レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

Neuroscience
 

Summary

個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kummari, E., Guo-Ross, S. X., Eells, J. B. Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (96), e52336, doi:10.3791/52336 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)は、顕微鏡スライド上の個々の細胞又は組織切片の組織の正確な解剖学的領域の濃縮集団を単離するために使用される。免疫組織化学と組み合わせた場合、LCMは、特定のタンパク質マーカーに基づく個々の細胞型を単離することができる。ここで、LCM技法は、直接、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学で及びLCMのために使用されるものに隣接する部分に間接的なチロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学を使用して、腹側被蓋領域の領域を含むドーパミンニューロンの単離のために標識されたドーパミンニューロンの特定の集団を収集するために記載されている。赤外線(IR)レーザーをキャプチャの両方に使用される個々のニューロン、ならびにガラススライドオフおよび分析のためのLCMキャップ上に腹側被蓋領域を解剖する。 100%エタノール及びキシレンと組織の完全な脱水が重要である。 IR捕捉レーザー、紫外線(UV)cuttiの組み合わせngのレーザはPEN膜、スライドを使用した場合、個々のドーパミンニューロン又は腹側被蓋領域を分離するために使用される。 PEN膜、スライドは、より速い組織の大部分を収集して細胞を捕捉し、収集する際に優れた一貫性を提供するように、スライドガラス上で重要な利点を有するスライドからの組織の完全な除去で脱水し、結果にあまり依存している。ガラススライドからの組織の大部分の除去が可能であるが、それはかなり時間がかかり、しばしば背後にあるいくつかの残存組織を残す。ここに示したデータは、十分な量および質のRNAを定量PCR測定のためのこれらの手順を使用して得ることができることを示している。 RNAとDNAがマイクロRNAのLCM、分離および測定を採取した組織や細胞からの最も一般的に単離された分子であるが、DNA中のタンパク質およびエピジェネティックな変化はまた、強化された解剖学的および細胞の解決方法を利用することができますLCMを使用して得られた。

Introduction

すべての組織は、細胞のヘテロ接合個体群で構成されています。これはグリア細胞(オリゴデンドロサイト、ミクログリアとアストロサイト)の様々なタイプに囲まれ、様々な形態学的および/または神経化学的に異なる神経細胞からなる、脳組織のために特に関連する。さらに、このような皮質または脳幹の核の領域のような脳内の別個の領域は、特定の機能を有する。したがって、分析技術と組み合わせた場合、細胞の特定の集団または微小解剖学的に別個の領域を分離する能力( すなわち 、Q-PCR、マイクロアレイ、RNA配列決定、およびプロテオミクス)は、著しく多様な生物学的プロセスの理解を高めることができる。 LCMは、RNA、マイクロRNA、DNAおよびタンパク質などの様々な分子のさらなる分析のために、はるかに均一な供給源を提供する顕微鏡スライド上の組織から非常に離散的な解剖学的領域または特定の細胞を分離する能力を提供する技術である。

トン"> LCMが最初に導入されて以来、いくつかの異なるアプローチが組織1-3から細胞を顕微解剖するために使用されている。最古のアプローチは、赤外線(IR)レーザー及び熱可塑性フィルムと非を使用して、スライド上の組織の直接結合が含まれ接触方法チューブに細胞または組織とコレクションを切り離すためにレーザーを切断紫外線(UV)を用い、その後、LCMが正常組織および細胞型の様々な使用および下流の分析のための種々の分子の単離と互換性があることが示されているRNA、マイクロRNA、DNA、酵素活性1,4-7を含むタンパク質を含む。ここで、LCM切削UVレーザーを使用してLCMシステムおよび細胞または組織の周りに切断し、それを取り付けるためのキャプチャIRレーザーを用いて実証されているLCMキャップは、それぞれ、このLCMシステムは、プラスチックフィルムに細胞を付着し、tからそれを除去する目的の細胞または組織の上にキャップにプラスチックフィルムを溶融するIR捕捉レーザーの両方を使用してキャップを除去しながら、彼は組織( 図1)。さらに、IRレーザーと組み合わせて、UVレーザーカットアウトするその後IRレーザー( 図2)を使用してLCMキャップに組織を取り付けることによって単離した膜を有するスライド上に載せた組織から目的の組織または細胞を利用可能である。これらの技術の概要は、 図1および図2に見られる。

この手法にはいくつかのバリエーションを直接蛍光免疫組織化学および特異的タンパク質の発現に基づいて組織の領域を単離するために使用される間接的な免疫組織化学誘導技術を使用して特定の細胞を単離するためのいずれかに記載されている。具体的には、黒質および腹側被蓋領域および新鮮凍結脳組織からのRNAのその後の単離物の単離からドーパミン神経細胞の単離を示す。 RNAは、測定された分子の最も不安定であるため、目(DNAまたはタンパク質と比較して)RNAの完全性を維持するのに役立つ、EPSは含まれており、データが得られたRNAの量と質に表示されます。

Protocol

注:マウスの​​脳組織は実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って使用して、研究プロトコルはミシシッピ州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。

スライドと組織の作製

  1. シランプレップスライドまたはポリエチレンナフタレート(PEN)膜ガラススライドのいずれかを使用してください。
  2. RNA単離のために、RNアーゼ除染液中のディップスライドを、RNアーゼを含まない水で3回洗浄し、30分間、RNaseフリーエタノールおよび真空乾燥の段階的な一連の脱水する。
  3. クライオスタットを用いて、10μmの厚さで組織切片をカットし、準備されたRNaseを含まないスライドにマウントします。 RNAの質を維持するために、切片中に凍結切片にしてください。
    注:組織は、約4ミリメートル離れてスライドの端に近すぎる組織を除去することはできませんLCMとしてスライドの端からであることを確認してください。オードでrは、PEN膜スライドから組織を除去する組織は、左、頂部及び底部から4mmでスライドに取り付けられていない膜の寸法は、スライドの右側から7mmであることを確実にする。
  4. シランプレップスライドまたはPEN膜、スライドのいずれかの上に直接、免疫組織化学、セクション組織を使用して、個々の細胞集団を単離するため。間接的な免疫組織化学技術を用いて導かれた組織領域の単離のために、LCMのために使用されるPEN膜、スライドおよび/またはシランプレップスライドのいずれかで免疫組織化学および代替セクションのシランプレップスライド上の切片の一組のマウント。

レーザーキャプチャー2.組織標本 - 免疫反応性細胞の直接レーザーキャプチャーの迅速チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学

  1. 疎水性のペンで組織をアウトラインと乾燥させます。
  2. アセトン - メタノールで組織を修正しました。(1:1)10分間、-20℃での溶液。
    注:王rは経験はアセトン - メタノール固定単独アセトンまたはメタノールよりもはるかに一貫性の免疫組織化学をもたらしたことを示している。
  3. リン酸リンススライドを、1%トリトン(RNaseを含まない)で緩衝食塩水(PBS)。
  4. 400 U / mlののRNasinで100:チロシンヒドロキシラーゼ抗体と1%のトリトンと100〜200μlのPBSでカバーセクション1に希釈。 5〜10分間インキュベートする。
  5. 二回PBSで簡単にすすぎ、PBS-1%トリトン。
  6. 100 PBS-1%トリトン400 U / mlでのRNasinおよび50ng / mlのDAPI:1希釈したアレクサフルオロ488で標識したヤギ抗ウサギIgGを100〜200μlの組織をカバーする。 5分間インキュベートする。
  7. その後RNaseを含まないエタノールの段階的な一連の(75%-75%-95%-95%-100%-100%)に30秒を脱水PBS中で2回洗浄します。
  8. その後1分5分間キシレンの2回の洗浄でインキュベートする。
  9. LCMのために使用する前にすぐにキシレンからスライドを取り出し、空気乾燥させ。

レーザーキャプチャー3.組織標本 - チロシン免疫反応領域の間接レーザーキャプチャー用の水酸化酵素免疫組織化学

  1. セクションに隣接するセクションとのプロセスつのスライドは、シランプレップおよび/または免疫組織化学のためのPEN膜スライド上にマウント。
    注:ここで使用される手順は、以前に報告された5と同様である。デモ画像では、ジアミノベンジジン(DAB)色素原反応は、関心のあるチロシンヒドロキシラーゼニューロンを可視化した。
  2. LCMのために使用されるスライドのために、4℃での100%アセトン中で5分間固定する。
  3. 1分ごとに、RNアーゼフリーのエタノール(75%-75%-95%-95%-100%-100%)の段階的なシリーズの組織を脱水。
  4. その後1分5分間キシレンの2回の洗浄でインキュベートする。
  5. LCMのために使用する前にすぐにキシレンからスライドを取り出し、空気乾燥させ。

4.レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムの使用

注:LCMアプリケーションプログラムが制御する10のツールバーと2窓が顕微解剖手続き。ツールバー:1.顕微鏡、2。キャプチャレーザー、3カッティングレーザー、4。研究、5。ナビゲーション、6。マテリアル、7。キャプチャグループ、8顕微解剖、9。フォント、10注釈。 Windowsの場合:1.ライブビデオと2ロードマップ。

  1. LCMシステムソフトウェアにおける材料·ツール·バーの「Openドア」タブを選択することで、ドアを開きます。
  2. 負荷が利用可能な3つのスロットにスライドします。このデモでは、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学と負荷つのスライドは、DAB、1シランプレップスライドと1 PEN膜スライド急速な蛍光チロシ​​ン水酸化酵素免疫組織化学のために標識された各で可視化した。典型的な実験では、直接レーザー捕捉のための蛍光チロシ​​ンヒドロキシラーゼで標識されたDABやスライドを使用してチロシンヒドロキシラーゼのための標識参照スライドで標識されていないアセトン固定切片のいずれかを使用する。
  3. 利用可能なスロットにLCMキャップをロードします。
    注:マクロとHS LCMキャップが使用できます。ドを使用するLCMキャップのタイプ収集される細胞または組織の量の数を保留します。マクロスライドをHSキャップは数百を収集することができますしながら、数千までのセルを収集するために記載されています。マクロスライドは、より多くの組織採取のために可能にするが、溶解緩衝液50μlを必要とする。アダプターで使用されるHSキャップは、RNAの大きな比例回復を可能にし、溶解緩衝液のみの10μlのを必要とします。
  4. ドアを閉じます。
  5. スライド全体の作業ビューを提供するロードマップウィンドウをアクティブにするスライドをロードして、これは関心領域( 図3)の選択を可能にする。関心のある領域に移動しライブビデオウィンドウにロードマップを表示します。
  6. マテリアル·ツール·バーでは、スライドスロット上のボックスをチェックすることにより、PEN膜スライドを特定する。キャップのプロパティを供給するために、右のマテリアルツールバーにキャップをクリックして、「キャップ供給のプロパティ」を選択します。キャップの位置を示すボックスをチェックして、馬のいずれかを選択CROまたはHSのキャップ。
  7. 蛍光灯をオンにし、蛍光灯は、ウォームアップすることを可能にするために顕微鏡のツールバーに「蛍光」タブを選択します。それぞれ、アレックスフルーア488およびDAPIを可視化するために、ブルーとUVフィルターを使用してください。蛍光標識した細胞を見るために、画像の感度を高めるために「カメラの調整」タブを使用します。
  8. マテリアル·ツール·バーでは、右キャップをクリックして、目的のスライドに移動します。ライブビデオウィンドウに表示される領域を選択するロードマップで場所をダブルクリックします。ロードマップ(左ダブルクリック)し、右クリックして選択上の領域を選択することで、スライド上の周りにキャップを移動する「中央領域で起こるキャップ。」
  9. IRキャプチャレーザーを使用する前に、目的と強さのためにそれを調整します。離れて組織からスライドの領域にキャップを置きます。キャプチャレーザーツールバーで、「有効にする」を選択し電源(3-100 mW)と、パルスを調整して(100から1000000μ;秒)とレーザーの#ヒット。キャップが組織することなく、スライドの一部の上にあるときにIRレーザーを発射し、レーザーは十分にLCMキャップ膜を融解するかどうかを確認してください。
    注:キャップ上に高分子膜を溶融され、この呼ばれる湿潤に接触するガラススライドするように。十分な湿潤が(十分と溶融不足の例については図4を参照してください)明確なリングの中心とスライドに融合したダークリングとして表示されます。濡れが十分でない場合、これが達成されるまで、再度電源とパルス、およびテスト火災を調整する。また、レーザの複数の火災を使用することもできる。
  10. IRレーザーの強度を調整すると、右クリックして、レーザーを目的とする「キャプチャレーザーがここにあり」を選択します。
    注:この手順がIRキャプチャレーザーが組織を目指しているコンピュータに指示します。レーザー照準のこのステップは重要であり、キャップを移動させるか、目的が変更されるたびに繰り返す必要がある。
  11. シランプレップスライドのオフ個々のドーパミンニューロンの5レーザーキャプチャーマイクロダイセクション

    1. 細胞を捕捉するために関心領域に移動する。
      注:隔離ドーパミンニューロンの例がここに示されています。
    2. シランプレップスライドのオフ個々の細胞を捕捉するために、マイクロダイセクションのツールバーにし、 "一点"アイコン "LCM」タブを選択します。
    3. 顕微鏡のツールバーでは、適切なフィルタを選択し、倍率を変更するには、目的のタブを使用するために、蛍光フィルターのタブで蛍光と明視野を切り替える「シャッター」タブを使用します。目的の細胞がライブビデオウィンドウに表示されたら、細胞のおおよそのサイズに目的の細胞をマークするために使用されるスポットサイズを調整します。その後反対側をクリックすることで、その後に染色された細胞の片側をクリックするキャプチャレーザー·ツール·バー上のスポット]タブをクリックすることでこれを行います。
      注:これは計算しスポット径と値を表示します。
    4. 「シングルポイント」アイコンが選択されている間、それらをクリックすることで目的の細胞をマークします。各セルにスポットマーカーを配置するためにこれを行います。ここで、青色フィルタおよび10Xの対物レンズは、ドーパミンニューロンを可視化するために使用される。ステップ4.9と4.10で説明したように、その下にない組織が存在しないキャップ上のIRレーザーを再テストし、目指しています。
    5. 自動的に選択されたすべてのマークされたセルを発射します顕微解剖ツールバーとIRレーザー上のタブ - セルがマークされたら、「カットとキャプチャを行く "を選択します。さらに、必要に応じて、興味( 図5D)の任意の時点で手動でIRレーザーを発射する。
    6. 細胞はLCMキャップ上に捕捉されたかどうかをチェックするために離れてセクションから、スライドのオープン領域上にキャップを移動します。目的の細胞がスライド( 図5B、E)から除去し、LCMキャップ( 図5C、F)に接続されていることを確認してください。ドキュメント番目顕微鏡ツールバーの「キャプチャ画像」タブをクリックすることでプロセスです。
    7. 組織を収集し終わったら、キャップを右クリックしてキャップを削除してから、「へ移動」を選択し、「アンロードします。」

    PEN膜スライドのオフ個々のドーパミンニューロンの6レーザーキャプチャー

    1. IRおよびUVレーザーの両方を使用してPEN膜スライドのオフ個々の細胞を捕捉するために、マイクロダイセクションのツールバーの「カット、キャプチャ」タブを選択します。目的の細胞をマークする「一点」タ​​ブを選択します。各セルの輪郭を描く「カットライン」タブを使用します。ステップ4.9と4.10で説明したようにIRレーザーをテストしてくださいとカットするために必要な最低限の強度を決定するために、UVレーザーをテストします( 図4および5)PEN膜および組織を考えた
    2. 顕微解剖ツールバーの「キャプチャとカット」タブを選択します。この技術を使用して個々の細胞を収集する場合であっても彼らはLCMキャップに貼付される前に切り出される場合は、最初のこれらの小片としてUVレーザーが続くIRレーザーを発射するようにしてくださいが失われることがあります。
      注:このプロセスはまた、目的の点でIRレーザーを発射することによって手動で行うことができ、細胞を個別にUVレーザを用いて概説する。
    3. 上記のように目的の細胞を収集した後、細胞を除去し、キャップ( 図6)に取り付けられたかどうかを決定するステップ5.7においてLCMキャップを移動させる。
    4. 組織を収集し終わったら、右のキャップをクリックし、 "へ移動」を選択することによりキャップを外して「アンロードします。」

    7.シラン予備校スライドから腹側被蓋領域のキャプチャー

    1. 関心領域を特定するには、免疫組織化学のために処理されたスライドを使用しています。
      注:このデモでは腹側被蓋領域が単離されている( 図7A)。
    2. LCMキャップをロードし、ステップのようにレーザーをテスト4.9と4.10だ。
      注:典型的には、マクロLCMキャップが使用されているが、HSキャップはまた、( 図8を参照)を使用することができる。
    3. 顕微解剖ツールバーの「LCM」タブを選択し、シランプレップスライドから組織の領域( すなわち、腹側被蓋領域)を単離するために、その後「ポリゴン外観」タブを選択します。ライブビデオウィンドウ内の関心領域の概要を説明します。収集のための領域の大きさによっては、低倍率(2X目的)での関心領域の概要を説明します。コレクションのために、しかし、楽器はとても前にキャプチャに10倍の対物レンズの下に赤外線レーザーを調整し、目指して10倍の対物レンズを使用しています。
    4. 顕微解剖のツールバーに - 「捕捉とカット行く」タブを選択します。
      メモ:コンピュータが自動的に全体の選択した領域( 図7F、I)全体のIRレーザーを発射します。 LCM膜が領域全体を十分に溶融されていない場合、レーザは、人間を焼成することができるuallyまたは全体のプロセスが繰り返さ。
    5. 組織を採取し、どの程度を決定するために組織のオフLCMキャップを移動します。
      注:このメソッドを使用して一つのパスは通常、スライド(Figure7Gを参照してください)上の背後にあるいくつかの組織を残す。この問題が発生した場合は、上記の選択とキャプチャ手順を繰り返します。このステップを繰り返すこと( 図7J)採取された組織の量を増やすことができます。
    6. 組織を収集し終わったら、右のキャップをクリックし、 "へ移動」を選択することによりキャップをアンロード「アンロードします。」

    8. PENメンブレンスライドから腹側被蓋領域のキャプチャー

    1. 上記のようにPEN膜スライド上の組織から関心領域を選択するためのガイドとして免疫組織化学のために処理したスライドを使用してください。
    2. 顕微解剖ツールバーの「カット、キャプチャ」タブを選択します。 「カットライン」タブを選択し、immunohistocheを使用して関心領域を概説ミストリーはガイドとしてスライドをラベル。
      注:プログラムは自動的にキャップに組織を取り付けるためのIRレーザーのためのスポットを追加します。より良いキャップに組織を固定するために追加のスポットを追加するには「一点」タ​​ブを使用します。
    3. 10倍の対物レンズ、テスト火の下と4.9と4.10で説明したように、IRおよびUVレーザーを目指しています。 UVレーザは、スライド上の膜を貫通し、このカットは、コンピュータ画面上の位置に対応することができる試験。膜および組織を切断するだけで十分ですが、組織( 図5)損傷しないUVレーザー強度を使用してください。
    4. 顕微解剖のツールバーに - 「捕捉とカット行く」タブを選択します。
      メモ:コンピュータが自動的にスライドPEN膜および組織( 図7C)をカットするUVレーザーを発射後、キャップに添付するために、組織内のすべてのラベルされたスポットでのIRレーザーを発射します。追加のIR溶融したスポットは十分にTISを添付する必要があるかもしれないまた、手動で追加することができますLCMキャップに訴える。
    5. 組織セクション( 図7C)から除去され、キャップ( 図7C)に取り付けられたかどうかを決定するために組織の外LCMキャップを移動させる。
    6. 組織を収集し終わったら、右キャップをクリックし、「へ移動」を選択し、キャップを外して「アンロードします。」

    RNAの9の単離

    1. 捕捉された細胞または組織からRNAを収集するために、37℃で30分間、RNA溶解緩衝液中のLCMキャップ膜をインキュベートする。
      注:HSキャップの場合、アダプターはキャップ上の溶解緩衝液のみ10μlのの使用を可能にし、0.5 mlのマイクロ遠心チューブに取り付けることが可能です。マクロキャップは溶解バッファー50μlのを必要とし、0.5 mlのマイクロ遠心チューブに直接接続されます。
    2. インキュベーション後に0.5 mlのマイクロ遠心チューブに分解、溶解緩衝液をスピン。
    3. すべての細胞の完全な溶解を確実にするために、Or個の組織は、溶解緩衝液中でのキャップと場所のLCMキャップ膜を剥がす。
    4. LCMは、RNAの完全性を測定するためにした後、RNAの完全性を試験するために、スライド上の残りの組織から単離されたRNAを使用しています。
      注:原因LCMで得られた限られたサンプルRNAに、それは一般的にLCM単離されたRNAに、RNAの完全性をテストすることは現実的ではない、しかし、残りの組織からのRNAが原因の間に固定、免疫組織化学と時刻に任意のRNA分解の良い指標を提供していますLCM手続き。

Representative Results

図6及び図7における顕微鏡写真は、個々のドーパミンニューロンの単離のための能力を実証する。一貫してLCMに製造することができる最小のスポットサイズは​​、セルを分離するためにキャップ現在の解剖学的分解能は、約5〜10μmである。特定の細胞型の単離のための唯一の制限は、細胞を可視化する能力である。 LCMは、個々のドーパミンニューロンを単離することができるが、隣接する非標識細胞の部品の汚染が最も起こりやすい。そのため、最終サンプルはドーパミンニューロンの濃縮コレクションではなく、ドーパミンニューロンの純粋な集団である。この技術は、腹側被蓋領域の分離を示すような脳内の離散的な核または領域のような組織の小さな領域を分離することが可能である。以前の刊行物は、脳組織におけるこの使用を実証しているだけでなく、正常組織5,11からの病理組織を単離する。

図9)と比較した。 RNA品質は、全脳RNAと比較して、アセトン固定(RIN 2.6)、続いて免疫組織化学の後に低い整合性LCMのために使用される組織からのRNAサンプル(RIN利用できない)に減少したの相対的減少によってわかるように(RIN 8.2) S18のピークに比べrRNAのS28ピークの高さ。しかし、RNAは、18Sおよび28Sバンドを維持し、遺伝子発現をQ-PCRを用いて測定することができる。

図10A)から単離した。 Q-PCR、逆転写されたドーパミンニューロンからの全脳RNAおよびRNAの濃度の範囲、以前5に記載ようにQ-PCRを用いて測定したβアクチン遺伝子をRNA量を測定した。これらの測定に基づいて、3.55、6.82および20.58頁/μlの濃度は、50、100及び200ドーパミンニューロン、それぞれ( 図10B)から算出した。

ドーパミンニューロンの単離は全体Vの分離と比較する方法を実証するために、entral LCMと被蓋野、ドーパミンニューロン特異的遺伝子(Nurr1は、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン輸送体)は、サンプルのこれらの二つの異なる種類のQ-PCRで測定し、βアクチンの発現( 図11)と比較した。低いC t値は、対象の遺伝子のより高い濃度で生成されるので、ΔCtの減少は、βアクチンのために相対的なドーパミンニューロン遺伝子の発現の増加を示している。これは、個々のドーパミンニューロンの単離はドーパミンニューロン特異的遺伝子の発現を集中方法を示しています。腹側被蓋領域サンプルにおいて、ドーパミンニューロン特異的遺伝子は、βアクチンを発現するが、ドーパミンニューロンの遺伝子を発現していないにも収集することができる他の細胞(非ドーパミン作動性ニューロン及びグリア細胞)のようにして希釈する。

図1

図2
赤外線(IR)捕捉レーザー、紫外線(UV)レーザーカッティングを用いて、図2のレーザー·キャプチャは、組織の大きな領域を取得またはUVレーザを用いた細胞の回収を容易にするために、組織は、膜とスライド上に搭載されている外側のコーナー(PEN膜スライド)に沿ってスライドに接続。 LCMキャップをt上に配置される彼組織及びIR捕捉レーザーキャップ膜を溶融し、LCMキャップに組織を取り付けるために使用される(ステップ1および2)。 UVカットレーザーは、次に(ステップ3および4)スライド膜および組織を切断するために使用されるキャップが取り外されたとき、そのような組織がスライドから除去し、LCMキャップ(ステップ5)上に残っている。

図3
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムのロードマップ。図は。このレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムは、一度に3スライドのスペースがあります。スライドを顕微鏡にロードされるとき、各スライドの低倍率ロードマップ画像が生成される。ロードマップの画像上の領域を選択すると、その領域へのライブ画像ウィンドウに移動します。デモンストレーションの目的で、マウスの脳は3スライド上に10μmのセクションに区分した。最初のスライドは、チロシンヒドロキシラーゼのために標識したimmunoreactiviクロマゲン(A)としてジアミノベンジジンを用いて、TY。切片を、シラン-プレップスライド(B)またはPEN膜スライド(C) ​​のいずれかに取り付けた。これらのスライドの両方が急速蛍光チロシ​​ン水酸化免疫組織化学を使用して標識した。 (C)中の矢印は、スライドガラスにPEN膜の付着を示す。この境界の外ませ組織はLCMで採取することはできません。

図4
図4. IR捕捉レーザーを使用した。IR捕捉レーザLCMキャップに組織に付着し、組織の残りの部分から取り外しLCMキャップ膜を溶融するために用いられる。 IR捕捉レーザは、下にある組織とスライドガラスに接触するように十分にLCMキャップ膜を溶融するために十分な強度でなければならない。レーザーが、膜を融解するには不十分であったときに上記画像が実証スライドに(2スポットを左)。溶融した膜は、スライドガラスに接触すると、太い黒い輪郭(右スポット)を観察することができる。レーザの強度は、電源(3-100 mW)と、パルス(100-1,000,000秒)及びレーザーの#ヒット数を変えることによって調整することができる。さらに、同じスポットにおけるIRレーザーの繰り返し発射はさらに、膜を溶かすことができる。 IRレーザーの目的は、いつでもLCMキャップを移動させるか、目的が変更されたときに調整される必要がある。スケールバー=100μmである。

図5
図5. UVカットレーザーを使用した。UVカットレーザPEN膜および組織を切断するために使用される。 UVレーザは、組織を損傷する可能性があるので、膜および組織を切断するのに必要な最小強度を使用する前に決定する必要がある。上記の、異なるUVレーザー強度の3つのスポット(矢印)がで示されている 10μmの切片、厚い部分のための中間点と高すぎるUVレーザ強度​​を示す適切な場所に十分な左スポットサイズ。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
IRレーザーを使用して、チロシン水酸化酵素免疫反応性ニューロンの図6.直接単離。ドーパミンニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ(A)のための迅速な蛍光標識後に示されている。 IRレーザがこれらのニューロン(D)上のLCMキャップ膜を溶融発生したときに、キャップの除去は、スライド(B、E)から離れ、これらの細胞を取り出す。 LCMキャップ(C、F)に取り付けられ、これらのニューロンは、その後可視化することができる。スケールバー=250μmの。= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
IRお ​​よびUVレーザーを使用して、PEN膜スライドからチロシン水酸化酵素免疫反応性ニューロンの図7.直接単離。チロシンヒドロキシラーゼラベルニューロンは(A)の上に示されている。これらのニューロンはIRレーザーを使用してLCMキャップに取り付けられており、UVレーザー(B)を用いたPEN膜のスライドから切断することができる。スケールバー=250μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8
図8.間接チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性を用いて、腹側被蓋領域の単離。腹側被蓋領域におけるドーパミンニューロンの位置は、標準的な免疫組織化学的手法(A及びE)を使用してセクションで可視化した。この免疫組織化学標識部分は、染色されていない隣接部分(B及びF)で腹側被蓋領域を見つけるための鋳型として使用した。 UVレーザーを用いて、腹側被蓋領域は、IRレーザーでLCMキャップに取り付けられており、UVレーザー(CおよびD)でスライドから切断し、HS LCMキャップ(D)に取り付けられて示された。唯一のIRレーザーを用いたシランプレップスライドから単離された腹側被蓋領域はまた、マクロキャップ(FK)に取り付けられて示されている。複数の試みは、この領域(GおよびJの比較)からの組織の大部分を収集するために必要であることに注意してください。スケールバー=500μmの。PLOAD / 52336 / 52336fig8large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9
図9 RNA品質代表的電気泳動図であり、市販全脳RNA(A)およびRNAアセトン固定およびLCM(B)の後の節から単離されたまたは迅速な蛍光チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学およびLCM(C)の関連したゲル画像。 RNA品質は、全脳RNAと比較して、免疫組織化学のために処理セクションに減少したものの、電気泳動図は、rRNAのS18及びS28のピークの存在に基づいて、主に無傷のRNAを示す。全脳RNA濃度は、8.2のRINと6.487 PG /μlであった。アセトン固定組織RNA濃度は、2.6のRINと5.036 PG /μlであった。 RNAは、免疫組織化学の時間後に得られた広告4.474 PG /μLとRINの濃度は使用できませんでした。

図10
図10. RNA量は。LCMを用いて得られたニューロンにおけるRNAの量を決定するために、RNA濃度の標準曲線は、蛍光分光器およびQ-PCRを用いて製造した。蛍光分光測定(A)の場合は、大規模なグラフは、RNA量の高い範囲を示しており、小型のグラフは、10 PG /μlにダウンこのアッセイの感度を示している。 50、100及び200ドーパミンニューロンから得られたRNAの濃度は、それぞれ、17.3、24.8および50.9 pgの/μlであった。 RNA量(B)を測定するためにQ-PCRを用いて、RNAの濃度は、50、100及び200ドーパミンニューロンから得られた、それぞれ、3.55、6.82および20.58頁/μlであった。

ES / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/>
個々のドーパミンニューロンの分離とドーパミンニューロン特異的な遺伝子の図11.集中。ドーパミンニューロンのサンプル中のドーパミンニューロン特異的な遺伝子(のNurr1、チロシンヒドロキシラーゼ、およびドーパミントランスポーター)及びβアクチンの間のC T(ΔCtの )の違いLCMで単離し腹側被蓋領域に示されている全体の腹側被蓋領域の解剖における発現と比較した。低いC t値は、対象の遺伝子のより高い濃度で生成されるので、ΔCtの減少は、他の細胞(非ドーパミン作動性ニューロン及びグリア細胞)としてβアクチンする相対ドーパミンニューロン遺伝子の発現の増加を示すであろうβアクチンを発現するが、ドーパミンニューロンの遺伝子を発現しない腹側被蓋領域サンプルに収集することができる。

Discussion

LCMは、顕微鏡スライドおよびRNA、マイクロRNA、DNAおよびタンパク質のその後の単離上の細胞又は組織切片からの組織の領域の離散的な集団の解剖のための強力な技術である。これらの技術の感度が向上し、必要な出発物質の量が減少するようなマイクロアレイ、次世代のRNA配列決定、DNAおよびプロテオミクスのエピジェネティックな分析などのハイスループット技術を用いた分析と組み合わせたLCMの使用がますます一般的になってきている8-12。 LCMで、より良い解剖学的分解能はサンプルに対して達成され、これらのサンプルの下流策から理解が大幅に強化される。 LCMの一つの注意点は、それが目的の細胞必ずしも必要ではないが、細胞の純粋な集団の濃縮サンプルを提供することである。精度の限界は、隣接する組織からのいくつかの汚染があることを意味する。しかし、この技術は、対象の細胞を濃縮し周囲の組織および細胞に関連する影響を最小限にし、関心対象の細胞に対する実験的な効果を最大化する。

間接免疫組織化学対ダイレクト

LCMは、現在RNAが無傷に保ち、分離およびRNAの測定のために主に利用されているので、非常に重要な基準である。 RNAの完全性を維持することは、RNA( 図10)を低下させる可能性が直接組織を染色する必要性を除去し、組織の切開を案内するための間接的な免疫組織化学の使用の背後にある主な根拠である。実験的な問題は、しかしながら、そのようなドーパミンニューロンなどの細胞の特定の集団の単離を必要とする場合、直接蛍光免疫組織化学が必要とされる。迅速な免疫組織化学標識プロトコールを使用して、処置中にRNAの分解を最小限に抑えることができる。短いインキュベーション時間は、一次及び二次抗高濃度の使用によるものであるボディ、10-20約2時間のインキュベーションとの従来の免疫組織化学のために必要なものより倍高い濃度。しかしながら、より長いインキュベーション時間が必要な場合は、ブラウン·スミスは、RNA分解を阻害し、長いインキュベーション時間(20時間まで)13との良好な品質のRNAを得るために、高塩緩衝液を使用した。組織およびLCMシステムへのアクセスを得るための標識との間に必要なかなりの時間がある場合は、この方法を使用することもできる。

PEN膜、シランプレップとコーティングされていないガラススライド-スライドの選択

LCMのためにコーティングされていないスライドガラスの使用は、14の報 ​​告されている。このコーティングは十分に組織の損失なしに、免疫組織化学のためのスライドに組織を添付し、それでもスライドからLCMキャップに対する組織の着脱を可能にするので私たちの研究室では、シランプレップスライドは、最適な選択であることが判明している。コー​​ティングされていないガラススライドを持っている免疫組織化学手順をいくつかの組織の損失を示した。間接的な免疫組織化学を使用する場合、しかし、組織保持はそれほど問題となる。シランプレップスライドのオフ適切な脱水、捕獲細胞や組織の問題ではなかった。この論文に記載さニューロンまたは脳領域を単離するための様々なアプローチの各々は、長所と短所がある。個々のドーパミンニューロンの単離のために、シラン準備スライドの使用は、より良い光学系の利点を有し、PEN膜スライドよりも安価である。欠点は、不十分な脱水がある場合、時々捕獲細胞が困難であるということである(下記参照)、いくつかの組織は、スライド上に残してもよい。 PEN膜スライドの利点は、IRレーザー、UVレーザーの組み合わせを使用すると、ドーパミンニューロンが収集されることを保証することである。それは、スライドガラスよりも脱水にあまり依存しないようにPEN膜から細胞が回収されない場合、発生することはほとんどないスライドします。アン追加の利点は、UVレーザは、より密接にIRレーザーをガラススライドから離れニューロンを捕捉するための円と比較して、関心のあるニューロンの形状を近似するために使用することができることである。組織領域の単離のために、PEN膜スライドははるかに優れていると追加コストを正当化する。膜上で切り出した全ての組織の完全な除去は、このアプローチの結果は、単独のIRレーザーを使用して、組織の大きな領域を捕捉し、より厚い組織切片を採取することができるよりもはるかに高速である。唯一のIRレーザーを使用して、LCMキャップ膜全体を完全組織領域にわたって溶融することを必要とする。さらに、組織の不完全なコレクションは、典型的であり、通常、複数の試行が必要です。このPEN膜スライドから組織を単離するよりも時間がかかりますが利用可能な組織をガラススライド上に既にあるか、UVレーザが利用できない場合、組織の大部分は( 図8J)を収集することができるように、これは実行可能な選択肢である。

ove_content "> 重要なステップ

100%エタノールのインキュベーションは、最も重要な工程の一つである。シランプレップスライドから細胞を収集するために、組織の完全な脱水が必要である。そのため、100%エタノールのインキュベーションに主に関連している削除されていないすべての水は、スライドから細胞をピックアップする能力に影響を与えます。この問題に対処するために、しばしば脱水に影響を与えることができる前の洗浄段階からの空気または転送からの水の吸収として、100%のエタノール溶液を変更する。また、モレキュラーシーブは、任意の水の汚染を吸収するために使用される。 LCMシステムは、理想的には、低湿度条件を維持するための除湿機の小さな部屋に配置する必要があります。

グッドクライオスタットのセクションでは、適切なLCMのために重要である。切片は最小化された組織における襞に平らにしておく必要があります。 LCMキャップとの間の距離を増加させ、tと接触するのを防止する組織にひだ彼は組織。その後、十分に組織上に膜キャップを溶融することが困難になる。スライドガラスは、典型的には、セクションの厚さは6と12ミクロンの間である必要がある。厚い部分は、PEN膜、スライドを撮像することができる。

LCMは、顕微鏡スライドからの組織および細胞の非常に正確な解剖をする技術的能力を提供しています。これは劇的に組織片の肉眼解剖と比較して、さらなる分析の分解能を増加させる。 LCMは、時間と労力を要することができ、が、他のハイスループット技術と組み合わせると、離散細胞または解剖学的領域が使用される場合、非常に生物学的プロセスの理解を高めることができ、広範囲の訓練又は専門知識を必要としない。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System Life Technologies, Grand Island, NY Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0211
CapSure HS LCM Caps Life Technologies, Grand Island, NY LCM0213
PEN Membrane slides Life Technologies, Grand Island, NY s4651
Silane prep-slides Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S4651
95% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7148
100% Ethanol-RNase Free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Rnase Free Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8787
Molecular Sieve EDM Millipore, Billerica, MA MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody EDM Millipore, Billerica, MA Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life Technologies, Grand Island, NY A-11008
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2939AA
Stratagene MX 3005P Agilent Technologies, Santa Clara, CA 401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen Life Technologies, Grand Island, NY R11490
RNaseZap Life Technologies, Grand Island, NY AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  2. Schutze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).
  3. Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine. Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).
  4. Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection. Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).
  5. Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes. Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).
  6. Seelan, R. S., et al. Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia. Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).
  7. Kim, W., et al. miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling. Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).
  8. Bohm, C., et al. Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis. Journal of Neurochemistry. 97, Suppl 1. 44-49 (2006).
  9. Kadkhodaei, B., et al. Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).
  10. Miller, R. A., et al. Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain. Journal of Neurogenetics. (2014).
  11. Roberts, E., et al. Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure. Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).
  12. Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression. Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).
  13. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, 2364-2374 (2009).
  14. Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. Laser capture microscopy. Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics