卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

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Abstract

Introduction

卵巣癌は、罹患率および死亡率の主な原因は、この疾患の高度に再発性、化学療法抵抗性の特徴であると、米国で最も致死的な婦人科悪性腫瘍である。ネオアジュバント療法は、いくつかのケース1に有益であるかもしれないことを示唆するいくつかの証拠があるが、一次治療は、通常、最大の腫瘍縮小手術とその後の白金系療法を含む。大多数の患者は、一次治療に良好に反応するが、残念ながら半分は18ヶ月2以内に再発します。

ほとんどの卵巣の悪性腫瘍は、上皮癌であると卵巣や卵管3,4の表面上皮に由来することがあります。いくつかの研究は、おそらく排卵5,6以下に必要とされる組織の修復を支援する女性生殖器系における体性幹細胞の存在をサポートしています。 ovul中の卵巣と卵管の両方で高い増殖活性ationが卵巣癌の開発における重要な要因であるかもしれません(Gharwan 提出された原稿)。腫瘍形成細胞の誘導は不明であるが、それらは分裂または運命を調節することができ、それらをレンダリングする突然変異を通して正常な幹細胞、前駆細胞、または分化細胞から生じ得る。これらの細胞はまた、「癌開始細胞」、「癌幹細胞」、またはと呼ばれており、低接着条件下での腫瘍形成、多細胞スフェロイドへと成長することができる。 TIC開発の階層モデルは、動的であってもよいが、のTICは、静止、化学療法に対する耐性、長期自己再生および様々な細胞系統7,8に分化する能力を含め正常な幹細胞と同じ特徴の多くを共有しない。

いくつかの研究は、卵巣癌でのTICの存在を支持し、現在の努力は、これらの細胞が腫瘍形成9-11をサポートする機構(単数または複数)を明確にするために進行中である。各マーカーの正確な寄与は不明であり、11〜16の特定の細胞型であってもよいが、いくつかのマーカーは、CD133、ALDH1A1、CD117、CD44、およびMyD88を含む強化された腫瘍形成性卵巣のTICを識別するために提案されている。ユニバーサルマーカーまたはマーカーセットが明確に卵巣のTICのために確立されていないが、別のグループは、高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)活性13,17-21でCD44 +、のためにCD133 +および/ ​​または細胞を選択することによって、より一般的に卵巣のTICを単離した。 CD44は、ヒアルロン酸の受容体として作用し、接着、増殖、遊走、血管新生および分化22を含む、腫瘍の進行に重要ないくつかのプロセスを調節する膜貫通糖タンパク質である。 CD133は、その機能はまだ不明であるが、研究では、それは形質膜トポロジー23を編成を示唆している膜貫通糖タンパク質である。 ALDH、アルデヒドの酸化を触媒する細胞内酵素は、ほとんどのユニバースとすることができる高活性としてのTICの他のマーカーは、正常な幹細胞とのTIC 24をサポートするALDHに起因している組織および複数の役割の多様から単離された幹細胞で同定されている。今のところ、CD133とALDH1は、卵巣のTIC 13,21の最も再現性のマーカーであると思われる。

のTICの特性を理解することに加えて、特にこの亜集団を標的とする薬剤を同定するために大きな努力もある。卵巣癌に伴う高い再発率は正常に目盛りを根絶するための現行の化学療法の失敗に起因する可能性がある。腫瘍の大部分は、既存の治療に感受性であるが、のTICは、抵抗性の標準的な方法により検出できない濃度であると考えられる。治療抵抗性及び腫瘍再発のメカニズムの解明は、応答および卵巣癌患者の全生存率を改善することが不可欠である。

ここで、培養技術は、目に記載されている確立からのTICおよび原発性卵巣癌細胞株についてエンリッチた。本明細書に記載の培養条件は、幹細胞の性質11,12,14,16,20でのTICまたはスフェロイド細胞の増殖を誘導するために、いくつかのグループによって使用されてきた。一般のTIC /スフェロイドを濃縮するために使用されるいくつかの幹細胞培養のマスコミとサプリメントがあるが、我々はEGFとFGFとの無血清培地式を用いたが、B27またはN-2補充物を添加しない。これらのサプリメントは、一般に幹細胞の神経細胞培養および富化のために使用間葉表現型25,26を促進すること示されており、フィールドのいくつかの不確実性は、間葉または上皮表現型を有するのTICは27-29、より腫瘍形成性であるか否かが依然として存在する。不確実性と変数を最小限に抑えるために、我々は、上皮性卵巣癌細胞を扱っているため、最も一般的な計算式を使用することにしました。

低付着フラスコ中の無血清培地中で細胞を維持する回転楕円体の形成を促進し、CD133の発現と高いALDH活性を有する細胞の増殖をサポートしています。私たちの仕事は、さらに通常の接着性の条件下では、浮遊細胞はまた、より多くの腫瘍形成TIC集団を表現できることを示したている。無胸腺ヌードマウスにこれらの条件下で増殖した細胞の注入は、血清の存在下で結合条件で培養した細胞と比較して、より高い腫瘍形成能をもたらす。卵巣癌の開始、進行、治療応答、及び疾患再発中のTICの役割に関する多くの情報は、これらの技術を用いて得ることができる。

Protocol

卵巣癌細胞株の1伝統文化(接着条件)

注:細胞および培地の全ての処理は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである

  1. 従来の細胞培養培地を準備します。 1 DMEM:1使用F12(+ L-グルタミン+ 15mMのHEPES)を、10%熱不活化ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補足する。 0.45μmの真空フィルターを使用してフィルタソリューション。
  2. 名前、日付、およびinterest.Removeの細胞株超低冷凍庫または液体窒素からの細胞のバイアルの継代数で標識された伝統的なポリスチレン75センチメートル2組織培養フラスコを準備します。 5分間37℃の水浴中に置くことによって、除霜。
  3. 3ミリリットルの伝統的な細胞培養培地(上記で調製)を含む15ml遠心管にバイアルから転送サスペンション。 400×gで5分間4℃で遠心サスペンション。一方、フラスコに16ミリリットルの伝統的な細胞培養培地を加える。
  4. 上清を吸引。フラスコにペレットと転写懸濁液を緩め上下2ミリリットル、伝統的な細胞培養培地をピペット細胞を使用して。穏やかにロックフラスコに均等に37℃、5%CO 2に設定した加湿細胞培養インキュベーター中cells.Placeフラスコを配布する。 80%のコンフルエンスに達するまで、毎日の細胞を監視します。
  5. 2細胞培養フード内:細胞は一旦80%コンフルエント培養物1を分割する。上清を吸引し(カルシウムおよびマグネシウムを含まない)、温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。 1.5ミリリットルトリプシン0.25%-EDTAを追加し、室温で3〜5分間インキュベートする。
  6. 2新しいポリスチレン75センチメートル2フラスコを準備し、各フラスコに16ミリリットルの伝統的な細胞培養培地を追加。新しいフラスコのそれぞれに4ミリリットル従来の細胞培養培地と等量のアリコートでトリプシン処理した細胞を再懸濁する。
  7. 加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5%CO 2に設定する。 80%のコンフルエンスに達するまで、毎日の細胞を監視します。細胞を分割し続け、-80または液体窒素中で文化や凍結して保存。

フローティングまたは接着細胞を用いた卵巣癌細胞株から多細胞スフェロイドの2世代

注:細胞および培地の全ての処理は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである。 2のための伝統的な培養法の下で細胞株を培養した後 - 3継代(セクション1)は、次の手順に進みます。

  1. 幹細胞のメディアを準備します。 1 DMEM:F12(+ L-グルタミン+ 15mMのHEPES)と、1%のノックアウト血清代替物(100 U / mlの最終濃度のペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補足1を使用0.4%ウシ血清アルブミン、および0.1%のインスリン - トランスフェリン - セレニウム。 0.45μmの真空フィルターを使用してフィルタソリューション。
  2. 20ng / mlのと10のn最終濃度のヒト組換え上皮成長因子(EGF)およびヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)と補足幹細胞培地G / mlで、それぞれ。
    NOTE:成長因子は、使用直前に、幹細胞培地を新鮮な添加すべきである。
  3. フローターTIC文化を作成します。伝統的な接着性の培養条件で成長させた80%のコンフルエント細胞のフラスコを削除します。背後に付着した人口を残して、メディア、すべての浮遊細胞(単一および凝集)を収集し、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管に移す。 400×gで5分間4℃で遠心サスペンション。
    注:浮遊細胞および凝集体は明らかである24から72時間後に付着細胞が伝統文化の下でフラスコに取り付けされた後。約1.0〜80%コンフルエントのプレートから検索- 5.0×10 5生存浮遊細胞は、細胞株に依存して、期待することができる。 TGS-ための5×10 5.0 5 ACI-23のために、4.8×10 5 OVCAR5ために、3.5×10 5 CAOV3ための、および1.0×10:この研究では、80%のコンフルエント接着培養から収集した浮遊細胞の平均数であった3。転送の際に、マルチセル伝統的でウラルスフェロイド形成とTIC文化をフローター、これはやや依存性細胞株であるが、数日以内に発生します。例えば、ACI-23細胞は、より容易にCAOV3細胞よりも凝集体を形成する。
  4. 一方、名前、日付、および細胞株の継代数で標識された超低取付面ポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコを調製する。フラスコに成長因子を添加した細胞メディア幹ミリリットル10を追加します。
  5. 遠心分離が完了したら、6を追加することによって、低付着フラスコに培地を吸引し、転送ペレットを細胞培地とピペットアップ幹ミリリットルダウンペレットを緩める。加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5%CO 2に設定する。回転楕円体の形成を観察するために3日間 - ごとに2細胞を監視します。
  6. 伝統的なTIC文化を作成します。伝統的な接着性の培養条件で成長させた80%のコンフルエント細胞のフラスコを削除します。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 1.5ミリリットルトリプシン0.25%EDTAを加え、インキュベート3から5RTで分。
  7. 名前、日付、および細胞株の継代数で標識された超低接着表面ポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコを調製する。フラスコに、説明したように、EGFおよびFGFを補充した細胞培地を、ステム10ミリリットルを加える。
  8. トリプシンでフラスコに細胞媒体幹ミリリットル6を追加します。上下にピペット細胞溶液とフラスコ表面から細胞を緩めしよう。 10を含有する超低付着フラスコに細胞のボリューム全体を転送する細胞培地幹ミリリットル。加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5%CO 2に設定する。
  9. それぞれ、ミリリットル/ 20ng / mlのおよび10ngの最終濃度のための細胞培地と新鮮なEGFとFGF幹mlの追加の2で72時間 - TICの文化ごとに48を補足する。
  10. 80%のコンフルエンスに達した - 60までのセルを監視します。 2新しい超低付着フラスコに等しい体積を配置し、18 mlの最終容積を達成するために、新鮮な幹細胞培地を添加することにより、分割培養。代替案LY、400×gで5分間4℃で遠心全体サスペンション。幹細胞培地中で細胞を再懸濁は、EGFとFGFを補充し、新しい超低付着フラスコに均等に分配する。細胞は、継代のために、単一細胞懸濁液に解離される必要はない。
    注:この時点で培養を分割し、培養し、凍結、または実験的に解析するために操作し続けることができる。フローターTIC培養のための伝統的な接着性、伝統TICのために4.0×10 6 8.0×10 6、および5.0×10 6:80%の細胞の以下の濃度は、ACI-23のために検索された合流- 60。 10日、と再び減少 - CD133 + ALDH +細胞の割合は、最初の3日以内に5位のピークは低いとしてTIC濃縮に最適な培養液中で10日間 - それは細胞株に依存するかもしれませんが、私たちは5ことを見出した14日。

初代上皮卵巣癌細胞株および多スフェロイドの3世代化学療法抵抗性患者の腹水から

注:治験審査委員会の承認が、このプロトコルが得られた。細胞および培地の全ての取扱いは無菌の組織培養フード内で行われるべきである。

  1. 従来の細胞培養培地との1:1液体プレート腹水。セクション1で説明したようにメディアを準備し、いくつかの伝統的なポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコに10ミリリットルを追加します。
  2. 腹水は、通常は1 Lの滅菌真空ボトルで提供されている。真空キャップを外す。慎重に37℃、5%CO 2に設定した加湿細胞培養インキュベーター中で10ミリリットル従来のメディアと場所を含むフラスコする流体を10mlの腹水を追加する。完全なメディアの変更を行う前に、96時間 - 72静かにしておきます。 80%のコンフルエンス - 細胞が60に達するまで3日間 - すべての2メディアを変更
  3. 項1. TIC培養で説明したようにセクション2で説明したように2: - 細胞が60に達すると、80%コンフルエントに、1分割。
    注:ascitに存在する赤血球それらは非接着性であるようにesが最初の培地交換の後に除去される。存在するいずれの線​​維芽細胞は、主に、彼らはより敏感であり、トリプシンに最小限の露出で持ち上げるようにトリプシンで処理した後に削除されます。卵巣癌細胞の純度は、CA-125(MUC16)に対する抗体を用いたフローサイトメトリー分析により決定した。

TICマーカーのフローサイトメトリ確認のための細胞の4染色

  1. TICの文化を収集します。を50mlのポリプロピレン遠心管にフラスコの内容物を移す。 400×gで5分間遠心懸濁液。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 2mlのに非酵素的細胞解離溶液を加えインキュベート3 - 37°Cで5分間、そしてピペッティング上下塊を破壊し、単細胞に解離する。細胞媒体幹ミリリットル4を追加します。
  2. 接着培養を収集します。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 3ミリリットルの非酵素的細胞解離溶液を加え、インキュベート3 - 37°Cで5分間。従来のセル3ミリリットルを追加します。培養培地およびフラスコから細胞を剥離し、遠心管に収集するために繰り返して上下にピペッティング。
  3. 遠心TIC 400×gで5分間付着懸濁液両方。上清を捨て、3%のウシ胎児血清を含む1mlのPBSで各ペレットを再懸濁。 RTで30分インキュベートする。一方、トリパンブルーを用いて生存細胞の数を数える。スフェロイドは、単一の細胞に分離されている確認するために、顕微鏡で細胞を観察します。
  4. 以下の培養条件のそれぞれのラベル5×1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ:1)未染色(補正用の非染色対照)、2)ALDH(補償のための単一の染色陽性対照)、3)、CD133(補償のための単一の染色陽性対照)、4 )ALDH + CD133(実験試験サンプル)、および5)DEAB + ALDH(FL-1、FL-4チャンネルにおけるバックグラウンド蛍光のためのネガティブコントロール、それぞれ)。
  5. 400×gで5分間4.遠心懸濁液-チューブに約5×10 5細胞それぞれの#1を配布します。吸引しsupernata500μlのALDEFLUORアッセイバッファーでNTおよび再懸濁ペレット。実験的な負の制御のためのチューブ#5に10μlのDEAB(ALDH阻害剤)を追加します。
  6. 補償ミックスするポジティブコントロールとフリックのためのチューブ#2にALDEFLUOR試薬を活性化した5μlを添加する。実験的な分析のためのチューブ#4にALDEFLUOR試薬を活性化した5μlを添加する。フリック管が混在し、すぐにDEABが含まれているチューブ#5(250μL)にチューブ#4からの細胞の半分のボリュームを転送します。
  7. フリックチューブはよく混合する。光から保護し、37℃で45分間 - 30すべてのチューブをインキュベートします。細胞が底に沈むようフリック管は、潜伏期間の途中で。 400×gで5分間遠心操作は、すべてのチューブ。 500μlのALDEFLUORアッセイ緩​​衝で吸引し上清および再懸濁細胞。
  8. CD133染色でチューブ用(#3、#4)、直接ALDEFLUORアッセイバッファーにCD133-APC 1時11分を追加します。光から保護氷上で15分間インキュベートします。 400×gで5分間遠心CD133管。 1回洗浄アッセイ緩​​衝ALDEFLUOR 500μL。それぞれ500μlのALDEFLUORアッセイバッファー、で細胞を再懸濁。
  9. セルストレーナーキャップを有する個々のポリスチレン丸底チューブにフィルタ懸濁液。ボリューム全体がキャップを介して濾過されていることを確認。
  10. 細胞集団を分析するためにフローサイトメーターを使用する。補償制御を設定するためのチューブを#1-3を使用してください。フォワードの使用及び側方散乱パラメータ、ゲート細胞、細胞破片を除外するようにしてくださいという。それぞれ、ALDH +およびCD133 +ダブルFL-1を用いて細胞およびFL-4チャネルを確立します。
  11. フローサイトメトリー分析プログラムを用いて、培養条件は、これらの二つのマーカーのためのより高い染色を有するべきであるTIC富む培養物TIC細胞の割合を高め確認する。
    NOTE:CD133およびALDHに加えて、他のmarkersof卵巣癌のTICは、フローサイトメーターの能力に依存するいずれかのサンプルで使用されるマーカーの数を分析することができる。

5. インビボ

注:治験審査委員会の承認が、このプロトコルが得られた。 3のケージでの実験群に8週齢と注射前に数日間順応できるようにする - 6胸腺欠損雌ヌードマウスを配布します。 NIH動物実験委員会に従って人道的な実験的なガイドラインの下でマウスに従ってください。体重、体重減少などの物理的な外観を監視したり、20%を超える、衰弱外観、下痢または皮膚炎を得て、CO 2窒息によってこれらの基準を当てはめたマウスを安楽死させる。

  1. 1mlのPBSに再懸濁部2の各細胞集団に記載のように培養物を収集する。パンブルーアッセイを用いて生細胞を数える。
  2. 15ミリリットル遠心管を準備します。三重の対策について(0.5ミリリットルの容量で5×10 5個の細胞を皮下右Fに注入され、各チューブに2mlのPBSで希釈した1.5×10 6生細胞を追加各マウスの痩せ細った)。唯一の対照マウスのために0.5mlのPBSを準備します。
  3. 27 G針を使用して、群あたり3匹のマウスのそれぞれの右脇腹にTIC培養フロータ、またはPBS、従来の付着培養、従来のTIC培養から0.5ミリリットルの細胞懸濁液をsubcutaneouslyinject。オリジナルのケージ、注射後にマウスを返します。
  4. マウスを秤量し、ノギスweeklyby回二次元で任意の触知可能な腫瘍を測定し、長さと幅を設定する。
    注: - 細胞株に応じて50日腫瘍待ち時間通常20である。
  5. 標準的な方法(V =(幅)2×長さ/ 2)による腫瘍湿潤体積を計算します。
    注:この研究は、最初の世代のために、接着性細胞対のTICの腫瘍形成を比較したが、同様の条件下で成長したのTIC のin vivoでの連続継代は他人11,20によって完成されたものである。

Representative Results

確立された卵巣癌細胞株および添付の血清ショーの存在下で、従来の接着培養条件下で増殖させた一次腹水細胞株、玉石の形態、TIC培養条件下で増殖させた同じ細胞は、TICの集団において、共通のフローティングスフェロイドの形態を表示するのに対し。 図1のAに表示された明視野画像は、明らかに、培養条件の形態学的な違いを示す。 図1Bは、従来の接着性の条件でACI-23およびTGS-3 TIC文化を再播種後に達成差別形態を示している。典型的な接着細胞に似ている、ちょうど24時間付着した条件には播種後、多細胞スフェロイドの大半は解離して、表面に付着する。

CD133 expressio - 幹細胞マーカーは、フローサイトメトリー分析でTICの条件は細胞を濃縮することを確認するには、卵巣のTIC 2つの一般的なマーカーを用いて行ったnおよびALDHの活動。 図2のAに示すドットプロットは、低付着、無血清条件でCD133 +細胞の割合の増加を強調する。同様に、ALDH酵素の活性は、従来の接着培養条件と比較して、これらの条件で高い。なお、従来の接着性培養物は、CD133 +細胞が、スフェロイド形成を増強する条件下で増加割合を含む。多能性マーカーの分析は、TRA-1-60は、TICの条件はチック、 図2のBを濃縮することをさらに支持を与える。 図2 Cでの定量化は、二重陽性(CD133 + ALDH +)ACI-23細胞は、主にTIC強化する条件の下で増殖させた培養物に限定されていることを示している。 TICの条件で5日間の培養後のACI-23細胞において生じる異なる転写因子のタンパク質レベルの変化も調べた。マーカーの各々の漸進的増加sは、接着培養で見られる比較的低いレベルの、 図2のDに比べTIC条件をフロータするために、従来から見られる。興味深いことに、様々な条件で増殖させたヒト腹水細胞株は、フローターTIC条件、 図2のEに存在していない染色に少ないとの伝統的なTIC条件の下で最高のマーカー表現型を表示します。

TIC培養条件の腫瘍形成性無胸腺ヌードマウスのコホートに、全ての条件から得られた生存細胞の等しい数の皮下注射によって検証した。3実証するACI-23(A、B)およびOVCAR-5(C)細胞を伝統的な接着培養は、TICの文化からのものよりも小さい腫瘍形成した。フローターTIC文化は伝統的な接着性や伝統的なTIC培養よりも短い時間でより大きな腫瘍を生成したことに注意してください。これらのDアタも卵巣TICマーカーの適度な増加で、劇的な表現型の変化があることを示唆している。しかしながら、他の細胞系(図示せず)を有する従来のTIC培養物は、伝統的な接着性とフロータTIC培養細胞よりも腫瘍形成性であった。

図1
異なる培養条件下における図1スフェロイド開発。(A)を設立卵巣癌細胞株(ACI-23、OVCAR-5及びCAOV3)および無血清低付着フラスコ中で増殖させ、一次患者由来の腹水細胞(TGS-3)幹細胞培地を容易に多細胞スフェロイドを形成する。画像は、同じ細胞がTIC条件で96時間以内に、スフェロイドを形成し、一方、従来の接着培養条件は、ACI-23上皮敷石状形態、OVCAR-5、CAOV3およびTGS-3細胞を維持示す。スケールバーは100μm。 24時間の曝露すると(B)従来の接着培養条件に、TIC文化形態は、元の接着性の形態学に似た分化した表現型を表示する。スケールバーは100μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.低付着、無血清条件下でTICマーカーを有する細胞を濃縮する。(A)APC結合CD133抗体を用いたACI-23細胞のフローサイトメトリー分析は、無血清ステムと低付着フラスコでCD133 +細胞の割合の増加を実証細胞培地。 ALDEFLUORアッセイショーを使用してフローサイトメトリー分析は、血清を含まない幹細胞培地と低接着フラスコで培養した細胞においてALDH活性を増加させた。 CD133陰性コントロールは、抗体およびALDH負の詐欺が含まれていませんコントロールは、ALDH阻害剤(DEAB)の存在下で活性化された基板である。 FITC結合TRA-1-60抗体を用いた(B)の分析は、ACI-23細胞でのフローターTIC条件でのTRA-1-60 +細胞の最も高い割合を示しています。陰性コントロールには抗体が含まれていません。 (C)CD133 + ALDH +細胞は、従来のTICに最高であり、ACI-23細胞株におけるTIC条件フロータ。エラーバー:SEM、N = 6、*はp <0.05。 (D)5日間TIC条件下で培養されたACI-23細胞における幹細胞の転写マーカーのタンパク質レベルの増加を示すウエスタンブロット分析。全細胞溶解物(50μgの)はローディングコントロールとしてGAPDHを用いて分析した。 (E)のように分析したTGS-3主要腹水細胞の代表的なドットプロット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


図3.低付着、無血清条件下で増加した腫瘍形成能を有する細胞を濃縮する。(A)5×10 5生存ACI-23細胞を皮下に三重に無胸腺ヌードマウスに注射した。マウスの体重を測定し、腫瘍を週に2回キャリパーで測定した。 =伝統接着培養、F =フローターTIC文化、S =伝統TIC文化。 *はp <0.05。 (B)は、異なる培養条件下で増殖させた細胞を用いて25日後のACI-23から形成された腫瘍の代表的な画像。 (C)5×10 5実行可能なOVCAR-5細胞を皮下に三重で無胸腺ヌードマウスに注射し、Aのように監視した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ここで説明するプロトコルは、確立された卵巣癌細胞株由来の幹細胞の特徴を有する細胞を培養液を濃縮するための効率的かつ一貫した方法を提供し、一次患者試料に適用可能である。このメソッドは、成功した種々の細胞株全体でのTICのために豊かにします。これは、物理的に集団内の非のTICからのTICのソートに時間をかけずに、TICおよび/または腫瘍形成表現型を濃縮するための条件を適時に同定を可能にする。このようにして、異なるシグナル伝達経路の相対的レベルは、機能的な種々のアッセイを用いてTIC培養物に従来の付着培養物を比較することによって、TICの表現型への寄与について評価することができる。純粋TIC集団が所望される場合、単離が容易にプロトコル、フローサイトメトリーで蛍光アシストや磁気選別工程を組み込むことによって達成することができる。

しかし、心に留めておくことが重要であるTICマーカーの発現そのようなCD133、CD44、またはALDHなどsは、細胞株または同じ腫瘍タイプの患者サンプル間で変化してもよい。例えば、我々は逆ACI-23についても同様であるのに対し、OVCAR-5細胞は、CD133へのCD44の相対的な高い発現を持っていることがわかった。これは、マウスでの腫瘍の開始に依存しており、TICの存在の決定的なようにフローサイトメトリー分析することが適切である。卵巣癌細胞、幹細胞条件で​​成長させた場合に、このプロトコルに従って、高いALDH活性が一貫して観察された。 ALDHはフローターTIC条件で最高であるのに対して、興味深いことには、CD133の発現は、伝統的なTIC培養条件下で増殖したACI-23細胞において一貫して高い。これとは対照的にTGS-3主要腹水細胞はフローターTICの条件でCD133陽性のわずかな増加が、従来のTIC条件下でのALDH活性の著しい増加を表示する。これらの知見は、卵巣癌細胞の不均一性と一般のTICに関連した可塑性を強調表示します。さらにCLAをサポートするために、これらの方法はのTICを高めるイムは、TRA-1-60陽性細胞の富化はまた、観察された。 TRA-1-60多能性のマーカーであり、胚性卵巣および精巣の癌、ならびに前立腺癌TICS 30-32を識別するために使用されている。我々の方法は、多数の細胞株を用いて成功しているが、それは修正されたフローター条件が良い他の卵巣癌細胞集団でのTICを富化しながら、標準TIC条件は、いくつかの卵巣癌細胞に対してより適しているかもしれない可能性がある。これは再び患者由来の両方の卵巣癌細胞株を確立中で予想される不均一性を強調している。

細胞表面マーカーに加えて、これらのマーカーは、卵巣癌のTICに固有のものではなく、むしろ、胚性幹細胞の多能性のための重要な要素を表しているが、Nanog遺伝子、Sox2が、Oct-4の11を含む卵巣癌のTICを特徴付けることが示されているいくつかの転写因子であるとDIFferentiation 33,34。我々は、これらの因子のタンパク質レベルの変化を調べ、Nanogのレベルは、他13,35並びにCD133、TRA-1-60、およびCD117と一致して、TIC培養条件下で増加することを見出した。ヒト幹細胞マーカーのcDNA配列はさらに、伝統的な付着条件と比較してTIC条件におけるCD133、Nanogは、メルク、及びPODXL遺伝子の増加を示した。重要なことには、細胞表面マーカーと同様に、卵巣のTICに関連付けられた転写因子は、細胞株および患者サンプル間で変化してもよいことに留意すべきである。

我々は、in vitroで本質的に非接着性である場合、細胞がより腫瘍形成性であること、および幹細胞マーカーの高いレベルを発現することができることを観察した( すなわち、容易に接着性プレートに付着しない浮遊細胞)。培養中に、そのようなACI-23のような細胞株は、通常、従来の培養コンディット下スタッキング方式で垂直に成長し、多くの実行可能な浮遊細胞および/または細胞を有するイオン。浮遊細胞凝集体からのTICの成功した濃縮が本研究とOVCAR-3 12を含め、比較的少数の細胞株に適用できるかもしれないが、我々の調査結果がこの腫瘍形成性集団である可能性が示唆された。したがって、商業幹細胞培地にあまり適応細胞を、TIC濃縮の代替方法として機能することができる標準的な組織培養プレートおよび培地で増殖させた細胞の「浮動」集団を採取する。

この原稿で提示異なる培養方法の使用はTIC集団の迅速な濃縮および異なる細胞におけるこの表現型をサポートしてどのような要因をより良く理解できるようになります。この方法の現在のアプリケーションは、シグナル伝達経路は、細胞のこのユニークな人口の伝播をサポートするために不可欠な特徴があります。これらの研究からの結果は、腫瘍の進行および再発のメカニズムを解明するのに役立つ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

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References

  1. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
  2. Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
  3. Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
  4. King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
  5. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  6. Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
  7. Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
  8. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
  9. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
  11. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  12. Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
  13. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
  14. Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
  15. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
  16. Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
  17. Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
  18. Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
  19. Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
  20. Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
  23. Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
  24. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
  25. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
  26. Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. (2014).
  27. Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
  28. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
  29. Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
  30. Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
  31. Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
  32. Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
  33. Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
  34. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
  35. Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).

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