In Utero van intracardiale Tomaat-lectine Injecties op muis embryo's in te schatten nierdoorbloeding

1Rangos Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 2Division of Nephrology, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De vorming en perfusie van het ontwikkelen van renale bloedvaten (afgezien van glomeruli) zijn sterk weinig bestudeerd. Zoals vasculatuur ontwikkelt via angiogenese (het aftakken van grote bloedvaten) en vasculogenese (de novo bloedvatvorming), perfusie mapping technieken zoals hars worpen in vivo echografie en micro-dissectie zijn in het aantonen van de intieme relaties tussen beperkt deze twee processen en ontwikkeling renale structuren in het embryo. Hier beschrijven we de procedure in utero intra-cardiale ultrageluid geleide FITC-gelabelde tomatenlectine micro-injecties van muizenembryo's op de ontogenie van renale perfusie meten. Tomatenlectine (TL) geperfundeerd hele embryo en nieren geoogst. Weefsels werden co-gekleurd voor diverse nier structuren, waaronder: nefron voorouders, nefron structuren, ureteric epitheel, en vaatstelsel. Vanaf E13.5 groot kaliber schepen werden perfusie echter perifereschepen bleef unperfused. Door E15.5 en E17.5, kleine perifere vaten alsmede glomeruli begon te worden doorbloed. Deze experimentele techniek is essentieel voor het bestuderen van de rol van de vasculatuur en de bloedstroom tijdens de embryonale ontwikkeling.

Introduction

Tijdens de embryonale ontwikkeling twee afzonderlijke, maar tegelijkertijd, vasculaire processen plaats: angiogenese, het proces waarbij een vat groeit uit een grote bestaande vat en vasculogenese, een de novo vorming van vaten uit residentiële endotheliale voorlopercellen 1,2. Respectievelijk de vroegere synoniem bloedstroom, terwijl de laatste wordt gedacht grotendeels plaatsvinden in de afwezigheid ervan.

Gelijktijdig met de vorming van bloedvaten, begint een cyclisch en dynamisch proces nier voorlopercellen synthese, proliferatie en differentiatie te ontvouwen op embryonale dag 9,5 (E9.5). Op dit punt de ureterknop (UB) binnendringt dorsaal in omliggende metanefrische mesenchym (MM), en gaat door tot aan de geboorte 3. Herhaalde vertakking van de UB in snel condenseren metanefros kap mesenchym begint de vorming van de functionele eenheden van de nier, het nefron. Bij elke nieuwe generatie van de UB en Nephron, zijn oudere generaties verplaatst naar innerlijke corticale en medullaire regio's, waar ze vervolgens ondergaan verdere rijping en differentiatie binnen voornamelijk vasculaire-dichte omgevingen. Zoals blijkt uit Dressler et al. 3 wordt dit embryologische proces neergeslagen door inductieve signalering, zoals overspraak tussen UB en MM en een groot aantal extracellulaire factoren 3-6. Twee recent onderzocht extracellulaire factoren binnen de zich ontwikkelende alvleesklier en nieren bevatten zuurstofspanning en de bloedstroom 7,8. Dit laatste zal nader worden besproken hieronder opzichte nierontwikkeling.

Om de inductieve rol die bloedstroom mogelijk speelt in nefron voorlopercellen differentiatie, en in andere processen organogenese, precieze en accurate werkwijzen embryonale bloedstroom mapping bloot is noodzakelijk.

Alternatieve methoden voor het meten van de bloedstroom omvatten het voorschrijven van ultrasound beeldvorming en hars werpt 9,10. Overtuigend, zijn deze modi is aangetoond dat inherent ontbreken in hun vermogen om gelijktijdig te onthullen temporele en ruimtelijke tegenstellingen tussen de bloedstroom en stamcel differentiatie. Hars afgietsels, bijvoorbeeld een geldig model van het schip patroonvorming binnen volwassen weefsels, maar in onvolwassen schepen, zoals met embryonale tijdstippen, schepen zijn schromelijk onderontwikkeld en lekkende. Daarom hars werpt niet aan te houden binnen de kleine, vaak poreus, schepen.

Voor deze schijnbare hindernissen, onder anderen, hebben we gekozen om echogeleide in vivo intra-cardiale embryonale tomatenlectine (TL) micro-injecties in ons onderzoek van de ontwikkeling van de nieren te nemen. In deze procedure maken we gebruik van een ultrasone sonde om synchroon te begeleiden een gemonteerde micropipet naald gevuld met 2,5 ul van TL-oplossing in de linker ventrikel van de muis embryo's in E11.5, E13.5, E15.5 en E17.5 tijdstippen. E170,5 is de nieuwste ontwikkelingsleeftijd als de naalden zijn niet sterk genoeg om de meer ontwikkelde embryo doordringen.

De voordelen van deze micro-injectie werkwijze zijn overvloedig. Ultrageluid geleide microinjectie nauwkeurige plaatsing van een injectienaald in het embryonale linker ventrikel, passieve en gecontroleerde verwijdering van oplossing in het kloppende hart van het dier, minimale schade aan hart en omliggende weefsels, en het voorkomen van plotselinge hartfalen en dood van de embryo voorafgaand aan full-body perfusie. Bij het gebruik van een FITC-gelabelde TL zullen eventuele geperfundeerd vaatstelsel de marker langs de endotheliale apicale membraan behouden. In combinatie met immunohistochemie, gebruik PECAM (CD31, bloedplaatjes endotheelcel adhesie molecuul) en diverse andere vasculaire markers, kunnen we duidelijk onderscheid tussen geperfundeerde en niet-geperfundeerde schepen, alsmede karakteriseren elke afwijkende kleuring van omringende weefsels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en gebruik Comite alle experimenten.

1. Voorbereiding van Ultrasound-micro-injectie Instrumenten en embryo's

  1. Het opzetten van het podium, mount, en sonde (figuur 1), evenals chirurgische instrumenten (figuur 2). Plaats fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (pH 7,4) in een 37 ° C verwarmen bad. Vul micro-injectie naald volledig met minerale olie, met behulp van 1 ml spuit bevestigd aan een tweede flexibele 25 G naald, door middel van zijn basis.
  2. Fix naald op rotatie mount arm, en de lege naald van minerale olie oplossing. Opnieuw vullen met 2,5 ul van TL-oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen de injectienaald zijn. Draai de naald arm uit naar de muur, uit de buurt van het podium.
  3. Verdoven van de zwangere moeder in de anesthesie kamer via continue infusie van isofluraan. Als moeder bewusteloos wordt gemaakt, de overdracht van de anesthesie aan neus buis geplaatst op de caudal kant van het podium, en plaats moeder in rugligging met de snuit in de neus buis tot een voortzetting van een volledig verdoofd staat mogelijk te maken.
  4. Tape ledematen in hoeken van 45 °, of met handen en voeten rustten en gepositioneerd overtop ECG tabs / Temperature monitor. Het is belangrijk dat de zwangere dam voortdurend bewaakt dat anesthesie garanderen waarbij en zalf toegepast om de ogen te drogen verminderen.
  5. Solliciteer ontharing product tegenover onderbuik van de moeder, veeg af met droge wattenstaafjes, en dan weer met een 70% ethanol verzadigd wattenstaafjes om overtollig product en haar te verwijderen. Zorgen om buikhuid schoon uit van al het haar op de site van de incisie (figuur 3).
  6. Voer een laparotomie op de zwangere moeder met behulp van fijne chirurgische pincet en schaar. Let er op dat elke grote vaten of viscerale organen snijden. Maak eerst, rechte snede van epidermis 1,5-2 cm boven de vagina en doorgaan snijden richting ribben voor approximately 2-3 cm. Expose de onderhuidse membraan, zoek de linea alba ("witte lijn") (figuur 3), en die, evenwijdig aan de eerste incisie, langs dezelfde lengte, bloot te leggen interne viscerale organen en baarmoeder saccules.

2. Winning van embryo's

  1. Gebruik 6-inch wattenstaafje applicators aan moeder en embryo's manoeuvreren. Duw voorzichtig (niet forceren) op de huid met applicator naar eerste embryo manipuleren van incisie opening. Na extractie van de eerste embryo saccule, voorzichtig en langzaam trekt de rest van de baarmoedertak door en op de buitenkant van de moeder. Vermijd trekken darm of andere organen bij incisie in dit stadium.
  2. Kwantificeren embryo's en zachtjes plaats gelaten baarmoedertak terug naar moeder. Dan begint het plaatsen van de juiste baarmoedertak terug in moeder te beginnen met het embryo saccule verst van de vagina op de hoorn en gaat naar beneden. Ga door met dit totdat er slechts twee embryo's blijven blootgesteld (Figuur 4). Tenslotte positie embryo's in een kolom boven en parallel aan incisie lijn, die bewust niet af te snijden baarmoeder circulatie.
  3. Plaats bouwblokken en positie tussen de armen en het lichaam, evenals poten en staart. Zorg ervoor dat de klei oppervlakken zijn ongeveer op het niveau laparotomie incisie. Bevochtig de gefenestreerd petrischaal met 37 ° C PBS.
  4. Pak uitstrekkende forceps met de rechter hand en gefenestreerde petrischaal met linkse (fenestratie parallel embryo's) en breng gesloten forceps ~ 5 cm tot raamopeningen, vanaf de top van de petrischaal. Open tang volledig zonder scheuren fenestration mesh.
  5. Manoeuvreren handen boven embryo's en zicht richten op de twee embryo saccules. Zonder (of licht) te raken saccules met fenestratie rasterwerk of tang, schuif ze door middel van split en ingesteld petrischaal op de buik van de moeder. Met forceps verruimd, manipuleren gefenestreerde mesh goed vast aan weerszijden en op basis van elk embryo (figuur 5
  6. Vervolgens plaatst blauwe rubberen bevatten muur in petrischaal, zonder te knellen of verwonden van embryo's (Figuur 6). Zorg ervoor klei blokken zijn stevig balanceren petrischaal, embryo, en rubber bevattende muur. Ten slotte vult petrischaal met 37 ° C PBS tot embryo's volledig ondergedompeld worden (Figuur 6), terwijl de controle op lekkage bij gefenestreerde meshing.

3. Injectie Procedure

  1. Lagere injectie podium met moeder en embryo's vastgesteld met behulp van Z-niveau regelknop (figuur 1) en draai injectienaald en mount arm en line-up direct met ultrasone sonde, met naald ½ cm naar links en onder de sonde (figuur 7) . Duw de naald-arm (geen naald) 45 ° weg van de sonde. Wees voorzichtig de punt van de naald met de schaal of ultrasone sonde niet te raken.
  2. Raise injectie podium terug naar oorspronkelijke hoogte, met echografie pgewaad direct boven embryo Probe moet iets worden ondergedompeld en binnen 3-4 mm van het embryonaal weefsel. Gebruik X & Y stadium aanpassingsknoppen (Figuur 8) naar embryo / moeder / stage positie om systematisch te lokaliseren het kloppend embryonale hart te wijzigen.
  3. Direct Centrum van ultrageluid scherm te observeren een zwarte centrum doelgroep marker getekend (*). Lokaliseren linker ventrikel (bij voorkeur) of een atrium met behulp van de X & Y stadium aanpassingsknoppen (figuur 8) en dan verhogen of verlagen het podium met behulp van draaiende knop op het podium aan de injectie doelgroep nauwkeurig positioneren over de zwarte centrale markering op de echo scherm.
  4. Gebruik X podium aanpassing knop om embryo naar rechts te verplaatsen, weg van de echo scherm. Verplaats micro-injectie naald en de arm op zijn plaats, ½ cm vanaf en 90 ° ultrasone sonde (figuur 7).
  5. Met behulp van micro-injectie monteren aanpassingsknoppen (Figuur 9C-G), positie naald met de punt duidelijk alIGNed met het centrum marker. Pas injectiehoek (met knoppen in figuur 9C en EG), en X, Y en Z vectoren micronaald te zorgen naaldpunt gericht op de juiste vlak. Intrekken micro-injectie naald met behulp van uitsluitend de "injectie" knop (Figuur 9F), voorzichtig niet naar andere dimensies te passen.
  6. Nogmaals, het gebruik van uitsluitend de X fijnafstelling stadium knop zet embryo terug onder de sonde, met doel precies op het midden markering op de echo scherm. Controleer of de linker ventrikel nu precies op dezelfde X, Y en Z vlak.
  7. Vervolgens, met alleen de "injectie" knop op de micro-injectie monteren, langzaam doorboren embryo met de micro-injectie naald en breng voorzichtig tip in de linker hartkamer. Injecteer de volledige 2,5 ul van TL-oplossing in een linker ventrikel of totdat de lege waarschuwingssignaal klinkt, door te oordelen "leeg" en tikken "vullen" eenmaal (Figuren 2A & B). Op dit momentinjectie observeren een schaduw afkomstig van de punt van de naald die het VL aangaan van de hartkamer (figuur 10). In omgekeerde, snel intrekken micro-injectie naald draaien van de "injectie" knop (Figuur 9F) op de micro-injectie monteren wanneer de injectie is voltooid.
  8. Ga verder met de volgende embryo en herhaal deze procedure voor de resterende embryo's na deze reeks van stappen en plaats ze ten slotte de laatste embryo's terug in de buik van de dam. Schakel anesthesie aan kamer doos en beweeg zachtjes moeder hier voor 15 min van de tijd van de laatste injectie.

4. Oogsten Embryo's en Analyse

  1. Offeren dam via cervicale dislocatie. Vouw de laparotomie incisie om gemakkelijk baarmoederhoorns verwijderen van de moeder. Houd de embryo's in de baarmoeder weg. Plaats embryo's in gekoelde PBS.
  2. Ontleden embryo uit de baarmoeder sac (indien nodig collect weefsel voor genotypering) en plaats het geheel embryo in 4% Paraformaldehyde (PFA) 's nachts, dan in 30% sucrose overnacht, bevriezen in cryostaat snijden medium. Snijd vervolgens de cryosectie en plaats deze op dia's voor immunohistochemische analyse. Optioneel te gebruiken weefsels voor hele-mount door het ontwateren in 100% methanol, na fixatie in 4% PFA.
  3. Voor immunohistochemische analyse plaats de cryosecties in PBS om de LGO te verwijderen. Blokkeren dan de secties met 10% normaal ezel serum gedurende 30 minuten. Voeg dan PECAM primair antilichaam bij 1: 100 verdunning overnacht bij 4 ° C. De volgende dag was de objectglaasjes in PBT 3 keer gedurende 10 min elk en voeg ezel anti rat 594 secundaire en incubeer gedurende 1 uur bij KT.
    LET OP: Dit is een zeer veeleisende techniek waarbij de optimalisatie en coördinatie van de echografie en micro-injectie. Er is een zeer steile leercurve voor deze techniek en vereist 4-6 weken begeleid injecties voordat men wordt bedreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vasculaire vorming vooraf stroming in ontwikkeling nier

Een meerderheid van embryonaal weefsel (zoals de nier) een dichte vasculatuur (zowel unperfused en geperfuseerd), zelfs in vroege embryonale tijdstippen. Om beter in te schatten en te analyseren bloedstroom binnen de zich ontwikkelende nier we gebruik gemaakt van een methode in de baarmoeder embryonale intracardiale micro-injecties. Met gebruik van een hoge-resolutie echo om het embryonale hart identificeren E11.5 door E17.5 en na de extractie en blootstelling van een baarmoeder saccule via een laparotomie, konden we 2,5 gl TL injecteren (fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd).

Wij hebben het grootste succes injecteren E13.5 en E15.5 embryonale tijdstippen, met een slagingspercentage van ongeveer ~ 80% gevonden tot 90%, respectievelijk. Door de aanwezigheid van een betrekkelijk onvolwassen hart op E11.5 en een bestaan ​​van dichte kraakbeen- en botvorming op E17.5, de perifere time punten zijn relatief moeilijk te injecteren, met een aanzienlijk lagere kans op succes in vergelijking met de middelste embryonale tijdstippen. Men kan verwachten dat ten minste ~ 50% en ~ 30% slagingspercentages met E11.5 en E17.5 tijdstippen, respectievelijk.

Door co-labeling weefsel met PECAM (CD31), een universele endotheliale marker, zijn we in staat om fluorescerende vaten en weefsels in drie groepen kwalitatief categoriseren: doorbloed vaatstelsel (PECAM positieve & TL positief), unperfused vaatstelsel (PECAM positief), en afwijkend geperfundeerde structuren (TL positief). Deze bijzondere kleurpatroon kunnen wij ruimtelijk onderscheiden gebieden van perfusie en niet-perfusie (figuur 11).

Bij E11.5, ontdekten we dat geperfundeerde schepen kapselen de ontwikkelende nier in een web-achtig patroon zonder daadwerkelijk te dringen in het orgel (Figuur 12B). Bij E13.5 waren grote bloedvaten geperfuseerd met enkele kleinereaccessoire schepen kleuring met TL (Figuur 12C). Kleuring kan ook worden gezien tijdens sommige ureteric epitheel, kan deze ofwel uit glomeruli die reeds geperfuseerd of vanwege de inherente leakiness vroege embryonale schepen. Bij E15.5 grote bloedvaten werden geperfuseerd, zou echter een groot aantal glomeruli ook worden waargenomen die de TL vlek, suggereert dat significante filtering plaatsvindt (figuur 12D). Ook op dit tijdstip een aantal kleinere kaliber schepen zichtbaar geperfuseerd, hoewel een aanzienlijk deel van de buitenste nefrogene zone verschijnt zonder bloedstroom zijn. Tenslotte echter bij E17.5 meerderheid van de nier geperfundeerd behalve vasculatuur van de nefrogene zone, die voornamelijk zonder perfusie (maar dicht in pecam positieve vaten) hetgeen wijst op een afwezigheid van angiogenese in perifere gebieden. Kleiner kaliber schepen bevatten TL en het gemiddelde aantal doorbloed glomeruli dramatisch in heeftgevouwen in vergelijking met eerdere tijdstippen (figuur 12E).

Figuur 1
Figuur 1. Ultrasound probe, chirurgische fase, micro-injectie systeem, railsysteem, en ECG / Temperatuur-basis set-up.

Figuur 2
Figuur 2. Noodzakelijke chirurgische uitrusting, oplossingen en apparatuur. (A) wattenstaafje applicators. (B) Uitbreiding (Ring) tang. (C) chirurgische schaar. (D) Blunt-getipt tang. (E) fijne pincet. (F) Micro-injectie Naald (Origio, # C060609). (H) Injectie / Fill controller. (I) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). (J) Mineral Oil (Sigma Aldrich).

Figuur 3
Figuur 3. Een 2-cm laparotomie wordt uitgevoerd op verdoofde moeder, het blootstellen van de onderhuidse laag (buikwand) boven de baarmoeder. Gebruik makend van de chirurgische schaar en fijne tang, de linea alba bloot en maken incisie parallel aan epidermale cut. Klik hier om te bekijk een grotere versie van de figuur.

Figuur 4
Figuur 4. 1-2 E15.5 baarmoeder saccules gewonnen door laparotomie incisie en blootgesteld. Klik hier voor een grotere weergaveversie van de figuur.

Figuur 5
Figuur 5. Exposed baarmoeder saccules geleid door spleet in gefenestreerde petrischaal met behulp van de uitbreiding van een tang. Fenestrated meshing zetels behaaglijk aan de basis van de saccules.

Figuur 6
Figuur 6. Blue bevattende wand geplaatst rechts van baarmoeder saccules. Petrischaal gevuld met 37 ° C PBS tot embryo's en bevattende wand volledig ondergedompeld. Klei blokken stevig onder Petri-schaal / embryo tussen armen en lichaam en de poten en staart geplaatst.

Figuur 7
Figuur 7. Injection systeem positio ned ½ cm naar links en onder, en 90 ° ultrasone sonde.

Figuur 8
Figuur 8. Stage X en Y aanpassingsmechanismen.

Figuur 9
Figuur 9. Lege / Fill-apparaat, micro-injectie-systeem, en het podium mount. (A) Fill-knop. (B) Injecteer knop. (C) Rondbreinaald stelknop. (E) Fijn X regelknop. (F) "Injectie" knop. (G) Cursus X regelknop. (H) Stage revolving hoogte-instelknop.

98fig10.jpg "/>
Echografie beeld van E15.5 intra-cardiale TL micro-injectie. Naaldtip figuur 10. Is gepositioneerd binnen hartkamer, wordt TL oplossing aangegeven met zwarte schaduw binnen twee kamers. Hartzakje en pericardholte zijn gemakkelijk te onderscheiden.

Figuur 11
Figuur 11. Gebieden tussen perfusie, unperfusion, en afwijkende kleuring onderscheiden. Het eerste paneel toont de PECAM vlek. Het middelste paneel toont de TL vlek op precies hetzelfde gebied van weefsel. Ureterknop is afwijkend in lood; grote schepen worden ingekapseld door witte stippellijnen. Het laatste paneel is de samenvoeging. Witte pijlen geven lekkage vat en grijze pijlen tonen een overgang naar een schip raken doorbloed. Gele structuren vertegenwoordigen volledig doorbloed vaatstelsel.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 12
Afbeelding 12. Embryo en nieren perfusie ontogenie onderzocht. (A) Gehele E11.5 embryo geperfundeerd met het perifere vaten binnen kop- en staartgebieden die de TL. (B) geperfuseerde vaten waargenomen rondom maar niet in de ontwikkelende nier op E11.5 in een web-achtig patroon opgenomen, is er ook heel veel diffuse kleuring op dit punt. (C) E13.5 nier toont grote, groot kaliber schepen worden doorbloed hele nier (witte en gele pijl), met perfusie afwezig binnen nefrogene zone (witte stippellijn). (D) E15.5 nier toont perfusie in heel klein kaliber, perifere vaten (gele pijlen),in sommige glomeruli (witte pijlen), en opnieuw een afwezigheid van perfusie bij perifere nieren schoorsteenmantel. (E) E17.5 nier toont enorme perfusie hele glomeruli (witte pijlen) en klein kaliber schepen (gele pijlen). De nefrogene zone is niet te onderscheiden van de rest van de nier bij deze vergroting. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Micro-injectie anesthesie en tijdsbestek

Wat betreft verdoving van de moeder, is het essentieel om een ​​constante luchtstroom (2-3 l / min) en bij lage PSI te houden. De stroom van de sedatieve moet worden gehouden op ongeveer 1,75-2 l / min. Tegelijkertijd moeten termijnen waarin de injecties plaatsvinden nauwlettend worden gevolgd en gecontroleerd voor met elk nest. Voor elk nest de injectie procedure van 45 minuten moeten worden gehouden. Het belang van deze termijn is van cruciaal belang voor het experiment, zoals elk embryo binnen een constante, normale hartslag bereik moet worden gehandhaafd om de gecontroleerde en onveranderlijke perfusie door het hele lichaam en orgel van belang te vergemakkelijken. We hebben gevonden dat verlenging injecties resultaten twijfelachtige resultaten en fluctuaties in perfusie patronen tussen embryo en verlaagt tarieven succesvolle injecties (bijv trage hartslag, cardiale dood). Tenslotte, na de laatste injectie in het nest, is het essentieelongeveer 15 minuten gewacht voordat embryo geoogste goed, volledige perfusie binnen elk embryo vergemakkelijken.

Procedurele behandeling en verzorging van embryo's

Tijdens de extractie van het embryo hebben we meer succespercentages met injecties die zijn bereikt door continu aanwezig om de algehele gezondheid en de integriteit van het baarmoederslijmvlies en embryo tijdens de embryo extractie gevonden. Met behulp van de delicate wattenstaafje applicators (verzadigd met PBS) te manipuleren en te manoeuvreren de baarmoeder sac en saccules zijn noodzakelijk voor het voortbestaan ​​van de moeder en embryo's te garanderen tijdens de gehele procedure. Ten eerste is het belangrijk dat de fysieke integriteit van de baarmoeder en placenta goed onderhouden. Vermijd contorting de saccules op een manier die de bloedtoevoer naar de embryo's zal belemmeren of leiden tot significante breuk in de bloedvaten die de bloedtoevoer naar de placenta te leveren. Dit kan worden bereikt door het extraheren van een maximum 1-2 embryo tegelijk (tenzij extraheren van de gehele baarmoeder sac voor uitgangswaarde) en het positioneren applicators verwijderd van grote bloedvaten aan de basis van de placenta.

Locatie van het embryonale Injectie Site

Het begeleiden van de micro-injectie naald op de juiste plaats met de echo machine is ook van cruciaal belang voor elke injectie poging. Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan het opzoeken en centrering van de linker ventrikel van het centrale markering. Na deze, moet de naald worden geplaatst en gecentreerd precies op het midden marker alsook om de naald en injectieplaats op dezelfde X- en Y-plannen af ​​te stemmen. Zodra dit is voltooid, langzaam trek de naald dichter bij de injectieplaats en overmatige spanning op de hartzak en het hart. Dit gebeurt doordat de naald langzaam passeren weefsellagen, in plaats van de doorgang van de naald te dwingen door hen. Tijdens de injectie is het ook belangrijk lalso uit voor een zwarte schaduw afkomstig van de naald (figuur 10). Dit wijst op de TL oplossing vult de ventrikel. Als de naaldpunt in de juiste positie moet de schaduw continu verschijnen en verdwijnen TL wordt uitgestoten in de aorta. Echter, als de pericardholte lijkt te snel te vullen, is dit een indicatie dat de naald niet tussen de palen van de linker hartkamer en de TL-oplossing is het vullen van de pericardiale holte rondom het hart. Dit is een veel voorkomende fout die gemakkelijk wordt gecorrigeerd door de herpositionering van de injectienaald op de X en Y-vlak, met enige kleine aanpassingen die plaatsvinden met de naald nog steeds binnen het embryo. Vermijd extraheren van de naald uit het embryo in dit stadium.

Echogeleide in vivo micro-injectie beperkingen

Inherent, de echografie micro-injectie bezit een aantal fundamentele technische beperkingen. Eerst en vooral, de micro-injectie naald volumecapaciteit beperkt de leeftijd van injecties om E17.5 in de muis. 2.5 gl TL oplossing is in onze studies blijkt volledig perfuseren embryo tot E15.5. Echter, net na dit tijdstip, de TL aan bloedvolume verhouding wordt om minuscule en verdund om effectief te taggen perifere renale endotheel membranen. Dus een verminderde beeld bloedstroom aanwezig op later tijdstip injecties. Daarnaast is de vorming van bot en kraakbeen in het embryo ontstaat een natuurlijke barrière voor de naald, hetgeen leidt tot verlengd inspuittijden en frequent scheuren in de spuitkop. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door gebruik te maken van een nieuwe injectie systeem met een grotere naald kracht en volume capaciteiten.

Alternatieve embryonale bloedstroom mapping technieken

Tot op heden, alternatieve methoden voor het in kaart brengen van embryonale muis bloedstroom onder meer de uitvoering van hars afgietsels, immunohistochemie vlekken en hoge Resolut ion echografie. Zoals hars afgietsels (met integratie van geavanceerde beeldvorming) zijn de meest populaire alternatief zal dit nader worden besproken. Hars afgietsels zorgen voor de creatie van een nauwkeurige driedimensionale representaties van de stroming binnen postnatale organen. Er is echter weinig succes geweest had met beeldvorming prenatale nierweefsel te wijten aan poreuze bloed vaatstelsel en beperkingen in de resolutie. In vergelijking, geconjugeerd TL vlekken staat binding aan membraan antigenen leidt tot een grotere nauwkeurigheid endotheel. In andere gevallen, hars gegoten viscositeit kapt voortijdig stromen in glomeruli schepen en kleine capillaire bedden, het creëren van onderzoek beperking bij hogere vergrotingen. Bij lagere vergrotingen, deze techniek is duidelijk levensvatbaar op de totstandbrenging van stromingspatronen in relatie tot de ontwikkeling van de regio's. Omgekeerd TL maakt hoge-resolutie analyse van de bloedstroom ten opzichte ontwikkelingsstoornissen structuren op celniveau.

ent "> Future toepassing en richtingen

Onze gegevens suggereren dat de doorbloeding en de zuurstofvoorziening zijn kritische factoren met betrekking tot de voorlopercellen differentiatie nefron. Om verder te ontrafelen hun rol in de renale ontwikkeling, moeten toekomstige onderzoeken onderliggende anatomische mechanismen neerslaan dit fysiologisch proces af te bakenen, alsmede onderzoeken transcriptie signaalwegen dat dit fenomeen bemiddelen ook. Een hypothese, met betrekking tot het overbruggen van de kloof tussen fenomeen en het mechanisme, is dat gladde spiercellen en pericyte aggregaten spelen bijdragende rol in het orkestreren van de voorbijgaande inkorting van de bloedstroom naar stamcellen regio's van de ontwikkeling van organen. Om dit te testen, moet verder immunofluorescentiekleuring en analyse worden uitgevoerd met een focus op deze celtypen op de nefrogene zone grens. In termen van toekomstige onderzoeken van de onderliggende signaalwegen, willen we de rol van hypoxie induceerbare factoren en het verkennenVon Hippen Lindau signaalwegen. Beide zijn grotendeels betrokken hele literatuur als het spelen van belangrijke inductieve rol in het handhaven van zuurstofarme en zuurstofrijke omgevingen binnen stamcel regio's (grotendeels gezien hypoxie te zijn) en de gebieden van differentiatie (gebieden in de grootste behoefte van zuurstof), respectievelijk. Verder willen we de rol van erytropoëtine (EPO) ondervragen in het bemiddelen van de processen van angiogenese en vasculogenese hele nier vasculaire ontwikkeling. EPO is een renale glycoproteïne dat cruciale rol in endotheliale differentiatie en onderhoud speelt. Zijn rol in het bloed gemedieerde endotheliale differentiatie is grotendeels onbekend. Tot slot willen we voeren in vivo micro-injectie experimenten met vaatverwijding verbindingen naar verdere versterking van de geldigheid van deze onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5,000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
1 ml syringe Fisher Scientific 03-377-20
Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8, (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136, (23), 3863-3874 (2009).
  4. Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (5), 693-713 (2012).
  5. Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18, (5), 698-712 (2010).
  6. Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15, (9), 1035-1044 (2013).
  7. Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. (2014).
  8. Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349, (2), 342-349 (2011).
  9. Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120, (4), 511-516 (2003).
  10. Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17, (2), 215-219 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics