。必要な場合には、脊柱を安定させるために、組織の鉗子を使用しています。
  6. 椎骨の背側に沿って、ちょうどラミナの下に小さなヴァナはさみのペアの一方の側を挿入して椎弓切除術を行います。
    1. 小さな、慎重な切れ端は、椎弓板の側面を切断することを確認します。全く圧力が脊髄に適用されていないことを確認してください。
    2. 反対側に繰り返します。
    3. 脊髄に圧力をかけないように注意しながら、Qティップまたは外科スポンジで、必要に応じて出血を止めるための穏やかな圧力を適用します。
      注:ゲルフォームを準備出血ニーズを制御することをイベントに滅菌生理食塩水に浸した。
    4. 切開が行われた後は、椎骨の背側面を持ち上げ、ゆっくりと任意の組織の添付ファイルを消去する。必要に応じて、出血を制御するための適切な手段を使用してください。

3.脊髄圧迫

  1. roungeursまたは椎弓切除鉗子を使用して、圧迫損傷のためのキャリブレーション鉗子は、脊髄のいずれかの側に置くことができるように、脊髄の側面は、椎骨の自由であることを確認してください。鉗子のアームは、脊柱管の床に到達できる必要があり、隣接する脊髄の側面と鉗子の先端に硬膜外腔内に配置することができなければなりません。
    1. 脊髄の視認性が良好であることを確認してください。
  2. 脊髄の露出セグメントの途中で5鉗子約校正さデュモン#を位置づける。思い出してその力の武器psは、隣接する両側に硬膜外腔内に配置する必要があり、ヒントが再現可能な怪我を生成するために、脊柱管の床に触れなければなりません。
  3. スペーサーは接続するまで慎重に脊髄を圧迫する。 15秒間の場所に保持する。
  4. 静かに圧縮力を解放し、脊髄から校正された鉗子を削除します。創傷が閉じられる前に、滅菌生理食塩水が恒常性を回復するために使用されるべきである。

4.傷クロージング

  1. 慎重に崩壊させるまたは脊髄に圧力を加えないように注意しながら、脊髄上筋層を縫合。
  2. 創傷の上の皮膚を閉じるには、縫合糸またはステープルのどちらかを使用してください。
  3. ガス麻酔薬を使用する場合は、/テーパー麻酔薬をオフにし始める。
  4. 手術中および動物が無気力と負傷から回復している手術後の脱水のためのアカウントを助けるために10グラムの体重あたりの乳酸リンゲルの0.1ミリリットルを管理します。ソリューションは、ヴェルメであるべき注射前に体温dは。
  5. 寝具のないケージにマウスを置きます。他の半分は、与えるために、RTカウンタ上に載っている間ケージは、ケージ面積の半分は、パッド上にあることを可能にする様式で(1.1.5に記載のように)加熱パッドの上にくるようにしてくださいマウスの気候のオプションには、歩行したら。 「リカバリケージ」が静かな環境に置かれていることを確実にするために注意してください。それはマウスが寝具との定期的なケージに転送することができ、その時点で意識を、取り戻したまでは密接に動物を監視します。

5.術後ケア

  1. 痛みの症状を管理するために必要に応じて、手術後、次いで、手術後最初の3日間、ブプレノルフィンの皮下12時間毎に0.05 mg / kg体重の用量を投与し、。
  2. 手術後5日 - 第3のための乳酸リンゲル液(10g体重の皮下に0.1 ml)での用量を投与する。この用量を与えるとき、AN / IFimalこの初期期間の外側で脱水の兆候を示すことから始まる。
  3. 手動で一日二回クレーデ操縦を使用して動物の膀胱を発現する。静かに膀胱を見つけるために、動物の腹部を触診し、その後膀胱が空になるまで穏やかな下向きの圧力をかける。
    1. 膀胱が空でないか、尿が流血や曇りの場合は、10日間腹腔内注射によって動物にバイトリルの体重によって50 mg / kgを管理します。
  4. オートファジー、脱水、および過度の体重減少(体重の20%を超える)の兆候について動物をモニターする。動物がこれらの症状のいずれかが発生した場合の治療オプションに関しては、すぐに獣医師に相談し、またはIACUCガイドラインに従って人道的な方法で、動物を安楽死させるください。
    1. 移動度が右手術後に制限されることがあることを考えると、必ず動物は食物および水へのアクセスを持つために必要な措置をとる。同様に、ウェットフードパッケージ済みのヒドロゲルは、これらの例において、動物に利用可能にすることができる。

6.圧縮傷害から生じる組織損傷を評価する

  1. ステップ1.41.5で説明したように動物を麻酔。つま先のピンチと監視角膜まばたき反射によって麻酔の深さを確認してください。動物が刺激に鈍感である場合には、6.2に進みます。
  2. 心臓内灌流10を実行します。
    1. 胸腔を露出し、左心室に針を挿入します。氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)の15〜25ミリリットル続く30mlの氷冷リン酸緩衝食塩水(PBS) - 20と既存の流体を流し出す。
  3. 脊髄を削除します。
    1. 脊髄に対する皮膚背側をカットし、脊柱の長さを周囲の余分な組織を離れてオフにします。
    2. 物品税脊柱、残りの組織を切り取る。椎弓切除と私の実際のレベルnjuryリブをカウントすることによって確認することができる。
    3. 尾·ツー·頭側方向に脊柱の小さなセクションを置換するヴァンナはさみとピンセットを使用してください。コー​​ドは安全な除去を可能にするのに十分に露出されるまでカットし続けます。切断位置及びプロセスの可視化は、ステレオスコープを使用することによって容易にすることができる。
  4. 4%PFAで脊髄組織を置きます。組織は4℃で24時間、この溶液に、修正を掲示することを可能に。
  5. 4℃で24時間、30%スクロース中でインキュベートすることによりCryoprotect組織。
  6. OCTで組織を埋め込む。簡単に言えば、30%のショ糖インキュベーションから組織を取り、余分な溶液を除去する。 10月で満たされたクリオモールドに組織を配置し、4℃で1時間インキュベートする。
    1. 4℃から金型を削除し、組織の方向方向を確認(ドライアイス上で1時間予備冷却)2-メチルブタンの浅い皿に金型を入れて、10月には完全に固化することができます。すぐにまたはSTOを使用している場合はドライアイス上で保管してください-80℃で再。
  7. クライオスタットを用いて、20μmの矢状切片に組織を切断。スライド上に直接組織をマウントします。使用するまで-20℃で保管してください。
  8. ヘマトキシリン​​およびエオシン(H&E)染色を行います。
    1. 簡単に述べると、組織(5分間、2回)、ヘマトキシリン​​(2.5分)で汚れを再水和、および水(1分、2回)で洗浄した。
    2. 50%で組織をインキュベートした後、70%エタノール(3分間ずつ)、エオシン(45秒)と染色、および90%(5秒)、95%(5秒)でのインキュベーションによって脱水、100%エタノール(2分間) 、イソプロパノール(2分)。
    3. キシレン(5分、3回)でクリア。
      注:H&E染色は、特定の組織の厚さおよび状態に応じて変化する。そのため、標準化は実験的な組織サンプルを進める前に必要とされている。
  9. パーマウントの薄いストリップ(〜100ミクロン)で組織し、カバースリップをカバーしています。流体の適切な分布を確実にするためにカバースリップのすべての側面を押し下げます。スライドは、O / Nを乾燥させます。
  10. ビスデジタル顕微鏡を用いて組織切片をualize付属するソフトウェアを用いて画像を取り込む。

Representative Results

0.25ミリメートル(n = 4)は、0.35ミリメートル(n = 4)を0.55 mmに、脊髄圧迫が続く上記のように - (30グラム25)、(n = 4)の我々は、12匹のマウスに椎弓切除術を行った。私たちは3で、動物を犠牲にした(n = 6)と7(n = 6)の心臓内灌流により日後に負傷。脊髄は、脊柱から除去し、組織を調製し、上記のように処理した。全体脊髄の画像は、ライカEZ4デジタル顕微鏡と付属のソフトウェアで撮影した。脊髄切片の画像はオリンパスデジタル顕微鏡付属するソフトウェアを使用して、2倍の倍率で撮影した。

我々は、脊髄圧迫、圧縮( 図1)の部位で震源と損傷を生じることを見出した。けがの影響は吻側および尾側方向に数ミリメートルを拡張します。スペーサ間の距離が減少したとして傷害の重症度が増加した(0.25ミリメートル> 0.35ミリメートル>0.55ミリメートル、 図2)。三日圧縮後の傷害の震源地で血と損傷後7日を提示していなかった周囲の領域があった。 0.25ミリメートル0.35mmの圧縮は、空洞ではなく、0.55ミリメートルモデルを生成した。 7日後、背側と腹側白質は、主に灰白質組織は非常に歪んでいた、震源地で、サイズが減少し、キャビテーションは永続的でした。これらのcytoarchitectonical変化は、モーターに換算されていると我々は以前の出版物8で示したように、動物の行動の感覚の変化は、運動機能や感覚機能のためのフォン·フレイ毛およびエチル塩化試験のためにそのようなバッソマウスのスケールとして適切なテストを用いて評価。

図1
無傷の脊髄の図1.代表的な画像の前とAFの両方TER損傷。 (A)は無傷の脊髄。(B)0.35ミリメートル圧縮後の脊髄。矢印は傷害の境界線を示している。アスタリスクは、傷害の震源地をindentifies。 D =背、L =横。スケールバー:0.50ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
様々な圧縮幅で圧迫損傷前と後の図マウスの脊髄の2.代表的な画像を。 (A)コントロール脊髄の矢状断面。(B)0.35ミリメートルSCI 7日後の圧縮損傷(DPI)の震源地での冠状断面。(C、E、G)3 DPI 0.25の幅に脊髄の矢状切片H&E染色された脊髄の、0.35または0.55ミリメートル(D、F、H)矢状切片S 7 0.25、0.35または0.55ミリメートルの幅にDPI。アスタリスクは、傷害の震源地をindentifies。すべてのセクションでは、H&Eで染色した。 D =背、L =横。スケールバー:1.25ミリメートル、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

SCIモデルの選択は、SCIのヒト症例の治療の有効性を決定するための実験を​​設計する上で重要である。このような実験は、決定的でないデータを生じ得る変動を制限することが非常に再現性のある動物モデルを必要とする。彼らはまた、正確に、彼らはモデリングしている人間の状態を評価するために臨床的妥当性のものであるべきである。そのために、離断の上に圧縮または挫傷の傷害を選択することがより臨床的に3関連している。しかし、挫傷用衝撃子および重量落下装置は、高価で複雑な機械装置の使用を必要とする。対照的に、SCIの較正された鉗子モデルは、一般的な実験材料から組み立てることが容易である鉗子を改変利用し、手術、脊髄を露出させるために、標準的な背側椎弓切除後の唯一の追加の工程を必要とする。しかし、この方法を使用することの1つの欠点は、圧縮力がいつものように、横方向ではなく背側より適用されることである最も頻繁にSCI 9のヒト臨床症例に見られる、および方法を使用して生成された圧縮損傷は、挫傷モデル1,2よりも、組織のより吻側-尾側の程度に影響を及ぼしている。このモデルは、技術のオリジネーターによって実証されている、と私たちは、再現性のSCI 7,11生成するために、マウスの大きさに適しています。動物はそのような歩行のためにバッソマウスのスケールとして行動試験、多数のとフォン·フレイ毛試験を用いて手術と治療処置後に評価されるためにさらに、この損傷モデル動物のコホートは、同じ傷害の重症度を共有することを確認するために、可能にと神経学的欠損7,11-13。これらの同じ技術はまた、SCI 2,7ための治療法を評価するために使用される動物モデルのための一般的な基準を満たす、調査研究の間、動物に投与する治療の有効性を評価するために用いることができる。

較正された鉗子を製造する方法損傷モデル用のは簡単で、様々な異なる方法を用いて達成することができる。我々はPlemel 7によって発行され、スペーサー方法11を使用して、また、圧縮装置を作成するために容易にする方法を提供するだけでなく、小ねじを使用して、鉗子を変更しただけでなく、の、最終的な圧縮の幅を調整することで汎用性を可能にする比較研究のために利益を得る。鉗子を作成する際の選択の幅があれば、スペーサー(単数または複数)は、常に同じ距離に鉗子を閉じて、オートクレーブ滅菌に耐えることができるの安定した手段を提供するように、ほぼ無制限である。このビデオ内記載の外科的方法は、しかし、それは、椎弓切除術を行い、脊髄を増加させることができる追加の圧縮力を受けないように手順を行った後、動物を縫合する際には注意することが必要で、ユーザー間で高度に再現可能である傷害の重症度と将来の実験を混乱。 適切な訓練と実践では、圧迫損傷の校正された鉗子モデルは、人間2,3,7で観察された臨床例を模倣したマウスでSCIを実施するために適しています。怪我の重症度の異なる程度のマウスを、鉗子を作成する生産の容易さを容易に行うことができます。これは、トランスジェニックマウスにおいて重症度が異なるだけでなく、マウスにおいて、幹細胞移植の有効性を評価するSCIにおける遺伝的影響を観察するための非常に有益であろう。文学の研究の大部分が原因一般的に実行するために手術が容易になり、その大きさにラットで行われてきた。しかしこのビデオでPlemel 7から発行され、我々が記載された方法は偉大な使いやすさと再現性を持つマウスで実行されるように、SCIを有効にする必要があります。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane machine Smiths Medical PM, Inc VCT302
Isoflurane Phoenix Pharmaceutical NDC: 66794-013-25
Dissecting Scope Seiler Precision Microscopes SSI 202/402
Germinator-500 (tool sterilizer) Thomas Scientific 3885A20
Puralube (eye ointment) Dechra NDC 17033-211-38
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#11) Fisher Scientific  08-914B
Retractor (Colibri) Fine Science Tools 17000-03
Friedman Pearson roungeur Fine Science Tools 16021-14
Vanna (Castroviejo) scissors Roboz RS-5658
Tissue forceps Fine Science Tools 11029-14
Laminectomy forceps (Dumont #2) Fine Science Tools 11223-20
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20
Stapler Fine Science Tools 12031-07
Staples (wound clips) Reflex7 203-1000
Sutures Henry Schein 101-2636
Needles (30 G x ½) BD Biomedical 305106
Syringe (1 ml) BD Biomedical 309659
Baytril (enrofloxacin) Bayer NADA 140-913
Buprenex (buprenorphine) Cardinal Health NDC 12496-0757-1

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References

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