마우스 배아의 자궁 내 인트라 심장 토마토 렉틴 주사에서 신장 혈류를 측정하기 위해

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

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Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

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Abstract

형성 및 (떨어져 사구체) 신장 혈관의 관류 현상 understudied 크게된다. 혈관은 수지 캐스트, 생체 초음파 이미징 및 마이크로 해부와 같은 관류 매핑 기술 사이의 친밀한 관계를 입증 제한되었습니다 (드 노보 혈관 형성)과 혈관 생성 (주요 혈관의 떨어져 분기 인) 혈관을 통해 개발로 배아 내에서이 두 가지 프로세스와 개발 신 구조. 여기서 우리는 신장 관류의 개체 발생을 측정하기 위해 마우스 배아에 자궁 내 심장 초음파 유도 FITC 표지 토마토 렉틴 microinjections에서의 절차를 설명합니다. 토마토 렉틴 (TL)를 수확 배아 신장에 걸쳐 관류했다. 네프론 전구 세포, 네프론 구조, ureteric 상피 세포 및 혈관 : 조직을 포함, 다양한 신장의 구조에 대해 공동으로 염색 하였다. E13.5 구경이 큰 혈관에서 시작하는 것은, 그러나 말초 관류선박 unperfused 남아 있었다. E15.5 및 E17.5으로 작은 말초 혈관뿐만 아니라 사구체 관류 될 시작했다. 이러한 실험 방법은 배아 발생 동안 혈관 혈류의 역할을 연구하는데 중요하다.

Introduction

배아 개발하는 동안 두 개의 분리 된, 그러나 동시에, 혈관 프로세스는 자리를 차지할 : 혈관 신생을, 과정을 선박이 주거 내피 전구 세포 1,2에서 선박의 새로이 형성이 큰 기존의 선박 및 혈관 형성에서 성장된다. 후자는 주로 그것의 부재하에 일어날 것으로 생각되는 반면, 각각 전자는 혈류와 동의어이다.

혈관 형성에 동시, 신장 전구 세포 합성, 증식, 분화의 순환과 역동적 인 과정은 배아 일 9.5 (E9.5)에 전개하기 시작한다. 이 시점에서 ureteric 버드 (UB)는 metanephric 중간 엽 (MM)를 주변에 등쪽에 침입, 출생 3 때까지 계속됩니다. 빠르게 metanephric 캡 중간 엽 응축에 UB의 분기에 반복 신장의 기능 단위, 네프론의 형성을 시작합니다. UB와 neph의 모든 새로운 세대와 함께론은, 이전 세대들은 다음 주로 혈관 밀도가 높은 환경에서 더욱 성숙과 분화를 거쳐 내부 피질과 수질 지역으로 변위. 레슬러 외. (3)에 의해 입증되는 바와 같이,이 프로세스는 예컨대 배아 UB 및 MM, 및 세포 외 인자 3-6의 무수 간의 크로스 토크로, 시그널링 유도하여 침전된다. 두 최근 조사 외 개발 췌장 내 요인과 신장 산소 긴장과 혈액의 흐름 7,8를 포함한다. 후자는 신장 개발과 관련하여 이하​​에서 더 상세히 설명 될 것이다.

혈류 잠재적 네프론 전구 세포 분화뿐만 아니라 다른 기관 형성 공정, 배아 혈류 맵핑의 정밀하고 정확한 방법으로 재생되는지 유도 역할을 노출하기 위해 필수적이다.

혈류 이징의 다른 방법은 UL의 처방을 포함trasound 이미징 및 수지는 9,10을 캐스팅합니다. 결론적으로, 이러한 모드는 동시에 본래 혈류 간의 공간적 병치을 공개하고 세포 분화 줄기 능력이 부족한 것으로 밝혀졌다. 수지 캐스팅은, 예를 들면, 그러나 배아 시점과 같은 미성숙 용기에, 성인 조직 내의 혈관 패턴의 유효한 모델을 제공하는, 선박 조잡한 외교적 누설이다. 따라서, 수지, 자주 다공성, 작은 혈관 내에 유지하는 데 실패 캐스트.

이러한 명백한 장애물, 다른 사람의 사이에서, 우리는 초음파 유도 신장 개발의 우리의 조사에 생체 내 심장 배아 토마토 렉틴 (TL) microinjections에 통합하기로 결정했습니다. 이 절차에서는 동기 E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 및 시점에 마우스 배아 좌심실 TL 용액 2.5 μL를 가득 탑재 마이크로 피펫을 안내하는 바늘 초음파 프로브를 이용한다. E17바늘이 더 발달 된 배아를 관통 할만큼 강하지으로 0.5 최신 개발 시대입니다.

이 미세 주입 방법의 장점은 풍부하다. 초음파 유도 미세 주사는 정확한 배아 좌심실 내 주사 바늘의 위치, 동물, 심장 손상을 최소화하고 주변 조직의 고동 치는 심장에 솔루션의 수동 및 제어 추방, 갑자기 심장 장애의 회피와 죽음을 수 있습니다 배아 전신 관류 전에. FITC 표지 된 TL를 이용하여, 임의의 관류는 혈관 내피 세포의 정단 막 따라 마커를 유지할 것이다. 면역 함께, PECAM (CD31, 혈소판 내피 세포 접착 분자) 및 기타 다양한 혈관 마커를 이용하여 알기 쉽게 할 수있는 관류 비 - 관류 용기 구별뿐만 아니라 주변 조직의 모든 비정상적인 얼룩을 특성화.

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Protocol

참고 : 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 실험을 승인했다.

초음파 미세 주입 장비 및 태아의 1. 준비

  1. 단, 마운트 및 프로브 (그림 1)과 수술 도구 (그림 2)를 설정합니다. 37 ° C 온난화 목욕 장소 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 (pH 7.4로). 그 자료를, 제 2가요 25 G 바늘에 부착 된 1 ML의 주사기를 사용하여, 미네랄 오일 전적으로 미세 주사 바늘을 입력합니다.
  2. 회전에 바늘을 고정 마운트 암, 미네랄 오일 솔루션의 빈 바늘. TL 솔루션의 2.5 μL에 다시 입력합니다. 공기 방울이 주사 바늘 내에 존재 없는지 확인합니다. 멀리 단계에서, 벽을 향해 바늘 암을 돌립니다.
  3. 이소 플루 란의 연속 주입을 통해 마취 실에서 임신 한 어머니를 마취. 어머니가 무의식 경우, C에 위치 코 튜브에 마취를 전송코 튜브의 주둥이와 앙와위에서 audal 무대의 측면, 그리고 장소 어머니는 완전히 마취 상태의 지속을 허용합니다.
  4. 45 ° 각도에서, 또는 손과 발을 테이프 사지는 휴식과 솟다 ECG / 온도 모니터 탭에 위치. 이는 임신 댐 지속적 그 마취를 위해 모니터링하는 것이 중요 충분하며, 눈에인가에 해당 연고 건조 감소.
  5. 부드럽게 초과 제품과 머리를 제거하기 위해 70 % 에탄올 포화 면봉으로 다시 마른 면봉으로 닦아하고, 어머니의 하복부에 걸쳐 머리 제거 제품을 적용합니다. 절개의 사이트 (그림 3)에서 모든 머리 떨어져 복부 피부를 청소해야합니다.
  6. 미세 수술 집게와 가위를 사용하여 임신 어머니에 개복술을 수행합니다. 주요 혈관이나 내장 기관을 절단 않도록주의하십시오. 1.5 cm 질보다 먼저 표피의 직선 절개를하고 approximat 리브으로 잘라 계속엘리 2-3 cm. 내장 기관과 자궁 saccules 내부를 노출, 동일한 길이를 따라, 피하 막을 노출 원격 교육 알바 ( "화이트 라인") (그림 3)를 찾아 초기 절개에 평행하게 잘라.

태아의 2. 추출

  1. 어머니와 배아를 기동 6 인치 면봉을 사용합니다. 조심스럽게 절개 개방에서 처음으로 배아를 조작 할 수 주걱으로 피부에 (강제하지 않음) 누릅니다. 최초의 배아 saccule의 추출 후, 부드럽게 천천히 통해 어머니의 외부에 자궁 뿔의 나머지 부분을 잡아 당깁니다. 이 단계에서 절개를 통해 소장 또는 다른 장기를 당겨하지 마십시오.
  2. 배아를 정량화하고 부드럽게 어머니로 다시 왼쪽 자궁 경적을 배치합니다. 그런 다음 뿔에 질에서 배아 saccule 멀리 시작하여 아래쪽으로 이동 다시 어머니에 오른쪽 자궁 경적을 배치 시작합니다. (두 개의 배아가 노출 남아 때까지 Fi 인터넷이 계속gure 4). 마지막으로, 위의 열 병렬로 위치 배아는 자궁 순환을 차단하지 인식되고, 선을 절개합니다.
  3. 팔과 몸뿐만 아니라 다리와 꼬리 사이에 점토 블록과 위치를 놓습니다. 점토 표면이 개복 수술 절개와 약 수준 있는지 확인합니다. 37 ° C PBS로 유창 페트리 접시를 젖은.
  4. 왼쪽 (배아 창호 병렬)와 오른손과 유창 페트리 접시와 연장 집게를 잡고 페트리 접시의 상단에서, 창호를 통해 폐쇄 집게 ~ 5 cm를 가져온다. 완전히 창호 메쉬를 찢어없이 열기 집게.
  5. 배아 위에 손을 책략과 두 개의 배아 saccules에 시력을 초점을 맞추고있다. 없이 (또는 가볍게) 슬릿을 통해 슬라이드와 어머니의 복부에 페트리 접시를 설정, 창호 메쉬 또는 집게로 saccules을 터치. 집게가 계속 확장으로, (양쪽에 각각 배아의 기지에서 그것을 장착 할 때 그림 5 유창 메쉬를 조작
  6. 다음으로, (그림 6) 곤란 또는 배아를 손상없이 페트리 접시에 벽을 포함하는 파란색 고무를 배치합니다. 확인 점토 블록을 단단히 페트리 접시, 배아, 고무 함유 벽을 균형되어 있는지 확인합니다. 유창 메쉬에서 누출을 제어하면서 배아가 완전히 (그림 6) 침수 될 때까지 마지막으로, 37 ° C PBS와 페트리 접시를 입력합니다.

3. 사출 절차

  1. 다음 낮은 사출 어머니와 배아 다운 Z-레벨 조정 노브 (그림 1)를 사용하여 함께 무대 및 프로브 팁 왼쪽과 아래 바늘 ½ 센티미터로, 주사 바늘을 ​​회전하고 팔을 탑재하고 초음파 프로브와 직접 줄 (그림 7) . 45 ° 거리 프로브에서 바늘 팔 (안 바늘)을 밀어 넣습니다. 접시 또는 초음파 프로브 바늘의 끝 부분을 충돌하지 않도록주의하십시오.
  2. 초음파 페이지로, 다시 원래의 높이에 주입 단계를 올립니다직접 배아 프로브 위의 옷은 약간 잠긴 배아 조직의 3-4mm 내에서해야합니다. 사용 X & Y 단계 조절 노브 (그림 8)는 체계적으로 박동 배아 마음을 찾습니다 배아 / 어머니 / 무대 위치를 수정합니다.
  3. 직접 초음파 화면의 중심이 그려진 검은 센터 대상 마커 (*)를 관찰한다. X & Y 단계 조절 노브를 사용하여 좌심실 (바람직한) 또는 심방 (그림 8)를 찾은 후 올리거나 초음파 화면에 검은 센터 마커를 통해 정밀하게 분사 대상의 위치를 무대에 회전 노브를 사용하여 무대를 내려 놓습니다.
  4. 초음파 화면 오프, 오른쪽으로 배아를 이동 X 단계 조절 노브를 사용합니다. ½의 거리에서 cm 및 초음파 프로브 90 ° (그림 7), 미세 주사 바늘의 위치를 변경하고 다시 제자리에 팔.
  5. 미세 주입 명확하게 팁 등으로 조정 노브 (그림 9C-G), 위치 바늘을 장착하여중앙 마커 igned. 니들 팁 올바른 평면 집중되도록하고, X, Y, 및 미세 니들의 Z 벡터 (도 9C 및 EG의 손잡이를 사용하여) 사출 각도를 조정한다. 오직 "주입"노브 (그림 9F)를 사용하여 미세 주사 바늘을 ​​후퇴, 조심하지 다른 크기를 조정합니다.
  6. 다시, 정확하게 초음파 화면 중심 표시 대상에서 다시 프로브하에 전적으로 X 미세 조정 스테이지 노브 배아 움직임을 이용하여. 좌심실 정확히 같은 X, Y 및 Z 평면에 지금 있는지 확인하십시오.
  7. 미세 주입에 그냥 "주입"노브 마운트와 다음, 천천히 미세 주사 바늘로 배아에 구멍을 점차적으로 좌심실에 팁을 가져. 한 번 (그림 2A & B)를 "빈"잡고 "입력"눌러 빈 경고음 소리 좌심실로 또는 때까지 TL 솔루션의 전체 2.5 μl를 주입한다. 이 때주사의 심장 챔버로 유입되는 TL (그림 10)는 바늘의 끝에서 나오는 그림자를 관찰한다. 반대로, 빠르게 주입이 완료되면 마이크로 인젝션에 "주입"노브 (도 9F)가 회전 마운트 마이크로 인젝션 니들을 후퇴.
  8. 다음 배아에 계속 이러한 일련의 단계 다음 남은 배아에 대해이 절차를 반복하고 마지막으로 다시 댐의 복부에 최종 배아를 놓습니다. 챔버 상자로 마취를 전환하고 부드럽게 마지막 주입 시간에서 15 분 동안 여기에 어머니를 이동합니다.

4. 수확 배아 및 분석

  1. 자궁 경부 전위를 통해 댐을 희생. 쉽게 어머니의 자궁 뿔을 제거하는 개복 수술 절개를 확장합니다. 자궁 주머니 내에서 배아를 유지합니다. 냉장 PBS에서 배아를 놓습니다.
  2. (경우 유전자형에 필요한 수집 조직) 자궁 주머니에서 배아를 해부하고 전체 배아를 배치 전n은 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 하룻밤, 그 다음으로 30 % 자당 하룻밤, 매체 단면 저온 유지 장치에 고정. 그런 다음 동결 절단 (Cryosections)을 절감하고 면역 조직 화학 분석을위한 슬라이드에 배치합니다. 선택적으로, 조직에 대한 사용을 100 % 메탄올 탈수 4 % PFA로 고정을 수행하여 전체를 실장.
  3. 면역 조직 화학 분석을 위해 OCT를 제거하기 위해 PBS에 저온부를 배치합니다. 그런 다음 30 분 동안 10 % 정상 당나귀 혈청 섹션을 차단합니다. 그런 다음 1 PECAM 차 항체를 추가 : 100 희석 4 박 ° C에서. 다음 날, 10 분 각각 PBT 3 번 슬라이드를 세척 및 보조 당나귀 안티 쥐 594를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    참고 :이 초음파와 미세 주입의 최적화 및 조정을 필요로하는 매우 까다로운 기술이다. 이이 기술에 관련된 매우 가파른 학습 곡선이고 하나는 능숙되기 전에 멘토링 주사 4 ~ 6 주 정도가 필요합니다.

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Representative Results

혈관 형성은 신장을 개발 흐름을 선행

(신장 포함) 배아 조직의 대부분은 심지어 초기 배아 시점에서, 조밀 한 혈관 (unperfused 및 관류 모두)가 포함되어 있습니다. 개발 신장 내에서 더 나은 게이지 분석 혈액의 흐름에 우리는 자궁 내 배아 심장 내 microinjections의 방법을 이용했다. 개복술을 통해 추출 번의 자궁 saccule 노출 다음 E17.5 통해 E11.5에서 배아 심장을 식별하는 고해상도 초음파의 사용과 함께, 우리는 TL 2.5 μl를 주입 할 수 있었다 (형광 염료 (FITC))은 π 공역.

우리는 각각 약 90 % ~ 80 %의 성공률 중 최고의 주입 E13.5 및 E15.5 태아 시점을 발견 하였다. 때문에 E11.5에서 상대적으로 미성숙 한 마음의 존재와 E17.5에서 조밀 한 연골과 뼈의 형성의 존재, 외곽 TI의저 중간 점 배아 시간 지점에 비해 실질적으로 성공의 낮은 확률로, 주입하는 비교적 어렵다. 하나는 각각 E11.5 및 E17.5 시간 점 ~ 30 %의 성공률을 ~ 적어도 50 %를 예상하고있다.

PECAM (CD31), 보편적 인 내피 세포 마커와 공동 라벨링 조직함으로써, 우리는 질적으로 세 그룹으로 형광 혈관과 조직을 분류 할 수있다 : 관류 혈관 (PECAM 양성 및 TL 긍정적), unperfused 혈관 (PECAM 긍정적 인), 그리고 비정상적으로 관류 구조 (TL 긍정적). 이 특별한 염색 패턴은 우리가 공간적으로 관류 및 취소 관류 (그림 11)의 영역을 구별 할 수 있습니다.

E11.5에서, 우리는 관류 선박이 실제로 기관 (그림 12B)에 관통하지 않고 웹과 같은 패턴으로 개발 신장을 캡슐화 것을 발견했다. E13.5으로 주요 혈관은 이하의 몇 관류TL (도 12c)로 염색 액세서리 선박. ureteric 상피 세포의 일부는,이 중 이미 관류 또는 인해 초기 배아 혈관의 고유 leakiness하는 사구체에서 할 수있다 걸쳐 염색도 볼 수있다. E15.5 주요 혈관 관류으로 사구체 그러나 많은 수의 또한 중요한 필터링 (그림 12D)를 발생 제안, TL 얼룩을 들고 관찰 할 수있다. 신원 성 외측 영역의 상당 부분은 혈류의 결여 된 것으로 나타나지만 또한이 때, 표시는 작은 구경으로 관류 용기 번호를 가리. 마지막으로, 그러나, E17.5에 의해 신장의 대부분은 따라서 주변 지역에서 혈관 신생의 부재를 나타내는 관류 주로없는 인 신원 성 영역 (PECAM 긍정적 인 혈관 그러나 밀도)의 혈관을 제외하고 관류했다. 작은 구경 혈관 TL을 포함하고 관류 사구체의 평균 수는 극적에있다초기 시점 (도 12E)에 비해 주름.

그림 1
그림 1. 초음파 프로브, 수술 단계, 미세 주입 시스템, 철도 시스템 및 ECG / 온도 모니터 기본 설정입니다.

그림 2
그림 2. 필요한 수술 장비, 솔루션 및 장치. (A) 면봉. (B) (반지) 집게를 확장. (C) 외과 용 가위. (D) 집게를 블런트 팁. (E) 미세 집게. (F) 미세 주입 바늘 (Origio, # 1 C060609). (H) 사출 / 컨트롤러를 입력합니다. (I) 인산 완충 생리 식염수 (PBS). (J) 미네랄 오일 (시그마 알드리치).

그림 3
그림 3. 2 cm의 개복 수술은 자궁 위의 피하 층 (복벽)를 노출, 마취 어머니 수행됩니다. 수술 가위 및 미세 집게를 이용, 원격 교육 알바를 노출하고 표피 인하 절개 평행합니다. 여기를 클릭하십시오 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.

그림 4
그림 4. 1-2 E15.5 자궁 saccules이 개복 수술 절개를 통해 추출 노출. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오그림의 버전입니다.

그림 5
그림 5. 노출 된 자궁 saccules은 연장 집게를 사용 유창 페트리 접시에 슬릿을 통해 안내. 유창은 saccules의 기지에서 snuggly에 좌석을 물리는.

그림 6
그림 6. 자궁 saccules의 오른쪽에 배치 블루 포함 된 벽. 페트리 접시는 배아 때까지 37 ° C PBS로 채워진 벽을 함유 완전히 침수된다. 점토 블록은 팔과 몸과 다리와 꼬리 사이의 페트리 접시 / 배아에서 안전하게 배치했다.

그림 7
도 7. 사출 시스템하여 위치 될 네드 ½ cm 왼쪽 아래, 초음파 프로브 90 ° ~.

그림 8
도 8. 스테이지의 X 및 Y 조정기구.

그림 9
그림 9. 빈 / 장치, 미세 주사 시스템을 작성하고 마운트를 준비. (A) 버튼을 입력합니다. (B) 버튼을 주입한다. (C) 원형 바늘 각도 조절 손잡이. (E) X 미세 조정 노브. (F) "주입"노브. (G) 코스 X 조정 노브. (H) 단계 높이 조절 노브를 회전.

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그림 10. E15.5의 내 심장 TL 미세 주입. 바늘 끝의 초음파 이미지가 심장 챔버 내에 위치, TL 솔루션은 두 개의 챔버 내에서 검은 그림자로 표시됩니다. 심막과 심낭 공동 쉽게 차별화된다.

그림 11
그림 11. 관류, unperfusion 및 식별 비정상적인 염색 사이의 영역은. 첫 번째 패널은 PECAM 얼룩을 보여줍니다. 가운데 패널은 조직의 동일한 영역에 걸쳐 TL 얼룩을 표시합니다. Ureteric 새싹 비정상적으로 스테인드이다 주요 혈관 흰색 점선으로 싸여있다. 마지막 패널은 병합입니다. 흰색 화살표는 혈관 누출을 나타내고, 회색 화살표는 용기쪽으로 천이 관류되는 것을 보여준다. 노란색 구조는 완전히 관류 혈관을 나타냅니다.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "대상 ="_ 빈 "> 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12
그림 12. 배아 신장 관류 개체 발생을 조사한다. (A) 전체 E11.5 배아가 관류, TL을 들고 머리와 꼬리 영역 내에서 매우 말초 혈관으로. (B)는 주변 혈관 관류 본하지만 웹 형상의 패턴에 현상 E11.5 신장에 도입되지 않은,이 시점에서 확산 염색 상당히 많은 양의도있다. (C) E13.5 신장 주요, 구경이 큰 선박이 신원 성 영역 (흰색 점선) 내 결석 관류와, 신장 (흰색과 노란색 화살표)에 걸쳐 관류 보여줍니다. (D) E15.5 신장이 작은 구경에 걸쳐 관류를 보여, 말초 혈관 (노란색 화살표)일부 사구체 (흰색 화살표), 다시 주변 신장 벽난로에서 관류의 부재에서. (E) E17.5 신장은 사구체 (흰색 화살표)에 걸쳐 광대 한 관류 작은 구경 용기 (노란색 화살표)를 보여줍니다. 신원 성 영역이 확대에서 신장의 나머지 부분과 구별이다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

마이크로 인젝션 마취 시간 프레임

어머니의 마취에 관해서, 그것은 공기 흐름 상수 (2-3 L / 분)과 낮은 PSI에 유지하는 것이 필수적입니다. 진정제의 흐름 / 분 약 1.75-2 L에서 개최합니다. 동시에, 주사가 수행하는 시간대는 면밀히 관찰하고 각각의 쓰레기에 대한 제어되어야한다. 각 쓰레기를 들어 주사 과정은 45 분하에 유지되어야한다. 각각의 배아 체 관심 장기에 걸쳐 조절되고 불변 관류를 용이하게하기 위하여 일정한 정상 심박수 범위 내에서 유지되어야하기 때문에이 시간 제한의 중요성은, 실험에 가장 중요하다. 우리는 배아 사이의 관류 패턴의 모호한 결과와 변동에 주사 결과를 길게하고하는 것은 성공적인 주사 (즉, 느린 심장 박동, 심장 사망)의 비율을 낮추는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 깔짚 내의 최종 주사 후, 그것은 필수적인약 15 분을 허용하도록 각각의 배아 배아 내의 적절한 전체 관류를 용이하게 수확 전에.

절차 적 치료 및 배아의 관리

배아 추출하는 동안, 우리는 배아 추출시 전체의 건강과 자궁 라이닝과 배아의 무결성에 참석하여 수행되는 주사와 성공의 큰 비율을 발견했다. 자궁 주머니를 조작하고 기동 (PBS로 포화) 섬세한 면봉을 사용하고 saccules는 프로 시저를 통해 산모와 태아의 생존을 보장하기 위해 필수적이다. 첫째, 자궁 태반의 물리적 무결성을 적절히 유지하는 것이 중요하다. 배아 혈액의 흐름을 방해하거나 태반 혈류 공급 혈관 상당한 파손을 일으킬 것이다 방식 saccules contorting을 피한다. 이것은 maximu를 추출함으로써 달성 될 수있다한 번에 1-2 배아의 m (초기 카운트 전체 자궁 주머니를 추출하지 않는 한)과 태반의 기지에서 멀리 주요 혈관에서 어플리케이터를 배치하여.

배아 주사 부위의 위치

초음파 시스템과 적절한 위치에 마이크로 인젝션 니들을 안내하는 각 사출 시도 중요하다. 주의 깊은 관심은 센터 마커에 좌심실의 위치 선정과 중심에 부여해야합니다. 이 후, 바늘이 위치해야하고 동일한 X 및 Y 플랜 바늘과 주사 부위를 맞출뿐만 아니라 중앙에 정확하게 중심 마커. 이 작업이 완료되면, 천천히 주사 부위에 가까운 바늘 끝을 그리고 심낭 낭과 심장에 과도한 스트레스가 가해지지 않도록 해주십시오. 이것은 바늘 서서히 조직층 통과하게보다는 그들을 통해 바늘의 통로를 강제함으로써 수행된다. 주입하는 동안, 또한 L에 중요OOK 바늘 끝 (그림 10)에서 나오는 검은 그림자 밖으로. 이것은 심실 충전 TL 용액 나타낸다. 바늘 끝 위치가 올바른 경우, 그림자 연속적 나타나야와 TL이 대동맥으로 토출으로 사라진다. 심낭 캐비티 충혈 것 같으면 바늘 좌심실의 대상이 꺼지고 TL 용액 심장 주변 심낭 캐비티를 채우는 것을 그러나, 이것은 나타낸다. 이것은 쉽게 배아 내에서 여전히 바늘로 일어나고있는 약간의 조정과 함께, 그것의 X 및 Y 평면에 주사 바늘의 위치를​​ 바꾸 수정할 수있는 일반적인 실수이다. 이 단계에서 배아에서 바늘을 추출하지 마십시오.

생체 내 미세 주입 제한에 초음파를 유도

본질적으로, 마이크로 인젝션 초음파 근본적인 기술적 한계의 수를 보유하고있다. 무엇보다도 미세 주사 바늘 볼륨용량은 마우스의 E17.5에 주사의 연령 범위를 제한합니다. TL 솔루션의 2.5 μl를 완전히 E15.5에 배아를 관류하는 우리의 연구에서 밝혀졌다. 그러나, 바로이 시점 다음, 혈액 부피비 TL은 소문자 효과적으로 주연 신장 내피 세포막에 태그하기 위해 희석된다. 따라서, 혈류의 감소 픽처 이후 시점 주사 존재한다. 또한, 태아의 뼈와 연골의 형성을 따라서 길게 주입 시간과 니들 머리에 자주 균열로 이어지는, 바늘 끝위한 자연 장벽을 만듭니다. 이러한 제한은 더 큰 바늘 강도 및 부피 용량으로 주사 신규 한 시스템을 이용하여 극복 될 수있다.

대안 배아 혈류 맵핑 기법

현재까지, 마우스 배아 매핑 혈류의 다른 방법은 수지의 구현 캐스트, 면역 조직 화학 염색 및 고 resolut 포함 이온 초음파 촬상. (고급 영상 기술의 통합) 수지 캐스팅은 가장 인기있는 대안으로, 이것은 아래에서 상세히 설명 될 것이다. 수지 캐스트는 출생 후 기관 내에서 흐름의 정확한 입체 표현의 창조를 위해 수 있습니다. 그러나 작은 성공으로 인해 해상도 다공성 혈액 혈관 및 제한 사항에 대한 이미지 태아 신장 조직으로했다되었습니다. 비교하여, 공액 TL 얼룩 정밀도 높은 수준에 이르는 막 항원 내피 결합을 가능하게한다. 다른 경우에는, 캐스팅 점도 조기 배율이 높을수록 임상 제한을 만드는 사구체 혈관과 작은 모세관 침대로 흘러 자릅니다. 낮은 배율에서,이 기술은 개발 도상국 관련 흐름 패턴을 설정 가능한에서 명확하다. 반대로, TL은 세포 수준에서 발달 구조 혈류 상대적인 고해상도 분석을 허용한다.

ENT "> 미래 응용 프로그램 및 방향

우리의 데이타는 혈류와 산소가 선조 네프론 분화에 관하여 중요한 요인이라는 것을 시사한다. 더 신장 개발에 자신의 역할을 규명하기 위해, 미래의 조사는이 생리 학적 과정을 침전 기본 해부학 적 메커니즘을 묘사뿐만 아니라뿐만 아니라 이러한 현상을 매개 전사 신호 전달 경로를 조사해야합니다. 현상기구 사이의 교량에 관해서 한가지 가설은, 평활근 세포 및 혈관 주위 세포 응집체 현상 장기의 줄기 세포 영역으로의 혈류를 일시적 절단 도출해 기여 역할을한다는 것이다. 이를 테스트하기 위해, 추가로 면역 염색과 분석은 신원 성 영역의 국경에서 이러한 세포 유형에 초점을 수행해야합니다. 신호 전달 경로를 기본의 미래 연구의 관점에서, 우리는 저산소증 유도 인자와의 역할을 탐구하고 싶습니다폰 Hippen 린다는 신호 전달 경로. 이 두 가지 모두 크게 각각 (산소의 가장 필요로하는 분야) 줄기 세포 (주로 저산소로 본) 지역과 차별화의 영역 내 저산소증과 산소 환경을 유지하는 중요한 유도 역할을 수행으로 문학 전반에 걸쳐 연루되어있다. 또한, 우리는 신장 혈관의 개발 과정에서 혈관 신생과 혈관 생성의 과정을 매개로 에리트로 포이 에틴 (EPO)의 역할을 심문하고 싶습니다. EPO는 내피 세포의 분화 및 유지 관리에 중요한 역할을한다 신장 당 단백질이다. 혈액 매개 내피 세포의 분화에서의 역할은 크게 알려져 있지 않다. 마지막으로, 우리는 또한 이러한 조사의 유효성을 강화하기 위해 혈관 확장 화합물과 생체 마이크로 인젝션 실험에서 수행하고자한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

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References

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