In vitro berikelse for eggstokkreft Tumor-initiere Cells

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft i USA med den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet er den svært tilbakevendende, kjemoresistent trekk ved denne sykdommen. Primær behandling består vanligvis maksimal cytoreduktiv kirurgi og påfølgende platinumbasert terapi, selv om det er noe som tyder på neoadjuvant terapi kan være nyttig i noen tilfeller en. Flertallet av pasienter responderer positivt på primærbehandling, men dessverre halvparten vil få tilbakefall innen 18 måneder 2.

De fleste ovarian maligniteter er epiteliale karsinomer og kan stamme fra overflaten epithelia av eggstokk eller eggleder 3,4. Flere studier støtter eksistensen av somatiske stamceller i det kvinnelige reproduksjonssystemet som formodentlig bistå i vevsreparasjon som er nødvendig etter eggløsning 5,6. Den høye proliferativ aktivitet på både eggstokk og eggleder under ovulasjon kan være en viktig faktor i utviklingen av kreft i eggstokkene (Gharwan, et al. manuskript innsendt). Avledning av tumordannende celler er uklart, men de kan oppstå fra normale stamceller, stamceller, eller differensierte celler gjennom mutasjoner som gjør dem i stand til å regulere divisjon eller skjebne. Disse cellene har også blitt betegnet som "cancer stamceller" eller "kreft-celler initierer", og kan vokse inn tumorigene, flercellede sfæroider ved lave festeforhold. Selv om den hierarkiske modellen av TIC utvikling kan være dynamisk, trenger tics deler mange av de samme funksjonene som normale stamceller inkludert quiescence, motstand mot kjemoterapi, langsiktig selvfornyelse og evne til å differensiere i ulike celle linjene 7,8.

Flere studier støtter eksistensen av tics i eggstokkreft og dagens innsats er underveis for å avklare mekanismen (e) som disse cellene støtte tumorigenesis 9-11. En rekke markører er blitt foreslått for å identifisere ovarian tics med forbedret tumorgenisitet inkludert CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, og MyD88, selv om den eksakte bidraget til hver markør er uklar, og kan være celletype spesifikk 11-16. Mens en universell markør eller et sett med markører ikke er entydig for eggstokkreft tics, har ulike grupper isolert eggstokkene tics oftere ved å velge for CD44 +, CD133 + og / eller celler med høy aldehyd dehydrogenase (ALDH) aktivitet 13,17-21. CD44 er et transmembran-glykoprotein som fungerer som en reseptor for hyaluronsyre og regulerer flere prosesser som er viktige for tumorprogresjon, inkludert adhesjon, proliferasjon, migrering, differensiering angiogenese og 22. CD133 er et trans glykoprotein hvis funksjon er fortsatt uklart, men studier tyder på det organiserer plasmamembran topologi 23. ALDH, et intracellulært enzym som katalyserer oksidasjonen av aldehyder, kan være den mest universal markør av tics som høy aktivitet har blitt identifisert i stamceller isolert fra en rekke vev og flere roller har blitt tilskrevet ALDH i å støtte normale stamceller og tics 24. Som nå, CD133 og ALDH1 synes å være de mest reproduserbare markører for eggstokkreft tics 13,21.

I tillegg til å forstå egenskapene til tics, er det også en stor innsats for å identifisere medikamenter som spesifikt retter denne undergruppe. Den høye tilbakefallsrate forbundet med eggstokkreft kan skyldes svikt i dagens chemotherapies å kunne utrydde tics. Selv om mesteparten av tumoren er mottagelig for eksisterende terapier, er tics antatt å være motstandsdyktige og i en tetthet upåviselig ved standardmetoder. Belyse mekanismer for terapiresistens og svulst tilbakefall er avgjørende for å bedre respons og samlet overlevelse av pasienter med eggstokkreft.

Her er kultur teknikker beskrevet thved berike for tics fra etablerte og primær eggstokkkreft cellelinjer. Dyrkningsforholdene beskrevet her har blitt brukt av flere grupper å indusere forplantning av tics eller sfæroide celler med stamcelle kvaliteter 11,12,14,16,20. Selv om det er flere stammecellekulturmedier og kosttilskudd som vanligvis anvendes for å anrike tics / sfæroider vi brukt et serumfritt medium formel med EGF og FGF, men uten tilsetning av B27 eller N-2 kosttilskudd. Disse supplementene, som vanligvis brukes for neuronal cellekultur og berikende for stamceller, har vist seg å fremme en mesenchymale fenotype 25,26, og det gjenstår en viss usikkerhet på området med hensyn til om tics som har en mesenchymale eller epiteliale fenotype er mer tumorigent 27-29 . For å minimere usikkerhet og variabler vi har valgt å bruke de vanligste formel, siden vi har å gjøre med epitelovarialcancer kreftceller.

Vedlikeholde celler i serum-frie medier i en lav vedlegg kolbeletter sfæroide dannelse og støtter formering av celler med CD133 ekspresjon og høy ALDH-aktivitet. Vårt arbeid har videre vist at celler som flyter under normale tilhenger forhold kan også representere en mer tumorigent TIC befolkningen. Injeksjon av celler dyrket under disse betingelser i atymiske nakne mus fører til høyere karsinogent potensial sammenlignet med celler dyrket i vedlagte betingelser i nærvær av serum. Mye informasjon angående rollen til tics i eggstokkreft initiering, progresjon, terapeutisk respons, og sykdoms tilbakefall kan oppnås ved bruk av disse teknikkene.

Protocol

1. Tradisjonell kultur for eggstokkreft cellelinjer (Adherent betingelser)

MERK: All håndtering av celler og media bør skje i et sterilt vev kultur hette

  1. Forberede tradisjonelle cellekulturmedier. Bruke 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin + 15 mM HEPES) og supplere med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin. Filter løsning med 0,45 mikrometer vakuum filter.
  2. Forberede en tradisjonell polystyren 75cm 2 vevskulturkolbe merket med navn, dato og passasje antall cellelinje interest.Remove hetteglasset med celler fra ultra low fryser eller flytende nitrogen. Tine ved å plassere i 37 ° C vannbad i 5 min.
  3. Overføring suspensjon fra flasken inn i et 15 ml sentrifugerør inneholdende 3 ml tradisjonelle cellekulturmedium (fremstilt ovenfor). Sentrifuger suspensjonen ved 4 ° C i 5 min ved 400 x g. I mellomtiden, legger 16 ml tradisjonelle cellekulturmedier til flaske.
  4. Aspirer supernatant. Bruk av 2 ml tradisjonelle cellekulturmedier pipettes celler opp og ned for å løsne pellet og overføring suspensjon til flaske. Rist kolbe for å fordele cells.Place kolbe i fuktig cellekulturinkubator satt til 37 ° C og 5% CO2. Overvåk celler daglig inntil 80% samløpet er nådd.
  5. Når cellene er 80% konfluent delt kulturen 1: 2 i cellekultur hette. Aspirer supernatanten og vask med varm fosfatbufret saltvann (uten kalsium og magnesium) (PBS). Tilsett 1,5 ml Trypsin 0,25% EDTA og Inkuber 3 til 5 minutter ved RT.
  6. Forbered to nye polystyren 75cm to kolber og tilsett 16 ml tradisjonelle celledyrkningsmedier til hver kolbe. Resuspender cellene trypsinisert i 4 ml tradisjonelle cellekulturmedier og aliquot like volumer av hver av de nye kolber.
  7. Plasser kolber i fuktig cellekulturinkubator satt til 37 ° C og 5% CO2. Overvåk celler daglig inntil 80% samløpet er nådd. Fortsett å dele celler ogkultur eller fryse og oppbevares ved -80 eller i flytende nitrogen.

2. generasjon av Flercellede Spheroids fra eggstokkreft cellelinjer med flytende eller Adherent Cells

NB: All håndtering av celler og media bør skje i et sterilt vev kultur hette. Etter dyrking cellelinjer i henhold til tradisjonelle kultur metoder for 2-3 passasjer (seksjon 1) fortsetter du med følgende trinn.

  1. Forberede stamcelle media. Bruke 1: 1 DMEM: B12 (+ L-glutamin + 15 mM HEPES) og utfylle med 1% penicillin / streptomycin (til en endelig konsentrasjon på 100 U / ml penicillin og hundre ug / ml streptomycin), 1% knockout serum erstatning 0,4% bovint serumalbumin og 0,1% insulin-transferrin-selen. Filter løsning med 0,45 mikrometer vakuum filter.
  2. Supplement stamcelle medier med humant rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) og human rekombinant basisk fibroblast vekstfaktor (FGF) til en sluttkonsentrasjon på 20 ng / ml og 10 ng / ml, respektivt.
    MERK: Vekstfaktorer bør legges frisk til stamcelle media rett før bruk.
  3. Lag floater TIC kultur. Fjern kolbe på 80% konfluente celler dyrket i tradisjonelle adherente dyrkningsbetingelser. Samle media og alle flytende celler (single og aggregater), forlater tilhenger befolkningen bak, og overføre til 50 ml polypropylen sentrifugerør. Sentrifuger suspensjonen ved 4 ° C i 5 min ved 400 x g.
    MERK: Flytende celler og aggregater er åpen 24 - 72 timer etter adherente cellene blir koblet til kolbe under tradisjonell kultur. Fra en 80% konfluent plate gjenfinning av ca. 1.0 - 5.0 x 10 5 levedyktige flytende celler kan ventes, avhengig av cellelinjen. I denne studien ble det gjennomsnittlige antall flytende celler oppsamlet fra en 80% konfluent adherent kulturen var: 5,0 x 10 5 for ACI-23, 4,8 x 10 5 for OVCAR5, 3,5 x 10 5 for CAOV3, og 1,0 x 10 5 for TGS- 3. Ved overføring multicelleular spheroid dannelse i tradisjonell og floater TIC kultur oppstår i løpet av få dager, selv om dette er noe cellelinje avhengig. For eksempel ACI-23-celler danner aggregater lettere enn CAOV3 celler.
  4. I mellomtiden forbereder en ultra lav festeflate polystyren 75 cm 2 vevskulturkolbe merket med navn, dato og passasje antall cellelinje. Tilsett 10 ml stamcelle medier supplert med vekstfaktorer til kolben.
  5. Når sentrifugering er komplette, aspirer media og overføring pellet til lav vedlegg kolbe ved å legge til 6 ml stamcelle media og pipettere opp og ned for å løsne pellet. Plasser kolber i fuktig cellekulturinkubator satt til 37 ° C og 5% CO2. Overvåk celler hver 2 - 3 dager for å observere spheroid formasjon.
  6. Lag tradisjonelle TIC kultur. Fjern kolbe på 80% konfluente celler dyrket i tradisjonelle adherente dyrkningsbetingelser. Aspirer media og vask med varmt PBS. Tilsett 1,5 ml trypsin 0,25% EDTA og inkuber 3-5min ved RT.
  7. Forberede en ultra lav festeflate polystyren 75 cm 2 vevskulturkolbe merket med navn, dato og passasje antall cellelinje. Tilsett 10 ml stamcelle medier supplert med EGF og FGF, som beskrevet, til kolben.
  8. Tilsett 6 ml stamcelle media til kolben med trypsin. Pipetter celleløsning opp og ned og forsøke å løsne cellene fra kolbe overflate. Overføre hele volumet av celler til ultra low vedlegg kolbe som inneholder 10 ml stamcelle media. Plasser flasken i fuktig cellekulturinkubator satt til 37 ° C og 5% CO2.
  9. Supplement TIC kulturer hver 48 til 72 timer med ytterligere 2 ml stamcelle media og frisk EGF og FGF til endelige konsentrasjoner på 20 ng / ml og 10 ng / ml, henholdsvis.
  10. Overvåk celler inntil 60-80% samløpet er nådd. Split kulturer ved å plassere like volumer inn to nye ultra lav feste kolber og legge friske stamcelle medier for å oppnå et sluttvolum på 18 ml. Alternativly, sentrifuger hele suspensjonen ved 4 ° C i 5 min ved 400 x g. Resuspender celler i stamcelle media supplert med EGF og FGF og fordele likt inn i nye ultra-lav feste kolber. Cellene trenger ikke å bli dissosiert til en enkelt cellesuspensjon for aging.
    MERK: På dette punktet kulturer kan fortsette å deles og kultivert, frosset, eller eksperimentelt manipulert for analyse. 60 - 80% samløpet følgende konsentrasjoner av celler ble hentet for ACI-23: 8,0 x 10 6 for tradisjonell Adherent, 4,0 x 10 6 for tradisjonell TIC, og 5,0 x 10 6 for Floater TIC kulturer. Selv om det kan være cellelinje avhengig, har vi funnet at 5 - 10 dager i kultur er optimal for TIC anrikning som prosentandelen av CD133 + ALDH + celler er lav i løpet av de første 3 dager, topper ved 5 - 10 dager, og avtar igjen ved 14 dager.

3. Generation of Primary ovarialcancer cellelinjer og Multicellulære Spheroidsfra kjemoresistent Pasient Ascites

MERK: Institutional Review Board godkjenning ble innhentet for denne protokollen. All håndtering av celler og media bør foregå i en steril vevskultur hette.

  1. Tallerken ascites fluid 1: 1 med tradisjonelle cellekulturmedier. Forberede media som beskrevet i punkt 1 og legge til 10 ml til flere tradisjonelle polystyren 75 cm 2 vevskulturflasker.
  2. Ascitesvæske leveres vanligvis i en L sterile vakuum flasker; fjerne vakuum cap. Tilsett forsiktig 10 ml ascitesvæske til flaske inneholder 10 ml tradisjonelle medier og sted i fuktet cellekulturinkubatoren satt til 37 ° C og 5% CO 2. La uforstyrret i 72-96 timer, før du gjør en komplett medie endring. Endre media hver 2 - 3 dager før cellene nå 60 - 80% samløpet
  3. Når cellene nå 60 - 80% samløpet, splittet 1: 2 som beskrevet i punkt 1. Begynn TIC kulturer som beskrevet i § 2.
    MERK: Erytrocytter stede i ascites vil bli fjernet etter den første media endring som de er ikke-tilhenger. Eventuelle fibroblaster til stede i stor grad vil bli fjernet etter behandling med trypsin som de er mer følsomme og vil løfte med minimal eksponering for trypsin. Renhet av eggstokkreft celler ble bestemt ved flowcytometri analyse ved hjelp av antistoff for CA-125 (MUC16).

4. Farging av celler for flowcytometrisystemer Bekreftelse på TIC Markers

  1. Samle TIC kulturer. Overføre innholdet i kolben i 50 ml polypropylen sentrifugerør. Sentrifuger suspensjoner i 5 minutter ved 400 x g. Aspirer media og vask med varmt PBS. Tilsett 2 ml ikke-enzymatiske celledissosiasjon løsning, inkuberes 3-5 minutter ved 37 ° C, og pipetter opp og ned for å bryte opp klumper og dissosiere inn i enkeltceller. Tilsett 4 ml stamcelle media.
  2. Samle tilhenger kulturer. Aspirer media og vask med varmt PBS. Tilsett 3 ml ikke-enzymatiske celledissosiasjon løsning og inkuber 3-5 minutter ved 37 ° C. Tilsett 3 ml tradisjonell cellekulturmedier og pipetter opp og ned flere ganger for å løsne cellene fra kolbe og samles opp i sentrifugerør.
  3. Sentrifuger både TIC og adherente suspensjoner i 5 minutter ved 400 x g. Fjern supernatant og resuspender hver pellet i 1 ml PBS inneholdende 3% føtalt bovint serum. Inkuber ved RT i 30 min. Samtidig teller antallet levedyktige celler ved hjelp av trypanblått. Observere celler under mikroskop for å bekrefte kuler er dissosiert til enkeltceller.
  4. Etikett 5 x 1,5 ml Eppendorf-rør for hver av de følgende kultur forhold: 1) Ufarget (unstained kontroll for kompensasjon), 2) ALDH (single flekken positiv kontroll for kompensasjon), 3) CD133 (single flekken positiv kontroll for kompensasjon), 4 ) ALDH + CD133 (eksperimentell prøve), og 5) DEAB + ALDH (negative kontroller for bakgrunnsfluoresens i FL-1 og FL-4 kanaler, henholdsvis).
  5. Fordel ca. 5 x 10 5 celler hver til rør # 1 - 4. Sentrifuger suspensjoner i 5 minutter ved 400 x g. Aspirer supernatant og resuspender pellets i 500 mL Aldefluor målingsbuffer. Legg 10 pl DEAB (aldh hemmer) til tube # 5 for eksperimentell negativ kontroll.
  6. Tilsett 5 mL aktivert Aldefluor reagens til tube # 2 for kompensasjon positiv kontroll og flick å blande. Tilsett 5 mL aktivert Aldefluor reagens til tube # 4 for eksperimentell analyse. Flick rør for å blande og øyeblikkelig overføre halvparten av volumet av celler fra røret # 4 # 5 inn i røret (250 ul) som inneholder DEAB.
  7. Flick rør for å blande godt. Inkuber alle rør i 30 - 45 min ved 37 ° C beskyttet mot lys. Flick rør halvveis gjennom inkubasjonstid som celler vil bosette til bunnen. Sentrifuger alle rør i 5 minutter ved 400 x g. Aspirer supernatanten og resuspender celler i 500 mL Aldefluor målingsbuffer.
  8. For rør med CD133 flekker (# 3 og # 4), tilsett CD133-APC 1:11 direkte inn Aldefluor analysebuffer. Inkuber 15 min på is beskyttet mot lys. Sentrifuger CD133 rør for 5 min ved 400 x g. Vask en gang med500 mL Aldefluor analysebuffer. Resuspender celler i 500 ul analysebuffer Aldefluor hhv.
  9. Filtrer suspensjoner i individuelle polystyren rundbunnede rør med celle sil cap. Sikre at hele volumet blir filtrert gjennom lokket.
  10. Benytte et strømningscytometer for å analysere cellepopulasjonen. Bruk rør # 1-3 for å sette kompensasjon kontroller. Ved hjelp fremover og side scatter parametere, gate cellene, være sikker på å utelukke cellerester. Etablere ALDH + og CD133 + doble celler ved hjelp av FL-en og FL-4 kanaler, henholdsvis.
  11. Ved hjelp av en cytometrisk analyse program, bekrefter dyrkningsforholdene forbedret prosentandelen av celler som TIC tic rike kulturer bør ha høyere farging for disse to markører.
    MERK: I tillegg til CD133 og ALDH, andre markersof eggstokkreft tics kan analyseres med antall markører som brukes i en hvilken som helst én prøve avhengig av egenskapene til Strømningscytometer.

5. I vivo

MERK: Institutional Review Board godkjenning ble innhentet for denne protokollen. Distribuere atymiske kvinnelig naken mus 6 - 8 ukers alder til eksperimentelle grupper i bur av tre og la det akklimatisere seg i noen dager før injeksjoner. Følg mus henhold humane eksperimentelle retningslinjer som per NIH Animal Care og bruk komiteen; overvåke kroppsvekt, fysisk utseende herunder vekttap eller få større enn 20%, avmagret utseende, diaré eller eksem og avlive mus som passer disse kriteriene ved CO 2 kvelning.

  1. Samle kulturer som beskrevet i kapittel 2. Resuspender hver celle befolkningen i 1 ml PBS. Telle levedyktige celler ved hjelp trypanblått analysen.
  2. Forbered 15 ml sentrifugerør. For triplikat tiltak legge 1,5 x 10 6 levedyktige celler fortynnet i 2 ml PBS inn i hvert rør (5 x 10 5 celler i et volum på 0,5 ml blir injisert subkutant inn i høyre fmager av hver mus). Forberede 0,5 ml PBS bare for kontroll mus.
  3. Ved hjelp av 27 g nåler, subcutaneouslyinject 0,5 ml cellesuspensjon fra tradisjonelle adherente kulturer, tradisjonelle TIC kulturer, floater TIC kulturer, eller PBS inn i den høyre flanken til hver av tre mus pr gruppe. Returnere mus til den opprinnelige bur etter injeksjon.
  4. Veie mus og måle opplagte svulster i to dimensjoner to ganger weeklyby Vernier caliper, etablere lengde og bredde.
    MERK: Tumor latenstid er vanligvis 20 - 50 dager, avhengig av cellelinjen.
  5. Beregn tumor våte volum ved standard metoder (V = (bredde) 2 x lengde / 2).
    MERK: Selv om denne studien sammenlignet tumorgenisiteten av tics versus heftende celler for første generasjon bare, in vivo serieaging av tics dyrket under lignende forhold har blitt fullført av andre 11,20.

Representative Results

Etablert ovarian cancer-cellelinjer og en primær ascites cellelinje dyrket i tradisjonelle adherente dyrkningsbetingelser i nærvær av serum vis festet, brostein morfologi, mens de samme cellene dyrket i TIC kulturbetingelser display flytende sfæroid morfologi, vanlig i TIC populasjoner. Lysfelt bilder som vises i figur 1 A viser tydelig de morfologiske forskjeller i kultur forholdene. Figur 1B viser differensierte morfologi oppnås etter replating de ACI-23 og TGS-tre TIC kulturer i tradisjonelle tilhenger forhold. Bare 24 timer etter seeding tilbake i tilhenger forhold, et flertall av de flercellede kuler distansere og fester seg til overflaten, likner typiske heftende celler.

Å verifisere at TIC forholdene berike for celler med stamcellemarkører flowcytometri analyse ble utført med to vanlige markører av eggstokkene tics - CD133 expression og ALDH aktivitet. Prikkplott vist i figur 2 A markere økt andel av CD133 + celler i lav vedlegg, serumfrie forhold. På samme måte aktiviteten av enzymet ALDH er høyere i disse betingelser sammenlignet med tradisjonelle adherente dyrkningsbetingelser. Selv om de tradisjonelle heft kulturer inneholde CD133 + celler, de prosentvise økninger under forhold som forbedrer spheroid formasjon. Analyse av en pluripotency markør, TRA-1-60, gir ytterligere støtte for at TIC forholdene berike for tics, figur 2 B. Kvantifisering i figur 2 C viser at dobbelt positive (CD133 + ALDH +) ACI-23 celler er i stor grad begrenset til kulturer dyrket under TIC styrke forhold. Endringer i protein nivåer av ulike transkripsjonsfaktorer som oppstår i ACI-23 celler etter fem dager med kultur i TIC forholdene ble også undersøkt. En progressiv økning i hver av markørens er sett fra tradisjonelle til floater TIC vilkår i forhold til de relativt lave nivåer sett i tilhenger kultur, Figur 2 D. Interessant en menneskelig ascites cellelinje vokst i de ulike forhold viser den høyeste markør fenotype under de tradisjonelle TIC forhold med lite eller ingen flekker stede i floater TIC forhold, Figur 2 E.

Den tumorgenisitet av TIC dyrkningsbetingelser ble validert ved subkutane injeksjoner av et likt antall levedyktige celler oppnådd fra alle forhold til kullene av atymiske nakne mus. Figur 3 viser at ACI-23 (a, b) og OVCAR-5 (C) celler fra tradisjonelle tilhenger kulturer var mindre tumorigent enn de fra TIC kulturer. Merk at floater TIC kulturer produsert større svulster i en kortere periode enn de tradisjonelle tilhenger eller tradisjonelle TIC kulturer. Disse data antyder at selv med en moderat økning i eggstokkene TIC markører, er det en dramatisk fenotypisk endring. Men med andre cellelinjer (ikke vist) som de tradisjonelle TIC kulturer var mer tumorigen enn de tradisjonelle adherente og flyter TIC kultur celler.

Figur 1
Figur 1. Spheroid utvikling i ulike dyrkningsforhold. (A) Etablert eggstokkreft cellelinjer (ACI-23, OVCAR-5 og CAOV3) og primære pasient avledet ascitesceller (TGS-3) dyrket i lave feste kolber med serum-fri stamcelle media lett danne flercellede kuler. Bildene viser tradisjonelle tilhenger dyrkningsforhold opprettholde epithelial brostein morfologi i ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 og TGS-tre celler, mens de samme cellene dannet kuler innen 96 timer i TIC forhold. Skala bar 100 mikrometer. (B) Etter 24 timers eksponeringtil tradisjonelle tilhenger dyrkningsforhold, de TIC kultur morfologi vise en differensiert fenotype som ligner den opprinnelige tilhenger morfologi. Skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Low-vedlegg, serumfrie forhold berike for celler med TIC markører. (A) Flowcytometri analyse av ACI-23 celler ved hjelp av APC konjugert CD133 antistoff demonstrerer en økt andel av CD133 + celler i lave feste kolber med serumfritt stilk celle media. Flowcytometri analyse ved hjelp Aldefluor analyse viser økt ALDH aktivitet i celler dyrket i lave feste kolber med serum-fri stamcelle media. CD133 negative kontrollen inneholder ingen antistoff og ALDH negativ conkontroll er det aktiverte substrat i nærvær av ALDH-inhibitor (DEAB). (B) Analyse bruker FITC konjugert TRA-1-60 antistoff demonstrerer høyeste andelen av TRA-1-60 + celler i floater TIC forholdene i ACI-23 celler. Negativ kontroll inneholder ingen antistoff. (C) CD133 + ALDH + celler er høyest i tradisjonell TIC og floater TIC forholdene i ACI-23 cellelinje. Feilfelt: SEM, N = 6, * p <0,05. (D) Western blot-analyse som viser økning i proteinnivåer transkripsjon markører av stamceller i ACI-23 celler dyrket i TIC betingelser i 5 dager. Hele cellelysater (50 ug) ble analysert med GAPDH som en lastekontroll. (E) Representative prikkplotter av TGS-tre primære ascitesceller analysert som i A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 3. Low-vedlegg, serumfrie forhold berike for celler med økt tumorigenisitet. (A) 5 x 10 5 levedyktige ACI-23 celler ble subkutant injisert i atymiske nakenmus i tre eksemplarer. Musene ble veid og tumorer målt ved målepunktet to ganger ukentlig. A = Tradisjonelle vedheftende kultur, F = Flyteren TIC kultur, S = Tradisjonelle TIC kultur. * P <0,05. (B) Representative bilder av svulster som dannes fra ACI-23 etter 25 dager ved hjelp av celler dyrket under ulike dyrkingsforhold. (C) 5 x 10 5 levedyktige OVCAR-5 celler ble subkutant injisert i atymiske nakenmus i tre eksemplarer og følges opp i A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Protokollen er beskrevet her presenterer en effektiv og konsistent metode for berikende kulturer for celler med stamcelle funksjoner fra etablerte eggstokkreft cellelinjer og gjelder for pasientprøver primære. Denne metoden med hell beriker for tics tvers av en rekke cellelinjer. Det gjør det mulig for rettidig identifisering av forhold som beriker for en TIC og / eller tumorigent fenotype, uten å ta tid å fysisk sortere tics fra ikke-tics i befolkningen. På denne måte kan relative nivåer av ulike signalveier bli vurdert for deres bidrag til TIC fenotype ved å sammenligne tradisjonelle adherente kulturer til TIC kulturer ved hjelp av en rekke funksjonelle analyser. Hvis en ren TIC populasjon er ønskelig, kan isolering enkelt oppnås ved å inkorporere en fluorescens-assistert eller magnetisk sorteringstrinn i flowcytometri protokollen.

Det er viktig å huske på, men at uttrykket av TIC markørs, for eksempel CD133, CD44, eller ALDH, kan variere mellom cellelinjer eller pasientprøver selv av samme krefttype. For eksempel har vi funnet at de OVCAR-5-celler har høyere ekspresjon av CD44 i forhold til CD133, mens det omvendte er tilfelle for ACI-23. Det er derfor relevant å stole på tumorstart hos mus, og strømningscytometri-analyse som definitive av TIC tilstedeværelse. Etter denne protokollen, ble høy ALDH aktivitet konsekvent observert når eggstokkreft celler ble dyrket i stamcelle forhold. Interessant er CD133 uttrykk gående høyere i ACI-23 celler dyrket i tradisjonelle TIC kultur forhold, mens ALDH er høyest i floater TIC forhold. I motsetning til TGS-tre primære ascitesceller viser en liten økning i CD133 positivitet i henhold floater TIC forhold, men en bemerkelsesverdig økning i ALDH aktivitet i henhold til tradisjonelle TIC forhold. Disse funnene markere heterogenitet av eggstokkreft celler og plastisitet vanligvis forbindes med tics. For å støtte cla videreim at disse metodene forbedre tics, ble berikelse av TRA-1-60 positive celler også observert. TRA-1-60 er en pluripotency markør og har blitt brukt for å identifisere embryonal karsinom i ovariene og testikler samt prostatakreft TICS 30-32. Selv om våre metoder har vært vellykket med mange cellelinjer, er det mulig at standard TIC forhold kan være bedre egnet til noen eggstokkreft celler, mens de modifiserte floater forholdene bedre berike for tics i andre eggstokkreft cellepopulasjoner. Dette understreker igjen den forventede heterogenitet innenfor både pasient avledet og etablerte eggstokkkreft cellelinjer.

I tillegg til celleoverflatemarkører er det flere transkripsjonsfaktorer som har vist seg å karakter eggstokkreft tics inkludert Nanog, Sox2, Oct-4 11, selv om disse markørene er ikke spesifikke for eggstokkreft tics og heller representerer faktorer som er viktige for embryonal stamcelle pluripotency og differentiation 33,34. Vi undersøkte endringer i protein nivåer av disse faktorene og funnet ut at Nanog nivåene øker i TIC kultur forhold, i samråd med andre 13,35 samt CD133, TRA-1-60, og CD117. Et menneske stamcelle markør cDNA rekke viste videre en økning i CD133, Nanog, Melk, og PODXL genene i de klimatiske forhold i forhold til tradisjonelle tilhenger forhold. Viktigere, bør det bemerkes at, som med celleoverflate-markører, kan transkripsjons-faktorer assosiert med eggstokk tics varierer mellom cellelinjer og pasientprøver.

Vi har observert at cellene kan være mer tumorgene og uttrykke høyere nivåer av stamcellemerker hvis de er iboende ikke-klebende in vitro (dvs. flytende celler som ikke lett kan festes til en fastsittende plate). I kultur, cellelinjer som ACI-23 typisk ha mange levedyktige flytende celler og / eller celler som vokser vertikalt i en stablemote henhold tradisjonelle kultur conditioner. Selv vellykket berikelse av tics fra flytende celler og aggregater kan være gjeldende for relativt få cellelinjer inkludert de i denne studien og OVCAR-3 12, våre funn tyder på dette kan representere en mer tumorigent befolkning. Derfor, høsting av "flytende" populasjon av celler dyrket i standard vevskulturplater og medier kan tjene som en alternativ metode for anrikning TIC, for celler som tilpasser seg dårlig til kommersiell stamcelle medier.

Bruk av de ulike kultur metodene som presenteres i dette manuskriptet vil muliggjøre rask berikelse av TIC populasjoner og en bedre forståelse av hvilke faktorer støtte denne fenotype i forskjellige celler. Aktuelle anvendelser av denne fremgangsmåte er karakteriserende signalveier som er avgjørende for å støtte forplantningen av denne unike populasjon av celler. Resultatene fra disse studiene vil bidra til å avklare mekanismer for tumorprogresjon og tilbakefall.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
  2. Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
  3. Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
  4. King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
  5. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  6. Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
  7. Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
  8. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
  9. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
  11. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  12. Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
  13. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
  14. Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
  15. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
  16. Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
  17. Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
  18. Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
  19. Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
  20. Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
  23. Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
  24. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
  25. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
  26. Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. (2014).
  27. Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
  28. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
  29. Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
  30. Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
  31. Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
  32. Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
  33. Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
  34. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
  35. Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics