Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Målet med denne protokollen er å isolere lymfatiske endotelceller lining menneskelige lymfesystemet misdannelsescystelignende fartøy og forhud bruker fluorescensaktivert celle sortering (FACS). Påfølgende celledyrking og utvidelse av disse cellene tillater et nytt nivå av eksperimentell raffinement for genetiske, proteomikk, funksjonelle og celle differensiering studier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lymfatiske lidelser som primær lymfødem, lymfatiske misdannelser og lymfatiske svulster er sjeldne tilstander som forårsaker betydelig sykelighet, men lite er kjent om deres biologi. Isolere svært rene menneskelige lymfatiske endotelceller (LMU) fra syke og friske vevet ville lette studier av lymfesystemet endotelet ved genetiske, molekylære og cellulære nivåer. Det er forventet at disse undersøkelsene kan avdekke mål for nye behandlingsformer som kan endre den kliniske behandlingen av disse tilstandene. En protokoll som beskriver isolering av humant forhuden LMU og lymfatiske misdannelses lymfatiske endotelceller (LM LECS) er presentert. For å få en enkelt celle suspensjon vev ble hakket og enzymatisk behandlet ved hjelp dispase II og kollagenase II. Den resulterende enkeltcelle-suspensjon ble deretter merket med antistoffer mot klynge av differensiering (CD) markørene CD34, CD31, vaskulær endotel vekstfaktor-3 (VEGFR-3) og PODOPLANIN. StaiNed levedyktige celler ble sortert på et fluorescensmerket aktivert cellesorterer (FACS) for å skille den lavt CD34 CD31 Pos VEGFR-3 Pos Pos PODOPLANIN LM LEC populasjon fra andre endotel- og ikke-endotelceller. De sorterte LM LMU ble dyrket og utvidet på fibronectin-belagt kolber for videre eksperimentell bruk.

Introduction

En viktig funksjon av det lymfatiske vaskulære systemet er å absorbere lymfe, et overskudd interstitiell væske som inneholder lipider, proteiner og cellulære komponenter, og lede den til den venøse blodsystemet. Et nettverk av lymfatisk kapillærer dirigerer lymfe til lymfeknuter der det er skjermet for tilstedeværelse av fremmede antigener, en viktig prosess i immunovervåkning og distribusjon av hvite blodlegemer til å nøytralisere fremmede antigener.

Den ensrettede lymfesystemet begynner i vev med den første lymfatisk kapillært, en unik struktur med en usammenhengende enkelt lag med tynne vegger flate endotelceller med spesialiserte celle veikryss som tillater lymfe oppføring 1,2. Disse kapillarene er festet til nabobindevevsmatrise via forankringsfilamenter for å hindre at fartøyet kollaps i nærvær av økt trykk interstitielt 3. De første lymfatiske kapillærene tømmes i innsamling lymfatiske kapillærersom vokser sammen til større lymfekar eller årer. I forhold til første lymfatiske kapillære fartøy, samle lymfekar har tykkere fartøy vegger, sammen lymfatiske ventiler og er omsluttet av en diskontinuerlig basalmembran der noen glatte muskelceller er innebygd 4. Samordnet åpning og lukking av ventiler og lymfatisk sammentrekning av glatte muskelceller forenkler strømning av lymfe 3. Hos mennesker lymfatiske årer fra ulike regioner av kroppen bli med å danne lymfatiske badebukser som fusjonere for å danne to lymfatiske kanaler: thorax kanalsystem og retten lymfatiske kanalen. Thorax duct drenerer lymfe fra venstre side av kroppen og fra høyre side under brystet mens den høyre lymfatiske kanal avløp lymfe fra høyre arm og høyre side av hodet, nakke og brystkasse. Begge kanalene gjennomføre lymfe inn i subclavia årer i nakken 5.

Forstyrrelser i lymfesystemet er bredt gruppert i ervervetnd medfødt (tabell 1). Eksempler på ervervede forholdene er lymphangitis og sekundære lymfødem. Lymfangitt er en betennelse i et lymfekar grunnet bakteriell infeksjon. De berørte lymfekar Utvid og fyll med sårvæsken inneholder polymorfonukleære celler. I huden, disse lymfekjertlene er synlige som rødt, smertefulle subkutane striper ofte ledsaget av utvidelse av den tilhørende drenering lymfeknute (lymfadenitt) 6. Sekundært lymfødem oppstår som følge av skade eller hindring for lymfekar eller lymfeknute obstruksjon. Dette fører til kronisk progressiv svelling på grunn av opphopning av lymfe distalt til skade eller blokkering. I utviklede land er sekundært lymfødem oftest assosiert med malignitet hvor metastasizing svulster hindre lymfekar eller regionale lymfeknuter, eller som følge av anti-kreft terapi etter kirurgisk fjerning av lymfeknuter, post-bestråling fibrose og post-inflammatorisk thrombosis og arrdannelse 7. I andre deler av verden, kan sekundære lymfødem være sekundært til lymfatisk obstruksjon forårsaket av parasittiske ormer som Wuchereria bancrofti 6.

Forstyrrelser i Lymphatic karsystemet
Ervervet Medfødt
Lymfadenitt
Sekundært lymfødem
Primær Lymfødem 10 Sporadiske lymfatiske Misdannelser 13 Lymfatisk Misdannelser Associated med syndromer 13
f.eks
Milroy syndrom
Meige syndrom
Enkelt:
Lymfatiske misdannelser
f.eks
Klippel-Tranaunay syndrom
Parker Weber syndrom
Sturge-Weber syndrom
Kombinert:
Kapillær-lymfatiske misdannelser
Kapillær-lymfatisk-malformasjon
Kapillær-lymfatisk-arteriovenøs malformasjon
Kapillær-lymfatisk venøs-arteriovenøs malformasjon

Tabell 1. Oversikt over de lidelser av lymfatisk karsystemet.

Medfødte sykdommer i lymfesystemet omfatter primær (idiopatisk) lymfødem antatt å være forårsaket av genetiske mutasjoner, lymphangiectasia og anomalier i lymfesystemet 8,9. Primær lymfødem kan være sporadisk antagelig forårsaket av de novo mutasjoner, eller arvet. Lymfatiske lidelser kan også være isolert eller utgjør en del av en mer generell syndrom 10. Hos barn, 97% av lymfeødem er sporadisk med unormalt i lymfekar struktur som svekker regional lymfedrenasje 11. Milroy sykdom er et eksempel på primær lymfødemer forårsaket av mutasjon i VEGFR-3-gen tydelig ved fødselen eller kort tid etter 12. Selv om det meste familiær tilstand, kan Milroy sykdommen også identifiseres i spedbarn uten familiehistorie med Milroy sykdom 32. Alvorlighetsgraden av enhver lymfødem er avhengig av mengden av lymfe produksjon og evne til å transportere lymfe tilbake til venøse sirkulasjon 6.

Basert på klinisk presentasjon og in situ endotelcelleproliferasjon, er anomalier av lymfesystemet klassifisert som lymfatiske svulster eller lymfatiske misdannelser 13. Kaposiform lymphangiomatosis er et eksempel på en LEC tumor 14. Lymfatiske misdannelser antas å oppstå under embryonal utvikling og vekst i forhold til barnet 15,16. De sjelden regress men kan remain asymptomatisk inntil trauma eller infeksjon utfellinger rask vekst fører til kliniske komplikasjoner. Den ryddig struktur av lymfatisk nettverk og gjennomføring av lymfe fra vevet til venøs sirkulasjon beskrevet ovenfor trengt på lymfatiske misdannelser som består av lokale samlinger av unormale cystisk strukturer fylt med lymfe. Mens det er ingen kliniske eller eksperimentelle bevis for at disse cystisk fartøyene er forbundet til det lymfatiske sirkulasjon eller at de inneholder funksjonelle lymfatisk ventiler, er deres lymfatisk identitet bekreftes ved ekspresjon av utvalget av lymfatiske cellemarkører som PODOPLANIN, CD31, lymfekar endotel Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) og VEGFR-3 15,17,18. Disse cystisk strukturer kan enten være liten (microcystic) eller stor (macrocystic), men de fleste lymfatiske misdannelser inneholde både microcystic og macrocystic komponenter (figur 1) 16. Etter operasjonen, injeksjonn sclerotherapy og / eller radiofrekvensablasjon lymfatiske misdannelser ofte oppstår på nytt.

Figur 1
Figur 1. Morfologi av menneskelige lymfekar og lymfatiske misdannelser. Normal menneskelig lymfatisk (A) og lymfatiske misdannelses skip (B og C) merket med antistoff mot PODOPLANIN (brun etikett, pil). Menneskelige lymfatiske misdannelses fartøy er preget av markant utvidelse og stor variasjon i lumen størrelse. Disse lokaliserte unormale cystisk strukturer kan enten være små (microcystic, *) (B) eller stort (macrocystic, #) (C). De fleste lymfatiske misdannelser inneholde både microcystic og macrocystic komponenter. Klikk her for å se en større versjon av figuren. </ P>

Noen forskere har antydet at lymfatiske misdannelser representerer en utviklingsforstyrrelse av lymfatisk blodkar der LMU ikke har unormal vekst potensial, men i stedet har ikke klart å koble til normal sirkulasjon 19. Vi har imidlertid funnet at LM LMUene spre seg hurtigere og er mer resistente mot apoptose enn skin LMUene 15 noe som tyder på at det er en primær defekt i LM LMUene. Når LM LMU er implantert i en mus xenograft modell, danner de strukturer som minner om lymfatiske misdannelser 15. Dette støtter en hypotese om at lymfatiske misdannelser kan være forårsaket av en eller flere somatiske mutasjoner som oppstår i LM LMUene under fosterutviklingen. Faktisk har de siste rapportene identifisert en slik mutasjon i p110α katalytisk subenhet av phosphoinositide-3-kinase (PIK3CA) genet 20.

Gitt de fremskritt i DNA sekvenseringsteknologi, relevante mutasjoner could bli lettere identifiseres i isolerte LM LMU, guiding fremtidige studier av disse forholdene. Isolering av levedyktige LMUene ville lette sammenligninger mellom unormale og normale LMU i analyser som migrasjon, spredning, rør forming evne og overlevelse i respons til redusert næringsstoffer eller pro-apoptotiske agenter 15. Isolerte LMU vil videre gjøre oss i stand til å utføre cellespesifikke genuttrykk og proteomikk studier, for å avgrense nye LMU subpopulasjoner og oppdage nye farmakologiske midler egnet for klinisk behandling av lymfatiske misdannelser.

Vi har tidligere publisert en LEC isolasjonsmetoden basert på magnetiske kuler separasjon av LMU fra neonatal forhuden og lymfatiske misdannelser 15. Vi har rapportert en strategi for å skille normale og syke LMUene fra vaskulære endotelceller basert på fravær av CD34 ekspresjon, fulgt ved å utsette CD34 Neg cellefraksjon til positiv utvelgelse for CD31.Imidlertid ble denne metoden hemmet av nærværet av gjenværende ikke-endotelceller. Dette var uavhengig av fjerning av epidermis før etterfølgende bindevev fordøyelse. Disse forurensninger generelt proliferert hurtigere og dermed til slutt overgrew endoteliale cellekulturene til tross for etterfølgende forsøk på å gjenta LEC isolasjon. Faktisk, en første forurensning av ikke-endotelceller så lavt som 2% til 5% var tilstrekkelig til å overvelde LEC populasjonen 15. Dette fikk oss til å utforske fluorescently aktivert celle sortering metode som et alternativ til å forbedre LEC celle yield og renhet. I tillegg brukte vi multi-parameter sortering for å øke spesifisiteten av LMU populasjoner, og legger VEGFR-3 og PODOPLANIN til valg markører for å identifisere CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LMU.

Begrunnelsen for å velge disse markørene var basert på rapporter som mens LMU og blod vaskulær endotelial cells har mange markører celleoverflate felles som CD31, LMU viser fenotypisk variasjon i deres uttrykk av CD34, PODOPLANIN og VEGFR-tre celleoverflaten markør i forhold til blod vaskulære endotelceller 21-23. CD31 er et 130 kDa glykoprotein trans også kjent som blodplater endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1). Det er ansett å være en pan-endotel-cellemarkør, siden det er uttrykt på alle typer av blod- og lymfekar 21,24,25. CD34 er 110 kDa-transmembran-glykoprotein som finnes på de fleste hematopoetiske progenitorceller og stamceller, vaskulære endotelceller, og noen lymfekar 26.

VEGFR-3, reseptoren for vaskulær endotelial vekstfaktorer C og D, er som opprinnelig var tilstede i utviklings årer i mus embryo, men etter lymfatisk spesifikasjon regulert av transkripsjonsfaktorer SRY messige HMG-boksen (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f skuespiller 2 (COUPTF-II) og PROX-1, er VEGFR-3 venøs uttrykk tapt, og det blir begrenset til embryonale LMUene 25,27. PODOPLANIN, en 38 kDa membran mucoprotein, først bemerket på lymfekar på ca embryonale dag 11 (~ E11.0) av mus embryonale utvikling 28, og mens det er sterkt uttrykt av mikrovaskulære lymfekar, PODOPLANIN uttrykk ved macrocystic lymfatisk endotelet i lymfatiske misdannelser er mer variabel 15. Flowcytometri eksperimenter tyder på at i hvert fall noen CD34 Høy CD31 Pos endotelceller uttrykke lymfatiske markør PODOPLANIN 29. Selv om systematisk evaluering av LYVE-1 og PODOPLANIN farging i humane lymfatiske misdannelser viste at både er effektive ved beising lymfatisk endotel 30 misdannelse, i normalt vev, LYVE-1 ble rapportert å være sterkt til stede i den initiale lymfatiskekapillær endotel men reduseres og til og med fraværende i oppsamlings lymfatisk endotel 31. Som vår målsetting er å isolere både de første og samle lymfatiske endotelceller vi har valgt å ikke bruke LYVE-en som en del av vår celle utvalg strategi. Endelig beslutning om å ansette disse markørene var også basert på tilgjengeligheten av antistoffer som brukes diagnostisk for merking lymfekar for mikroskopisk bildebehandling, en funksjon som ville tillate sammenheng mellom flowcytometri og immunofluorescent studier.

Denne artikkelen vil beskrive vev fordøyelsen metoden, cellefarging og FACS innstillingene som kreves for vellykket isolering av CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LMU samt CD34 Høy CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos endotelceller fra forhuden og lymfatisk malformasjon vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Etisk godkjenning for innsamling av lymfatisk misdannelses og forhuden vev ble hentet fra menneskeforskningsetiske komiteer ved Royal Children Hospital, Melbourne, Australia. Signert samtykke ble mottatt fra pasientenes foreldre før operasjonen. Vevsprøver ble samlet inn fra pasienter diagnostisert med LMS som gjennomgår kirurgiske prosedyrer som del av sin kliniske behandlingen og pasienter som gjennomgår elektiv omskjæring. Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjer fra National Health and Medical Research Council, Australia.

1. Utarbeidelse av cellesuspensjonen fra Forhud og lymfatiske Misdannelse Vev

  1. Buffere og Media forberedelse.
    1. Forbered komplett endotelceller media bruker kommersielt tilgjengelige EGM-2 MV Bullet Kit ved å varme EGM-2 media og forsiktig tining de kit komponenter i 37 ° C vannbad. I klasse II biosikkerhet skap, aseptisklegge til hver komponent til EGM-2 media. Når alle komponenter er lagt til media, se dette mediet som "komplett endotelceller media". Bruk steril 50 ml pipette for å blande innholdet før bruk.
      MERK: Alle trinn knyttet til cellekultur er utført i en klasse II biohazard skap. Alle løsningene lagres ved 4 ° C i henhold til produsentens instruksjoner, og blir varmet opp til romtemperatur før bruk. Den komplette endotelcelle media, cellekultur buffere og enzymløsninger blir varmet ved 37 ° C i 20 min før bruk.
    2. Supplere komplett endotelceller media med 50 ng / ml VEGF-C. Delmengde den supplert endotelceller medier i 50 ml sterilt rør og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk. Mediet er stabil i minst fire uker når de lagres ved 4 ° C.
    3. Forbered kalsium og magnesium fri fosfatbufret saltvann (PBS) ved å oppløse 8,752 g NaCl, 1,416 g Na 2 HPO 4 .2H O og 20,395 g KH 2PO 4 i 1000 ml vann. Juster pH til 7,4. Filter sterilisere PBS bruker 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C. Før bruk legge antibiotika / antimykotisk løsning (brukes ved 1: 100).
    4. For å fremstille human fibronektin, oppløse 1 mg fibronektin i 10 ml sterilt vann. Lagres rekonstituerte oppløsningen i 100 mL alikvoter ved -20 ° C. På dagen for anvendelse Tilsett 10 ml steril PBS til 100 ul alikvot fibronektin (for å gi en sluttarbeidskonsentrasjon på 10 ug / ml).
    5. For enzymet media, fremstille en løsning inneholdende 0,04% Dispase II, 0,25% Kollagenase II og 0,01% DNase I i steril PBS. Først veie dispase og kollagenase, sted i et sterilt 50 ml rør, legge det nødvendige volum med PBS og inkuberes i 30 minutter med risting ved 37 ° C for å oppløse. Når oppløst, filter sterilisere (0,22 mikrometer filter) dispase / kollagenaseoppløsning i biosikkerhet hette. Tilsett aseptisk DNase I. Oppbevar enzymatiske oppløsning ved 37 ° C inntilbruke.
      MERK: DNase Jeg er en kommersiell cellekultur grade reagent tilgjengelig som steril lyofilisert pulver.

2. Utarbeidelse av cellesuspensjonen fra forhuden og lymfatiske Misdannelser

  1. Veie et 50 ml rør inneholdende 10 ml DMEM / 2% antibiotisk antimykotisk løsning. Dette rør vil bli brukt til vev samlingen.
  2. Etter kirurgisk fjerning av lymfatisk misdannelse og forhuden vev, aseptisk legge vevsprøve til røret og overføring på is til cellekulturen laboratoriet.
  3. Vei røret som inneholder vev og beregne vev vekt. Bruk av denne vekt til å beregne volumet av enzymatisk oppløsning som er nødvendig for å fordøye vevet.
  4. I en klasse II biosikkerhet skap, bruk steril pinsett til å overføre vev og medier i en 100 mm vevskulturskål. Bruk steril saks til fint hakke vevet inn ~ 1 mm 3 stk.
  5. Transfer hakket vev blandet med media into et 50 ml rør inneholdende ytterligere 10 ml sterilt DMEM / 2% antibiotisk antimykotisk løsning. Bland ved å re-suspen vevet. Sentrifuger prøven ved 300 xg i 5 min.
  6. Fjern supernatanten. Basert på vev vekt, tilsett 1 ml forvarmet (37 ° C) kollagenase II / DNase / Dispase II fordøyelse løsning pr 100 mg vev hakket. Generelt brukes 10 ml av enzymløsningen i ca. 1 g hakket vev.
  7. Inkuber vevet i en 37 ° C inkubator i 20-90 minutter med konstant risting ved 200 rpm. Ved slutten av denne perioden sikre at nesten alle av vevet er fordøyet i fine fragmenter.
    MERK: Eksponering av cellene til kollagenase og dispase ved isolasjon fra den primære vev påvirkninger celleoverlevelse. Vi har funnet empirisk at de fleste neonatale forhuden prøver optimalt krever 20-30 min med fordøyelsen, mens fibrotiske lymfatiske misdannelses prøvene kan kreve 60-90 min på fordøyelsen. LM LEC utbyttes er påvirket av mengden fibrose dag har mer bindevev givende færre celler, muligens på grunn av skadelige effekter av langvarig eksponering for collage II og dispase II.
  8. Etter fordøyelse, overføres røret til biosikkerhet kabinettet og passere fordøyd vevet løsningen gjennom et 70 um sil plassert i et sterilt 50 ml rør. Bruke 3 ml sprøyte stempel med gummipropp, slipe ned den gjenværende vev til bare små spor av ekstracellulære matrise er observert.
  9. Vask cellefilter med et volum på endotelceller medium ekvivalent med volumet av dissosiering enzym medium for å gjenvinne cellene fast til sil og for å inaktivere enzymene. For eksempel, i 2 ml dissosiere enzym medium til å fordøye hakket vev, tilsett 2 ml av endotelial cellemediet for å inaktivere enzymene.
  10. Sentrifuger celleløsning ved 300 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten. R> e-suspendere cellene i 10 ml PBS. Sentrifuger cellene ved 300 xgi 5 min, fjern supernatanten deretter gjenta celle vask to ganger. > Cellepelleten suspenderes i 20 ml av endotelial cellemedium. Cellene telles ved bruk av trypan blå deretter frø 2 x 10> 6 celler i 150 cm> to kolbe forhåndsbelagt med fibronektin i et sluttvolum på 20 ml av endotelial cellemedium. Kultur ved 37 ° C i en 5% CO> 2 i fuktet luft inkubator.>
    Merk: Det er forventet at 75% -90% av kjerneinneholdende celler som overlever vev fordøyelse som anslått ved trypan blå eksklusjon. Den initiale celletall reflekterer all nukleerte celler i cellesuspensjonen (dvs. keratinocytter, leukocytter, makrofager, bindevevsceller og blodkar-celler). Celletallet på 5-7 dager gjenspeiler celler som har festet, overlevd og prolifererte under cellekultur. Coating vevsdyrkingskolber med fibronektinet forbedrer også påfølgende LEC og LM LEC overlevelse.
  11. Etter inkubasjon over natten, vaske bort ubundne celler i tre vasker med PBS / 1% antibiotika-antimykotisk løsning og legge frisk endotelceller medium. Utføre tre vaskinger til effektivt å fjerne ubundet celler og røde blodlegemer som er tilstede i kolben. Endre media annenhver dag. Celler vil være ~ 80% sammenflytende etter 5-7 dager.

3. Antistoff Farging av Cells for Lymphatic endotelceller overflatemarkører for flowcytometrisystemer

  1. Etter at cellene har nådd 80% samløpet, aspirer medium og skyll cellene med PBS.
  2. Løsne adherente celler ved å inkubere celler med 7 ml celle løsgjøring løsning som Accutase per 150 cm2 kolbe i 5-7 minutter ved 37 ° C.
  3. Feiefrittliggende celler, inaktivere cellen løsgjøring oppløsningen ved å tilsette 3 volumdeler endotelial cellemediet og overføre cellesuspensjonen i et nytt sterilt rør.
  4. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min.
  5. Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 5 ml PBS. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min, fjerne supernatant gjenta deretter celle vask. Re-suspendere cellene i 5 ml PBS.
  6. Tell antall levedyktige celler. Bland 10 ul av cellesuspensjonen med 90 ul av 0,4% trypanblått. Overfør 10 ul av denne suspensjonen til hemocytometer for telling.
    MERK: Den endelige celleutbytte, vil avhenge av størrelsen på utvalget behandlet. Vanlig celleutbytte per 150 cm2 kolbe i området fra 7 x 10 5 til 1,2 x 10 6 av levedyktige celler.
  7. Forbered antistoff løsninger for cellefarging.
    MERK: Følgende fortynninger ble titrert til farging 1 x 10 6 i en farging volum på 100 ul.
    1. Fortynn PE-konjugert anti-humant mus VEGFR-3 (1:50); PE-konjugert Cy7 mus anti-humant CD34 konjugert (1: 200); APC-konjugert mus anti-humant CD31 (1: 100) og Alexa 488-konjugert anti-rotte human PODOPLANIN (1: 200) i totalt volum på 100 ul steril 5% FBS / PBS-løsning per vevsprøve. Etter utarbeidelse avantistoff løsning, holde på is inntil bruk. På samme måte fremstille fortynnet isotypekontrollantistoff blandingen for å lette innstillingen av flowcytometri porter.
  8. For å redusere ikke-spesifikk binding av antistoffene, sentrifuger cellene ved 300 xg i 2 minutter, fjern supernatanten og deretter suspendere cellene i 100 pl sterilt 5% FBS / PBS-løsning per prøve for å bli farget. Inkuber cellene på is i 20 min ved 4 ° C.
  9. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter, fjern supernatanten deretter re-suspendere celler i det konjugerte antistoff cocktail. Også flekke en mindre prøve av celler (1 x 10 5) i 100 ul isotypekontrollantistoff blanding. Inkuber cellene på is i 20 min.
  10. For å fjerne ubundet antistoff, tilsett 2 ml 2% FBS / PBS løsning og sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og gjenta vask.
  11. Resuspender cellepelleten for isotype kontroll-antistoff og farget prøven som skal sorteres i 300 ul 0,5 mg / ml propidium ioDide / 2% FBS / PBS løsning. Plasser rørene på is inntil sortering.

4. Cell Sorting

  1. Bruk følgende materialer for å sette opp instrumentet; justerings perler som kommersielt tilgjengelige fluorescerende partikler, fosfat-bufret saltvann basert slire væske og slipp forsinkelse perler, for eksempel Accudrop fluoriserende perler.
  2. Isolere rensede humane LMUene på en multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering instrument. Sett opp instrumentet og justere i henhold til produsentens anbefalinger. I tillegg kjører enkelt flekken kompensasjon kontroller med hver sort for å generere kompensasjon matrise og dermed eliminere betydelig blø gjennom av utslipp av fluorokromer som PE inn i PE-Cy kanal.
    MERK: En høyere andel av FACS sorterte cellene overleve isolasjon hvis en 100 pm dyse brukes, og cellene blir sortert i endotelcelle medium.

5. Cell Culture Post FACS Sortering

  1. Etter sortering, sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 5-10 ml medium (avhengig av kolben som grunnlag for cellen). Hvis mindre enn 50 000 celler sorteres, dyrkes cellene i fibronektin belagt 25 cm2 kolbe.
  2. Ellers kultur ble cellene i 75 cm2 fibronektin belagt kolbe ved 37 ° C i en 5% CO2, luft fuktet inkubator. Endre media etter 2 dager.
    MERK: Celle mediet skiftet annenhver dag fordi forlenge tiden mellom medie forandringer synes å favorisere overlevelse av de ikke-endotelceller. Vi validere lymfatiske endotelceller fenotype hjelp immunhistokjemisk deteksjon av markører: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 og CD31 når cellene er første split for videre ekspansjon 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter initial vev fordøyelse, etter 24 timer i kultur av ufraksjonerte prøver, forskjellige endoteliale cellekolonier kan observeres (figur 2A) sammen med fibroblast-lignende celler og glatte muskelceller. Etter sortering og etter 24 timer i cellekultur, de CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos celler feste og vise typisk brostein morfologi (figur 2B og C). Bruke FACS metoden beskrevet ovenfor, er vi i stand til å rense cellene opp til 99,8% renhet og skille dem fra CD34 Høy CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos endotelceller. Representative resultatene av gating strategi og sortering er presentert i figur 3. Dette har løst problemene oppleves når du bruker magnetisk-perle isolasjonsmetoden. Hittil har vi passert disse cellene opp til passasjen 13. Etter denne passasjen, LM LMU og forhuden LECs begynner å senescence, ledsaget av morfologiske endringer og redusert celledeling.

Figur 2
Figur 2. forhuden LMU og LM-LEC. Tjuefire timer etter enzymatisk fordøyelse, usorterte celler inneholder både endothelial (pil) og ikke-endotelceller (A). Etter CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos FACS celleisolasjon, forhuden LMU (B) og LM-LMU (C) er blottet for ikke-endotelceller og vedlikeholde brostein morfologi. Klikk her for å se en større versjon av figuren .

Figur 3
Figur 3. fluorescens-aktivert cellesortering port strategier for cellesortering av vaskulære og lymfatiske endotelcellers. (A) levende celler blir først separert på CD34 og CD31 ekspresjon, fulgt av VEGFR-3 og PODOPLANIN gating til sort vaskulær (B) og lymfatisk endotel (C-celler) henholdsvis. (D) Re-analyse av sortert CD34 Høy CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos celler show> 98% vaskulære endotelceller fenotype. (E) LMU celler sortert på CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos fenotype er også> 98% ren. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LMUene spiller en viktig rolle i å opprettholde fluid homeostase, immunrespons mot fremmede antigener og absorpsjon og transport av enkelte næringsstoffer. LEC homeostase kan påvirkes av sykdomsprosesser slik som bakterielle infeksjoner og tumormetastase, men LMUene kan også utvikle somatiske mutasjoner som resulterer i dannelsen av dysfunksjonelle lymfekar og betydelig morbiditet for berørte pasienter. For å få mer forståelse av lymfatisk malformasjon etiologi gjennom in vivo implantasjon og ex vivo eksperimentering, og oppdage nye behandlingstilbud, må vi først utviklet en LEC isolasjonsmetoden basert på magnetiske kuler utvalg strategi ved hjelp av CD34 Neg CD31 Pos utvalg strategi 15. Men de resulterende kulturene inneholdt ofte andre enn endotelceller som var vanskelige å fjerne cellene. Deretter ble metoden videreutviklet ved hjelp FACS å sortere LMU som uttrykker CD34 lav CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos fenotype. Denne tilnærmingen resulterte i relativt homogene LEC kulturer inneholder <0,5% av ikke-CD34 lav CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos celler på post-sortering sjekk. I praksis er fordelen med å sortere celler ved FACS at reduksjon av ikke- LMUene tilstedeværelse til <0,5%. Dyrkede LMU og LM LMU har en typisk brostein morfologi og bli senescent rundt passering 13.

I denne studien har vi beskrevet en flowcytometri basert protokoll for isolering og kultur av høyanriket LMUene fra normale og unormale vev basert på deres uttrykk for en pakke med celleoverflatemarkører (CD34 lav CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos). Celler ble sortert fra primære svev etter 5-7 dager in vitro ekspansjon, et trinn som resulterte i betydelig anrikning av LEC i forhold til deres frekvens i vev ved tidspunktet for isolasjon. Under surgery vi innhente vev som spenner fra flere mikrogram til titalls gram i vekt. Dette vevet kan variere sterkt i sin sammensetning med hensyn til volum lymfatiske misdannelses fartøy stede, vev arrdannelse og tilstedeværelse av lymfatisk malformasjon cyste tromber. Alle disse komponentene vil påvirke hvor mange celler kan bli isolert fra det syke vev. Derav startcellenummer, kan variere fra noen få tusen celler til flere millioner celler. Likeledes vil dette påvirke sammensetningen av cellesuspensjonen og startcellenumrene som betyr at antall sorterte cellene vil også variere fra en prøve til en annen.

Hyppigheten av LMU i usorterte forhuden prøver å følge 5-7 dager i kultur varierer fra 0,52% til 4,7%, mens LM LMUene varierer fra 0,8% til 12,43%. LMU kulturer omfattet> 99% CD34 lav CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos celler etter post-sortering re-analyse og opprettholdt en typisk cobblestone morfologi i kultur inntil begynnende alderdom ved passering ~ 13 uten overvekst av ikke-endoteliale elementer.

Det er nødvendig å utvide cellene ex vivo etter innledende vev fordøyelse og sortering, fordi utbyttet av enten forhuden eller lymfatiske misdannelser celler er generelt lav. Således, forutgående utvidelse av lymfatiske endotelceller i n vitro muliggjør genereringen av ~ 2x10 6 celler som trengs for å pode en mus kammer. Dette krever en in vitro ekspansjonstrinn 5-7 dager. Mens vi akseptere at cellekulturen kan indusere fenotypiske forandringer i de primære celler, har vi vist at disse dyrkede cellene beholder deres evne til å danne lymfatiske misdannelser-lignende strukturer i en xenograft musemodell 15.

Det er flere viktige skritt i protokollen som bestemmer graden av suksess når sortering celler ved FACS. Den mest kritiske trinnet er tidspunktet for eksponering av cellene til kollagenaseog dispase under isolering fra de primære vev som beskrevet i trinn 2.7. Dette er ikke bare påvirkes av mengden og typen av vev til stede, men også av batch av enzymer som anvendes. I tillegg fluorescensmerkede antistoffer som brukes til å karakterisere de cellepopulasjoner må titreres, og fortrinnsvis monoklonale. Vi testet flere forskjellige celle avløsning løsninger som trypsin / EDTA, EDTA, TrypLE Velg og celle avløsning løsning. Vi har funnet ut at EDTA måtte brukes i en lengre tidsperiode for å løsne celler og rester av celleklumper ofte forble. I motsetning til dette, ble enkeltcellesuspensjoner ble generert i løpet av 3-5 minutter med inkubasjon i trypsin / EDTA, celle løsgjøring løsning og TrypLE Velg. Vi fant ingen vesentlig forskjell i ekspresjonen av CD31, CD34, Podoplanin og VEGFR-3 etter behandling med noen av enzymløsninger. Enkelt farget prøver bør også gjøres med hver sortering eksperiment for å sikre at fluorokromkonjugerte emisjonsspekter ikke overlapper ogderfor gi feilmålinger. Disse kritiske trinn utgjør også trinn der endringer i cellen protokollen kan være nødvendig eller feilsøkings løpet av flowcytometri sortering.

Når sammenlignet med våre tidligere publisert magnetiske kuler isolering av LMUene 15, fordelen av å isolere LMUene ved FACS inkluderer følgende: hurtigere isolering av celler med høy renhet og identifisering av atskilte celleundergrupper og sjeldne populasjoner i en heterogen prøve. De viktigste begrensningene FACS baserte LEC og LM LEC isolasjon dreier seg om begrenset antall celler som er tilgjengelige for validering følgende celle sortering resultater. I tillegg, mens alle forsøk er gjort for å standardisere våre analyser og instrumentoppsett, de samme parametrene kan ikke nødvendigvis være reproduserbar i andre laboratorier. Derfor kan noen variasjon i resultatene oppstår. I tillegg er en av de sakene som lymfatiske biologer står overfor er fraværet av celle spesifikke markørersom ville skille mellom innledende kapillær LEC markører og samle kapillær LEC markører. På dette stadiet, har vi ennå ikke identifisert LEC markører som ville skille mellom friske LMU og LM LMU. Siden lymfatisk vev misdannelse inneholder også normalt utseende lymfekar (figur 1A), vil den resulterende CD34 CD31 lav Pos VEGR3 Pos Pos PODOPLANIN inneholde en andel av normale LMUene, så vel som de av den syke fenotype. Fremtidige studier undersøker LMU og LM LEC genekspresjon og proteomikk kan være i stand til å lede oss i retning av mer spesifikke LM LEC markører som kan skille LM LMUene fra LMU i samme vev.

I fremtiden forventer vi å utnytte FACS og disse nye LEC markører i forsøk på å identifisere sjeldne undergrupper av LMU bestander både i forhuden og lymfatiske misdannelser. Dette vil tillate oss å isolere disse cellepopulasjoner og studere deres rolle i utviklingen av lymphatic karsystemet og lymfatiske misdannelser.

Isolere LMU og LM LMUene basert på CD34 lav CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos betydelig redusert ikke-endotelceller forurensning. Videre tillater FACS teknologi oss å separere LMUene inn subtyper basert på ekspresjon av CD31, PODOPLANIN og VEGFR-3-celleoverflatemarkører, og for å forstå dette i sammenheng med celle avstamning utvikling. For syke LMU, gjør dette for celle-spesifikke studier som vil kaste ytterligere lys på gener forårsaker LMU sykdommer og LEC kapasitet til å svare på ulike celle stimuli in vitro og i dyre xenograft modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Baker Foundation og Det Kongelige Barnas Stiftelsens Kvinner i forskning Fellowship 'støtte av Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty og Edouard G. Stanley er NHMRC Senior stipendiater. Arbeid i sine laboratorier ble støttet av NHMRC og stamceller Australia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204, (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180, (6), 2561-2575 (2012).
  3. Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7, (2), 87-96 (2009).
  4. Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25, (2), 159-184 (2006).
  5. Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
  6. Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
  7. Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27, (9), 1729-1738 (2006).
  8. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
  9. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
  10. Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
  11. Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127, (6), 2419-2431 (2011).
  12. Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124, (3), 898-904 (2014).
  13. for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. (2014).
  14. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164, (2), 383-388 (2014).
  15. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17, (1), 1-15 (2014).
  16. Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2, (1), 25-31 (2004).
  17. Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7, (2), 75-80 (2009).
  18. Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7, (2), 75-80 (2007).
  19. Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56, (3), 353-370 (2007).
  20. Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. Melbourne, Australia. (2014).
  21. Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
  22. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, (1), 87-103 (2008).
  23. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26, (6), 781-796 (2011).
  24. Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32, (5), 629-644 (2013).
  25. Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
  26. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154, (2), 385-394 (1999).
  27. Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (8), 3566-3570 (1995).
  28. Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22, (14), 3546-3556 (2003).
  29. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194, (6), 797-808 (2001).
  30. Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41, (3), 103-110 (2008).
  31. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19, (3), 397-410 (2005).
  32. Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124, (6), 625-631 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics