测定冷灵敏度和适应小鼠一种简单廉价的方法

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

在啮齿类动物中测量冷响应为正常和病理条件下改善的冷敏感性的潜在机制的理解在人类重要的。冷足底测定(CPA),最初开发几年 ​​前1,被设计为生成可再生的,明确的小鼠的行为反应,以冷的刺激在RT递送。更近的本测定法的改进已经允许冷灵敏度的再现性的测定在一个宽温度范围内的2。这两个版本也被设计成相对高的通量,且廉价使用。

了很大的进步已取得理解冷灵敏度的机制使用其他行为的方法。一种方法是将丙酮蒸发试验,这涉及到涂抹或鼠标爪子喷洒丙酮和测量的时间,该鼠标花费轻弹爪3,4的量。不幸的是,该反应的丙酮蒸发由湿感和丙酮的气味混淆。此外,即在丙酮蒸发试验施加冷刺激可以基于施加的丙酮的量而变化,并且是难以量化。最后,未受伤的小鼠具有最小响应丙酮在基线,使它不可能测量镇痛在没有敏感症的这种方法。

另一个经典测定法冷的反应是在甩尾试验中,在那里的等待时间停药后的尾部浸入冷水5,6被测量。而在此测定的行为反应是明确的和测定测量的响应,以特定的温度,动物必须在测试期间被限制,从而可以改变通过充分描述应力诱发镇痛机构7冷响应能力。

另一种常用的工具是冷板试验,其测量行为小鼠的应答后,便被放置在一个珀尔帖冷却板8-10。虽然这种工具提供有关在特定温度下的动物的反应的信息,它也被不一致地使用;不同的群体有不同的测量类型的反应,包括一些跳跃8,11的,延迟到第一反应8,11- 13,和爪的数量提升11,13,14具有非常不同的结果。冷板试验是还可以在一个时间进行测试比较低的吞吐量,因为只有一只动物,它需要使用昂贵和脆弱的珀尔帖装置。

2-板温度偏爱测试是冷板试验,其测量时间的相对量,动物花费在不同温度9,15- 17的2连板的常用衍生物。另一个类似的常用分析方法是热梯度测定中,时间在那里的小鼠花费在不同温度区的数量在一个长的金属板之间5℃和45℃的范围内进行测量16。虽然这些测定法允许的温度比较,目前还不清楚的行为是否代表温度厌恶或对温度的偏好。

最后,将动态冷板试验已被用来测量小鼠对不断变化的环境温度下18如何响应。该方法包括将小鼠RT Peltier装置上斜坡下来,以1°C,同时测量小鼠多少跳或舔爪子在不同的板温度。虽然这种测试的小鼠如何适应冷却的环境中,它不提供一个方法来测试在冷却器环境温度的设定,以冷的刺激小鼠如何作出反应。另外,它需要昂贵的设备来执行,并且不提供一种方法测量其冷敏感性之前驯化小鼠的检测设备。

为了配合这些试验,注册会计师测试ACCLIMA泰德响应一个明确定义的冷刺激,在各种温度范围,或在适应寒冷的环境温度下的过程。它可以测试多达14只小鼠在现今的装置的时间,与要廉价地扩大规模用于高通量试验的潜力。

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Protocol

所有的鼠标协议均符合卫生指引国家机构,并批准了华盛顿大学医学院的动物研究委员会(圣路易斯,MO)。

1.准备测试板和外壳

  1. 清洁过的玻璃表面。
  2. 固定在T型丝热电偶探头的表面在玻璃板与实验室磁带的中间。
  3. 放置在玻璃板上的动物罩在沿板的中间一行。
  4. 通过该中心的动物外壳螺纹热电偶探头和插入数据记录器。转动而停用自动关机功能上的数据记录器,并附加数据记录仪到计算机提供的电缆。
    1. 如果在实验过程中记录板温度,打开数据记录软件开始录制板温度。
    2. 如果有必要,调整软件重新线板温度每秒一次。
    3. 开始录制用打包带的热数据记录器软件温度。
  5. 与黑色插入机箱分离,以防止老鼠之间的视觉交互。
  6. 位置镜玻璃,使得所述外壳的下侧是从舒适的就座位置可见的下方。

2.变暖/冷却玻璃板

  1. 填充铝框用温热水,湿冰或干冰,并将它们在玻璃板适当地定位(填充有干冰铝箔包也可以被用于冷却玻璃; 1)2。
    1. 用于测试在30℃下,约定位铝框0.25''远离动物罩( 2B)2。
      1. 在玻璃板的两侧设置了加热水循环。设置在环行器45 - 60℃,我们Ë它填补了铝合金箱用热水( 1C)2络绎不绝。
      2. 定位循环,使得热水从铝框水渠直接返回到循环器的每一侧( 图1C)的贮存器2。
    2. 用于测试在室温,离开拖曳空( 2)2。
    3. 为了测试在17°C,大约放置箱子0.25''离两边的动物外壳和填充湿冰( 2)2。
    4. 为了测试在12°C,大约放置箱子1.25''离两边的外壳和填充用干冰( 2)2。
    5. 为了测试在5℃,放置盒约0.25''离两边的外壳和填充用干冰( 2)2。
      1. 当冷却的玻璃用干冰,确保有足够的通风,以防止二氧化碳积聚在房间里。
  2. 等待玻璃以达到所需的温度范围。
  3. 老鼠添加到上盘的外壳。
    注:白噪声发生器可用于减少噪音干扰。
  4. 等待老鼠适应。
    注:在我们的设施这需要大约2.5小时,但是这可能基于动物住房和操作条件显著不同。
  5. 通过确保拖曳保持充分的温热水,湿冰或干冰保持玻璃在所需的温度范围内。
    注:使用我们的设备的箱子需要用冰,大约每90分钟进行补充。
    注意:对于17℃的条件下,它是有帮助的冰再填充之前清空大部分的水从铝框通过排水孔。这将稳定的温度更好,且Pr事件溢出
    注:在干冰的确切量会随季节变化,但在一般保持拖曳多于四分之一满沿盒子的整个长度将保持温度恒定。

3.测试小鼠在固​​定温度

  1. 行为的房间外,填补冰桶约半满的干冰。
  2. 用锤或槌,粉碎干冰成细粉。
    注意:过量加载斗将使它难以完全粉碎干冰成粉末。
  3. 使用直刀片或剪刀,削顶过3毫升注射器。
  4. 使用21g的针,戳在反对注射器(共6孔)两侧3个孔。
    注意:这些孔会降低通过升华所产生的压力而压缩干冰。截止注射器可重复用于多个实验。
  5. 取注射器,干冰粉末,和一个手持秒表进行为房间。
  6. 填充注射器室半满的干冰粉末。靠住平坦物体的注射器的切断端,以及使用该柱塞牢牢压缩的粉末。当心;塑料柱塞可弯曲或从压力破裂。如果发生这种情况,从一个新的注射器更换柱塞。
  7. 扩展压缩干冰丸粒的前端越过注射器的边缘。
  8. 测试小鼠完全处于静止状态。
    1. 在30℃,23℃和17℃,有所有4个爪子在玻璃上,而不是测试老鼠感动,但没有完全睡着了19。
    2. 在12°C和5°C,试验小鼠都在2爪子或4爪子,而不是移动或跳跃。
  9. 用镜子为目标,轻轻但坚定地按压鼠标后肢( 1A)2下的玻璃表面的平坦球平齐。启动手定时器。
  10. 停止定时器并取出粒料当鼠标移动远离冷却的玻璃。
    注:退回运动可以垂直或水平。
    1. 如果鼠标非常简要地移动爪子,然后它返回到冷却面,继续定时和刺激直到小鼠使一个永久搬走。
      注:我们的实验室使用20秒的最大刺激时间的小鼠在大多数情况下。
  11. 重复此测试过程,直到对每个动物的每个爪的至少3个值被收集。独立的试验中在相同的小鼠由至少7分钟,和单独的连续试验至少15分钟上的任何单一的爪检测相反的爪子。
  12. 如果需要的话,可以使用不同厚度的玻璃来产生的冷却( 3)1不同的速率。
    注:冷却速率成反比与玻璃的厚度相关。

4.测试小鼠在冷适应

注意:这是一个替代的协议,它允许测试作为玻璃高原ê冷却,而不是一旦板块企稳和老鼠已经完全适应了寒冷的环境。

  1. 按照第1节设立的设备列出的说明。
  2. 按照第3节所列采取基线测量在室温( 7A)2的说明。
  3. 预冷却的铝框用干冰。
  4. 一旦基线退缩潜伏期已测,上盘约1.25''远离机箱两侧放置预冷箱( 图7A,箭头标记为“干冰加上”)2。
  5. 按照第3节所列进行测量的玻璃板冷却后,进行测量尽可能多的指令。

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Representative Results

从小鼠引起开始在30℃,23℃,17℃,和12℃下的行为反应是高度可再现的( 4A)20。为了测量后爪下所产生的冷刺激,将小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪鸡尾酒和它们的爪子被固定在上一个T型热电偶丝( 4B)20顶部的玻璃。玻璃被冷却或加热至所需的测试范围。虽然该板被均匀地冷却沿所述板( 5A)2的长度但应注意的是,在整个行为罩( 5B)2,产生一个冷梯度。外壳是靠近干冰上机箱的两侧的部分是冷却器,而中央部分是稍暖( 5B)2。在最寒冷的气温üSED,小鼠花大部分时间在机箱的中部地区。一旦玻璃板的温度已经稳定,焦点干冰刺激被放置在爪/热电极下方的玻璃。基于来自此设置中记录的温度的痕迹,很显然,使用该CPA中产生的冷刺激是在各温度范围( 4C)20的高度可重复的。

在CPA中产生的冷刺激,使用三种不同厚度的玻璃,以改变冷却( 图3)的强度也测量。冷却速率是负相关的玻璃的厚度,和任何这些厚度可以根据需要使用( 图3)来测量冷敏感性。

以前的工作已经表明,该CPA可以检测镇痛和超敏反应小鼠。 1.5毫克/公斤吗啡皮下注射后30分钟,小鼠有显著升onger延迟停药比给予生理盐水皮下注射小鼠( 图6A:双因子ANOVA主效应* P <0.05和Bonferroni事后检验; 30分钟** P <0.01; N = 12每组)1。吗啡/生理盐水后60分钟,就有了生理盐水和吗啡注射组,这与吗啡代谢的小鼠的速率一致的没有区别。

完全弗氏佐剂(CFA)先前已显示后爪注射21后引起的炎症和超敏反应。后CFA注射,会计师退缩潜伏期降低2和3小时后喷射( 图6B:双因子ANOVA主效应P <0.001和Bonferroni事后检验; 2小时* P <0.05,3小时** P <0.01 N = 12%组)。 4小时CFA注射后,对小鼠给予1.5毫克/公斤吗啡皮下注射。吗啡注射剂,既CFA-和生理盐水注射的小鼠增加了withdr后30分钟回历在3小时的延迟相对于它们的延迟( 图6B:1单向ANOVA和Dunnett的事后检验; CFA 3小时 CFA 4.5小时$$$ P <0.001,盐水3小时生理盐水4.5小时$$$ P <0.001)。一小时后,一旦吗啡已代谢,所述CFA注射的小鼠再次有较低的退缩潜伏期比盐水注射的对照小鼠( 图6B:2单向ANOVA和Bonferroni事后检验; ** P <0.01) 1。

大多数哺乳动物物种具有适应其温度敏感性,以满足他们的环境的能力。 在体外 ,研究表明,这种适应过程是依赖于画中画2水解22- 24,但以前的行为的工具无法验证此假设在体内的 CPA能够以两种不同的方式量化这种适应。通过测试小鼠的退缩潜伏期作为玻璃冷却( 2。在正常条件下的退缩潜伏期是不变的板冷却,这表明冷适应发生比可以与CPA( 图7B来量化更快:0分钟= 12.13±0.8秒时,30分钟= 12.1±1.6秒时,60分钟= 13.2 ±1.1秒时,90分钟= 10.8±1.2秒1单向ANOVA和Bonferroni事后检验P> 0.05,N = 6)2。然而,当小鼠中的板之前给出足底内的磷脂酶C抑制剂U73122 25的注射被冷却( 图7C)的退缩潜伏期被减少,这表明适应受损( 图7D:基线= 11.29±0.53秒,30分钟= 8.09±1.17秒; 1路ANOVA与Dunnett的事后检验,主要功效P = 0.02,单个基准主场迎战 30分钟,P = 0.02,N = 9)。

注册会计师还可以测量ABility以适应寒冷的环境温度以上的很长一段时间。当野生型小鼠使用CPA在30℃,23℃,17℃,或12℃下被驯化3小时后测试的退缩潜伏期是相同的,在所有的起始温度下,这表明与野生型老鼠适应寒冷的环境温度( 图2A:WT 30°C = 13.23±0.5秒,23°C = 12.8±0.7秒,17°C = 12.3±0.9秒,12°C = 12.8±0.5秒,1单向ANOVA和Bonferroni事后检验,p> 0.05,N = 6进行30℃,15例为23℃,17℃,12℃)20。不同于野生型小鼠中,作为起始温度降低TRPM8-KO小鼠的退缩潜伏期降低,这表明它们是无法适应他们的响应阈值,以适应其环境( 图8:1-方式重复测量ANOVA和Bonferroni后hoc检验;男性主要作用P = 1.5×10-5,12℃,VS。 23℃,P = 6×10 -5,17℃, 23℃,P = 0.004;女性主要作用P = 3.6×10 -5,12℃, 23℃,P = 9.25×10 -5,17℃, 23℃,P = 0.0005; DF = 1,N = 11名男性和11名女性)20。

图1
图1.冷足底分析(CPA)装置2。(A)示意图执行注册会计师。小鼠被驯化的塑料外壳行为玻璃板,直到他们都在休息。干冰丸粒被施加到后爪下的玻璃的下侧,并且延迟到从冷却玻璃测量撤回。 (B)中的图片CPA装置中,在配置于冷却板至5℃。热数据记录器是在外壳的中心和铝框侧翼在任一侧的外壳。 (C)的图像的CPA装置中,在配置中的地暖板到30℃。水循环流动热水到铝框,然后流出的一侧的漏回循环器的贮存器。从布伦纳等人 2014年2许可复用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图中的玻璃板的CPA 2(A)的期间2温度的平均值的玻璃板的温度描记过程中行为实验在CPA。 30℃,N = 1,23℃,N = 5,17℃的N = 7,12℃,N = 7,4℃,N = 5(B)原理图,数字高程模型onstrating如何产生不同的温度条件下在CPA。从布伦纳等人 2014年2许可复用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.玻璃厚度成反比关系与冷却1的速率。(A)的示意图图表的实验设计(BD)。在爪下方冷刺激脚底的温度,测定在所有三个玻璃厚度在正常条件下,而其中泡沫聚苯乙烯衬垫支撑爪远离玻璃表面。在所有情况下,支撑爪远离玻璃造成在爪测得的冷的刺激(每组n = 6玻璃厚度)显着降低。 ( 等人 2012 1的重复使用许可请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. CPA退缩潜伏期是一致的20。(A)的平均潜伏期为23℃,17℃,或12℃,开始小鼠。 (B)的配置来衡量CPA冷的刺激。麻醉小鼠的爪固定在玻璃板上用实验室磁带上顶一个T型热电偶丝。注册会计师的刺激被放置在这两个爪和热电偶下方玻璃的下侧。在CPA产生的(C)温度为30℃,23℃,17℃,或12℃的开始。黑色箭头代表平均退缩潜伏期为清醒小鼠在每个条件。重复使用从Brenner 权限。 2014年2。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.玻璃板温度是在CPA 2(A)热电偶T1(黑色) 相一致被放置在板的中心。热电偶T2(红色)置于行为外壳最靠近板的右边缘。温度TRAcings和图形最右侧(T1-T2)示出几乎相同的温度,在t1和t2在整个实验过程中。 (B)的热电偶T1(黑),放置在板的中心。热电偶T2(红色)被放置在中央的行为的外壳,在壁更靠近干冰填充铝框。温度描记和图形最右侧(T1-T2)表明,有t1和t2之间的大致3℃的差异,一旦板已经达到了稳定的温度。重复使用从Brenner 权限。 2014年2。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.注册会计师可以测量镇痛和过敏1。(A)Subcutaneous注射1.5毫克/公斤吗啡增加小鼠的30分钟后注射的退缩潜伏期(2单向ANOVA和Bonferroni事后检验; 30分钟后喷射** P <0.01)。 60分钟注射后,有吗啡注射和盐水注射的小鼠之间没有显著差异。 (B)的足底内注射10微升完全弗氏佐剂(CFA)降低小鼠2和3小时后喷射的退缩潜伏期(2单向ANOVA和Bonferroni事后检验; * P <0.05,** P <0.01)。所有小鼠给予吗啡皮下注射在4小时,并都退缩潜伏期在4.5小时均显著高于3小时进行比较(1单向ANOVA与邓尼特的事后检验; $$$ P <0.001)。注射CFA(吗啡注射后1.5小时)后5.5小时,CFA注射的小鼠仍然有较低退缩潜伏期比盐水注射小鼠(2单向ANOVA和Bonferroni事后检验; ** P <0.01)。重复使用的许可布伦纳等人20121。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
图7.测量冷适应作为玻璃板动态冷却20。(A)示意图,用于执行注册会计师作为玻璃板被冷却。基线的温度是在室温测量时,所述干冰的容器被添加到板,并撤出延迟被测量为在玻璃板冷却。 (B)的野生型小鼠具有相同的退缩潜伏期作为玻璃板冷却,这表明它们适应冷却温度的速度比可以与CPA(基线来测量= 12.8±0.3秒时,30分钟= 13.67±0.9秒,60分= 11.03±1.0秒,90分钟= 11.31±0.6秒,N = 3只;单因素方差分析和Bonferroni事后检验,各组间无显著差异)。 (C)的示意图,用于执行注册会计师作为玻璃板被冷却时,PLC抑制剂U73122或对照化合物U73343的足底内注射后。 (D)的小鼠有显著下退缩潜伏期,而板被U73122注射后的冷却,这表明U73122干扰,以适应冷却的环境温度的能力。从布伦纳等人 2014年20许可复用。该图已被复制与疼痛的研究国际协会(IASP)的许可。图中, 不得转载用于未经允许任何其他目的。 请点击此处查看该图的放大版本。

“图8”SRC 图8. TRPM8-KO小鼠不太适应环境冷却20 TRPM8-KO小鼠测(2路ANOVA和Bonferroni事后检验全部开始温度有较高的退缩潜伏期比野生型窝; *** P < 0.001)。 TRPM8-KO小鼠的退缩潜伏期也减小作为起始温度降低(1单向ANOVA和Bonferroni事后检验; ## P <0.01,### P <0.001),而没有在撤回没有显著变化的野生型同窝作为起始温度降低延迟。从布伦纳等人 2014年20许可复用。该图已被复制与疼痛的研究国际协会(IASP)的许可。图中,不得转载用于未经允许任何其他目的。 请CLICķ此处查看该图的放大版本。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

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