Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University
Published 8/20/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

4 - diyet yağ ve lipid içinde çözünür ilaçlar ve vitaminler intestinal çalışmaları lenf fistül MODEL 1 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, ilgili cerrahi teknikler sadece zor değil, aynı zamanda pahalı değil. In vivo kullanılabilmektedir dışkı analizi dayalı yaklaşımlar da, mide-barsak sisteminde 2,5 yüzdesi alımını belirlemek için temel olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda anlatılan in vitro model daha düşük maliyetli olduğunu ve ilgili teknikler tartışmalı az zorlayıcı bulunmaktadır. Genetik modifikasyonlar çalışmaları da zaman alıcı, bu in vitro bir model kullanılarak gerçekleştirilmiştir zaman daha ekonomik ve daha az bulunmaktadır.

Enterositler tarafından alınır lipit çözünür malzeme lipoproteinler 6,7 içine paketlenmiş olduğundan, lipoproteinlerin üretmek için bu in vitro modelin etkinliği çok önemlidir. iki ana intestinal lipoproteinler kilomikronlar, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL) vardır. Lipidler mide-bağırsak lümeninde bol mevcut olduğunda çapı 80 nm ya da daha fazlası ile lipoproteinler olarak tanımlanan kilomikronlar, küçük bağırsak tarafından sıkı bir şekilde üretilir. Onlar büyük lipoproteinler olduğundan, şilomikronlar makul en verimli lipit taşıyıcıları vardır. Şilomikron 8 üretebilen bu in vitro modeli, diyet yağ emme, gut lipid çözünür vitamini emme ve oral lipofilik ilaç biyo-incelemek için kullanılabilir. lipoprotein fraksiyonuna lipid çözünür moleküller, vitaminler ya da ilaçların bulunması, ince bağırsakta kendi emilme bir göstergesidir. Daha önce ele alındığı gibi, bu model, oral lipofilik ilaç biyo-6 geliştirmek için de kullanılabilir.

Bu kağıt Caco-2 hücreleri geçirgen zar veya normal doku kültürü yemekleri, nasıl lipit mi muhafaza edilmelidir açıklanırLipoprotein üretimini stimüle etmek için soğutun lentivirüs sentezleme sisteminin etkin aşırı ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir nasıl hazırlanmalı ve izole lipoproteinler kadar analiz edilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CACO-2 hücrelerinin 1. Bakım

  1. Düzenli doku kültürü yemekleri kullanma
    1. (FBS, 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirerek bir dondurulmuş şişesinden alınan Caco-2 hücreleri çözülme ve hemen önceden ısıtılmış büyüme ortamı (% 15 fetal bovin serumu, 10 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı eklemek ) Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)) 'de.
      1. Caco-2 hücreleri% 50-70 kaynaşmaya ulaştığı zaman, onları 1 bölünmüş: müstakil kadar 37 ° C'de% 0.05 tripsin / 0.53 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ile hücrelerin inkübe edilmesi ile 6 (15 dk) . Hücre topaklaşmayı önlemek yumuşak pipetleme hücreler karıştırmak için birkaç kez. Önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı tripsinize edilmiş hücre 0.5 ml ilave edilir.
    2. Yavaşça bir sola ve sağa yön ardından ileri ve geri yönde yemeklere birkaç kez sallayın. Yemekler dönen kaçınıngibi eşit olmayan bir hücre dispersiyonu ile sonuçlanabilir.
    3. % 5 CO 2 ile birlikte 37 ° C inkübatör düz bir yüzeye yerleştirin yemekleri. Eğimli yüzeyler de eşit olmayan bir hücre dispersiyonu ile sonuçlanabilir.
    4. Inkübasyon başladıktan sonra büyüme Ortam bir gün değiştirin.
    5. Hücreleri izlemek ve izdiham ulaşmak günü kaydedin. Hücreler bölünür günden itibaren izdiham ulaşmak için yaklaşık 1 hafta sürer.
    6. Hücreler izdiham ulaşmadan haftada iki kez büyüme ortamı değiştirin. Hücreler izdiham ulaştığınızda, her gün büyüme ortamı değiştirmek. Hücreler 7-günler sonrası konfluent olduktan sonra, günlük büyüme ortamı değiştirmek.
      Not: 13-günler sonrası konfluent (Şekil 1) olduğunda hücreler deneyler için hazırız. Hücreler sonunda lipoproteinlerin üreten daha az etkili hale gelecektir yana, 8 sonrası birleşik 13-17-gün arasında olan hücreleri kullanır. Deney yapmak için nasıl adım 3'e gidin.
  2. Geçirgen zar sistemi kullanılarak
    1. Aşama 1.1.1.1 tarif edildiği gibi geçirgen zar ekinde Caco-2 hücreleri, tohum. Yukarıda. Onların hücre büyümesi (iyileşme dönemi) normalde yavaş çünkü dondurulmuş şişesinden alınan hücreler kullanılarak kaçının. Kısaca, önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml içeren apikal (üst bölmesi) tripsinize edilmiş hücre 0.5 ml ilave ediniz. Ayrıca, bazolateral bölme (alt bölmesi) önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml.
      Not: En iyi uygulama için, bazolateral odasına ilk ve daha sonra apikal odasına büyüme ortamı ekleyin. Eski medya çıkartırken, apikal medya önünde bazolateral ortamı çıkarın. Bu membran rüptürü olabilir polikarbonat membran alay kaçının.
    2. Nedeniyle polikarbonat zardan kötü hücre görünürlüğe, benzer yoğunlukta düzenli bir doku kültürü çanak Caco-2 hücreleri tohum ve hücre izdiham yargılamak için bu yemeğin kullanın.
    3. S izleyinTeps'in 1.1.2-1.1.6, yukarıda.

2. Gene overekspresyonu

  1. Normal transfeksiyon yaklaşımı kullanarak
    1. Yukarıda 1.1.1.1.-1.1.4 de tarif edildiği gibi bir doku kültürü tabağına Caco-2 hücreleri, tohum.
      Not: hücreler yaklaşık% 40-50 konfluent olduğunda, transfekte hazırdır.
    2. Mikrosantrifüj tüpü içinde düşük serum ortamında 472 ul transfeksiyon reaktifi 67 ul ekle. Tüp duvar ile sulandırılmamış transfeksiyon reaktif temasından kaçının.
    3. PLL3.7 23 ug transfeksiyon reaktifi / düşük serum ortamında karışımına, yeşil flüoresan protein (EGFP) 9 Geliştirilmiş ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı.
    5. DMEM içinde% 10 FBS 8 ml Caco-2 hücreleri, büyüme ortamı değiştirin.
    6. Damla damla çanak DNA / transfeksiyon reaktif / azaltılmış serum medya karışımı ekleyin.
    7. Yavaşça ileri ve ba yemekleri birkaç kez sallayınBir sola ve sağa yönde takip ckward yön.
    8. 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin.
    9. Kuluçka başladıktan sonra büyüme ortamı 10 ml her gün bir çanak ortamı değiştirin.
    10. Gen ifadesini izleyin.
      1. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyanmamış olan gen ekspresyonunu izlemek. Floresan mikroskobu kullanılarak, yeşil hücrelerin yüzde belirler. yüzde transfeksiyon verimini gösterir.
      2. DAPI boyama ile gen ifadesini izleyin.
        1. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hücreler yıkanır.
        2. PBS (oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon) içinde% 4 formaldehit, 10 ml ekleyerek hücreleri saptamak.
        3. PBS üç kez hücreleri yıkayın.
        4. 500 DAPI,% 1 BSA,% 0.01 digitonin: 1 içeren PBS 8 ml ile oda sıcaklığında 15 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri.
        5. PBS üç kez hücreleri yıkayın.
        6. U, bir flüoresan mikroskop şarkı, mavi (Şekil 2 üst panel) ki bu yeşil / mavi göreli hücre sayısını belirler. hesaplanan yüzde transfeksiyon verimini gösterir.
  2. Lentivirüs aşırı sistemi 10 kullanılarak
    1. 15 cm'lik bir doku kültürü çanağı içinde Tohum, insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri (DMEM içinde% 10 FBS büyüme ortamı olarak).
      Not: hücreler yaklaşık% 60-70 konfluent olduğunda, transfekte hazırdır.
    2. Mikrosantrifüj tüpü 11 düşük serum ortamı 1133 ul transfeksiyon reaktifi 162 ul ekle. Tüp duvar ile sulandırılmamış transfeksiyon reaktif temasından kaçının.
    3. Ekle 24 pLL3.7 eGFP (ya da başka bir yapı) ug, 15.6 REV karşılık elemanının ug (RRE), REV 6.0 ug, ve transfeksiyon reaktifi / r içine veziküler stomatit virüsü glikoprotein 8.4 ug (VSVG)educed serum ortamında karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
    4. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı.
    5. DMEM içinde% 10 FBS ve 16 ml büyüme ortamı değiştirin.
    6. Damla damla çanak DNA / transfeksiyon reaktif / azaltılmış serum medya karışımı ekleyin.
    7. Yavaşça bir sola ve sağa yön ardından ileri ve geri yönde yemeklere birkaç kez sallayın. Bu noktada müstakil HEK293T hücrelerinin bazılarını görmek için normaldir.
    8. Inkübatör çanak yerleştirin.
    9. Kuluçkalamadan 24 saat sonra, büyüme ortamı, 25 ml çanak ortamı değiştirin.
    10. Ertesi gün, lentivirüs (birinci toplama) içeren büyüme ortamı toplar.
    11. Adımı yineleyin 2.2.10 fazla lentivirüs (ikinci toplama) toplamak için.
    12. (5 dakika boyunca 2.500 xg) birinci ve ikinci toplama havuzu ve santrifüj hücre enkaz kaldırmak.
    13. Tek kullanımlık şişe üstü filtre (0.45 mikron gözenek) ile toplama Filtre veRT (JA-20 rotor) 2 saat süre ile 31.400 x g'de santrifüje toplama virüsü konsantre edilir. Pelet bulunduğu santrifüj tüpünün dibine işaretleyin. Süpernatant tortusundan ayırma, ve yaklaşık 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ters tüpü terk.
    14. 1X PBS, 100 ul virüs içeren pelletini. Kabarcıkları kaçının.
    15. -80 ° C 'de konsantre edilir virüs saklayın. Donma-çözülme döngüleri kaçının.
    16. Titrasyon ile, Caco-2 hücreleri nakletmek için gerekli virüs optimal miktarının belirlenmesi. Maliyet tasarrufu için, 24-çukurlu plaka (iyi büyüme ortamı / 0.3 ml) kullanılarak titrasyonu için 10 cm'lik bir doku kültürü çanağı kullanın.
      1. Konsantre edilmiş virüs artan miktarlarda ekleyin (0, 1, 2, 5, 10, 25, ve 50 ul / kuyucuk)% 40-70 konfluent Caco-2 hücreleri için polibren (nihai konsantrasyon = 5 ug / ml) ile takviye edilmiştir. 1.1.2 tarif edildiği gibi hafifçe 24 oyuklu plaka çalkalayın.
      2. Onların gen ifadesini Monitör (Adım 2.1.10.) (Şekil 2 alt4 paneller).
    17. Transgen ifadesi genellikle sürekli olduğundan, gelecek deneyler için transdüse hücreleri korumak ve sürekli olarak gen ifadesini izlemek (Adım 2.1.10.).

3. Lipoprotein salgılanmasını uyararak

  1. Düzenli doku kültürü çanak kullanma
    1. Oleik asit, 50 mg, lesitin, 40 mg, ve sodyum taurokolat ve 48 mg karıştırılarak bir 100X yağ karışım hazırlayın. (8 yemekler için yeterli) PBS ile 900 ul hacim kazandırın. Kuvvetli bir şekilde lipit karışımı karıştırın.
    2. Büyüme ortamı 89.1 ml 100X lipit karışımı 900 ul ekleyin. Mix ve lipid içeren medya filtre. oleik asit, lesitin, ve sodyum taurokolat ve nihai konsantrasyonlar (1X) 2.0 mM, 1.36 mM ve sırası ile 1.0 mM vardır.
    3. Hücrelere lipid içeren ortam, 10 ml ilave edilir.
    4. 37 4 saat boyunca lipit-içeren ortam ile inkübe hücreleriC inkübatör °.
    5. PBS üç kez hücreleri yıkayın.
    6. Lipoprotein salgılanmasını toplamak için hücrelerin büyüme ortamı 10 ml ilave edilir.
    7. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 2 saat süreyle inkübe edin.
    8. Lipoprotein içeren medya toplayın.
  2. Geçirgen zar sistemi kullanılarak
    1. Adımları 3.1.1-3.1.2 lipit karışımı hazırlamak için.
    2. Apikal bölmeye lipid içeren ortam 10 ml ve bazolateral bölmeye büyüme ortamı 10 ml ilave edilir.
    3. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat süreyle inkübe edin. Bazolateral bölme lipoprotein ihtiva eden ortam toplayın.

4. lipoprotein İzolasyon (Şekil 3)

  1. Santrifüj (5 dakika boyunca 2.000 xg) lipoprotein içeren medyanın hücre enkaz kaldırmak.
  2. 50 ml'lik bir tüp içine ortamı süzün.
  3. Ortam, sodyum klorür 5.95 g ekleyin.
  4. Sa Eğermple TEM ile analiz edilecektir, lipoproteinlerin bütünlüğünü korumak için 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin.
  5. Su ile 23 ml hacmi (1.2 g / ml NaCI yoğunluk çözeltisi) getirin.
  6. Tamamen çözünmüş çözülür.
  7. Polikarbonat ultrasantrifüjdeki tüp içine çözeltinin Tümünü süzün.
  8. Yavaşça, 0.5 ml, su (1.0 ug / ml yoğunlukta), 1.2 ug / ml yoğunlukta çözelti kaplar.
  9. Hacimce ağırlıkça değil tüp dengeleyin.
  10. Yavaşça T865 rotor tüpler yükleyin.
  11. 4 ° C'de 24 saat boyunca 429.460 x g'de ultrasantrifüjdeki örnekleri dönerler.
  12. Hemen Nazik pipetleme üst 0.5 ml solüsyon izole. Mümkün olduğunca hareketsiz tüp tutun.

5. TEM analizi

  1. (A / h) ile pH 6,0'a ayarlanır% 2 fosfotungstik asit 5 ml hazırlayın.
  2. (: 0.2 mikron gözenek boyutu) bir şırınga filtresi ile% 2 fosfotungstik asit Filtre.
  3. Steril bir çanak lipoprotein numunenin 20 ul bırakın.
  4. Bir sonraki aynı yemeğin üzerine örnek süzülmüş% 2 fosfotungstik asit 20 ul bırakın.
  5. Yavaşça donuk yan numune üzerinde oturan bir EM ızgara bırakın.
  6. 1 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edilir.
  7. Yavaşça ızgara örneği kaldırmak için bir filtre kağıdına EM ızgara tarafı dokunun.
  8. Yavaşça donuk tarafı% 2 fosfotungstik asit dayayarak EM ızgara bırakın.
  9. 1 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edilir.
  10. Yavaşça ızgara fosfotungstik asit ayrılması için bir filtre kağıdı üzerinde EM ızgara yan dokunun.
  11. Bir TEM kullanarak, lipoproteinler (Şekil 4) görüntüleri yakalamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 görüntüler, normal 13-gün sonrası birleşik Caco-2 hücreleri Şekil. Kubbe-şekilli yapılar ve hücre içi lipid damlacıkları görünümü farklılaşmış Caco-2 hücreleri için karakteristiktir. Caco-2 hücreleri tohumlama sırasında eşit dağılmış değil, onlar kümelenir ve yemeğin belirli alanlarda sarmak olacaktır; ve herhangi bir hücrelerde olmadan çanak birkaç alanları olacaktır. Swirling ve eğimli bir yüzeye çanak yerleştirilmesi kaçınılmalıdır. Bu post-birleşik Caco-2 hücreleri yeni büyüme ortamı çok kabaca hücrelere eklendiğinde müfrezesi daha duyarlı olduğuna dikkat etmek de önemlidir. Bu nedenle, yeni medya hücre ayrışması önlenmiş, yavaşça ilave edilmelidir.

Bu çalışmalara göre, Caco-2 hücrelerinin transfeksiyon verimi% 30-60 (Şekil 2 üst paneller) arasındaydı. Bunun aksine, lentivirüs sentezleme sistemi kullanılarak Caco-2 transdüksiyon verimliliği yaklaşık% 100 idi (Şekil 2 Şekil 2, aynı zamanda, konsantre lentivirüs optimal miktarı 10 ul olduğunu göstermiştir. kalıt, Caco-2 hücreleri, 12 geçişleri kadar muhafaza edilmiştir. Gösterildiği gibi, sonra bile 12 pasajlar transdükte hücreler hala eGFP dile getirdi. transdüksiyon verimliliği açıkça lentivirüs konsantrasyonuna bağlıdır. transfeksiyon / transdüksiyon verimliliği onayı kritiktir ve gerçek deney öncesinde rutin ön analiz gibi yapılmalıdır. Western blot analizi, gen ekspresyonu yüzdesi artışı tahmin etmek için de kullanılabilir, ancak bu transfeksiyon / transdüksiyon etkinliğini belirlemek için birincil yöntem olmamalıdır.

NaCI yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme yöntemi (Şekil 3) kullanılarak Caco-2 hücreleri tarafından salgılanan lipoproteinler izole edildi ve bir TEM ile analiz edildi. Kilomikronlar bazıları, çapı daha büyük olan 80 nm lipoproteinleri, Şekil tasvir edilmiştir4. Daha küçük lipoproteinler, VLDL'lerden de hazır bulundu. Bir TEM hem şilomikronların ve VLDL'lerden başarılı izolasyonunu doğrulamak için gereklidir. Daha önce 8 tartışıldığı gibi, biyokimyasal analizler teyit birincil yöntem olmamalıdır. lipoproteinlerin olmaması, özellikle kilomikronlar, Caco-2 hücreleri tarafından lipid taşınması etkin olmadığını göstermektedir. Sonuç olarak, onlar lipit taşıma çalışmak için iyi bir model olarak hizmet olmaz. lipoprotein partikülleri toplam sayısına göre şilomikron parçacıkların sayısı 8 sayılabilir. Yüksek bir yüzdesi verimli lipit taşıma gösterir.

Figür 1
Şekil 13 gün sonrası birleşik Caco-2 hücrelerinin 1. Temsilcisi mikrograf. Hücre içi lipid damlacıkları bazı hücreler (kırmızı ok) görülebilir. Eşsiz kubbe şeklindeki yapılar (siyah ok) foBazı Caco-2 hücreleri tarafından rmed hücreler kaynaşmaya ulaştıktan sonra, genel olarak bulunmaktadır. Büyütme = 100X. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil lipit bazlı transfeksiyon etkinliği ve lentivirüs sentezleme sistemi 2. karşılaştırması Üst panel:. Caco-2 hücreleri olmayan lipozomal transfeksiyon reaktifi (Ölçek çubuğu = 20 um) kullanılarak pLL3.7 eGFP ile transfekte edilmiştir. Alt 4 paneller: Caco-2 hücreleri pLL3.7 EGFP konsantre lentivirüs (LV) ve değişen miktarlarda (1, 2, 5 ya da 10 ul) ile lentivirüs sentezleme sistemi kullanılarak transdükte edilmiştir. Görüntülenen hücreleri orijinal transduced hücrelerin 12. geçidinden idi. sol paneller DAPI boyama göstermek, orta parın sayısındaki GFP floresan göstermek ve sağ paneller birleştirilmiş görüntü göstermek. lentivirüs sentezleme sistemi besbelli lipit bazlı transfeksiyon daha etkili olmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
NaCI yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile barsak lipoproteinlerin Şekil 3. izolasyonu. Lipoprotein ihtiva eden ortamın yoğunluğu NaCI uygun bir miktarının ilave edilmesi ile 1.2 g / ml olarak ayarlanır. Bu çökmesini engellemek için tüm bir ultra santrifüj tüpüne dolduracak şekilde, numunenin hacmi de ayarlanması gerekir. Yoğunluk gradyanı elde edilmesi için, su içinde 0.5 ml 1.2 ug / ml yoğunlukta çözelti hafifçe kaplanır. Numune daha sonra bir T865 kullanılarak 24 saat süre ile 429.460 x g hızında eğrilirRotor (2.15 Svedberg ünitesine denk) içerebilir. Bağırsak lipoproteinler hemen Nazik pipetleme ile elde edilmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Caco-2 hücreleri tarafından üretilen lipoproteinlerin Şekil 4. Örnek elektron mikrografisidir. NaCI yoğunluk gradyanı ultra santrifüj yoluyla izole lipoproteinler olumsuz% 2 fosfotungstik asit (pH 6.0) ile boyanmıştır. Kilomikronlar, lipid parçacıkları daha büyük çapı 80 nm ve VLDL'lerden, bu daha küçük 80 nm her ikisinin de mevcut bulunmaktadır. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, kullanılabilecek iki sistem Caco-2 hücreleri, yani düzenli doku kültürü çanak ve geçirgen zar açıklanmıştır korumak için. geçirgen zar sistemi kullanmanın faydaları apikal ayrılmasını ve bazolateral bölmeleri ve lipid karışımı inkübe ve aynı zamanda lipoprotein salgılanmasını toplamak için yeteneği vardır. Ancak, geçirgen zar ekler pahalıdır, ve polikarbonat membran iyi bir hücre görünürlüğü izin vermez. Bu in vitro modelin avantajlarından biri genetik manipülasyon çalışmaları daha ekonomik ve daha az zaman alıcı olmasıdır. Daha iyi etkinliği için, lentivirüs sentezleme sistemi kullanılır. kalıt, Caco-2 hücreleri, genellikle transgen ekspresyonunu korumak.

şilomikron üretilmesi için Caco-2 hücrelerinin yeteneği büyük önem taşımaktadır. Bu yetenek olmadan, Caco-2 hücreleri efficie mümkün olmazdiğer yönden başkaları baskın olarak, lipofilik madde taşıma de dahil olmak üzere, ancak liphophilic ilaç, vitamin A, D, E ve K, ve herhangi bir lipid çözünür besin ile sınırlı değildir. Uygun yöntemler VLDL partikülleri ve şilomikronlar hem açıklanmıştır üretmek için Caco-2 hücreleri meydan. Bu lipoprotein partiküllerinin başarılı izolasyonu TEM teyit edilmelidir. 14 - Güncel literatüre dayanarak, bu Caco-2 modeli diğer Caco-2 modelleri 12 arasında en verimli lipit ulaşım sunuyor. Ancak, in vivo lenf kanülasyon modeli hala daha verimli bir in vitro model daha lipidler taşımaktadır. altta yatan nedenleri en son Caco-2 hücreleri, Caco-2 hücreleri, monogliseridler trigliseritlerin sentezleyemediği, apolipoprotein B 2 farklı izoformlar üretir ve şilomikron biyogenez kritik serumu bileşeni büyüme ortamı içinde daha düşük olabilir, yani, çünkü 8 tartışılmıştır . Bu, bu sınırlama gerçekleştirmek için de önemlidirvitro model; Bu in vitro modeli, bağırsak hareketliliği, gut anatomisi ve diğer organ sistemleri ile etkileşim gibi bazı potansiyel önemli faktörleri, dışlar.

Caco-2 hücreleri şilomikron üretmek için izin ana faktör etkin kullanılan lipid ve hücresel farklılaşma 8 tipi / miktarıdır. Bu faktörlerin uygun kombinasyonu olmadan, Caco-2 hücreleri şilomikronlar 8 önemli sayıda üretmeyecektir. Dikkat çekici bir şekilde, NaCI yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme doğru yapılmalıdır. lipoproteinlerin başarılı izolasyonu (önemli gecikmeden derhal) zamanlaması bağlıdır ele iyi örneği (çok ajitasyon olmadan sağlam), ve dikkatli pipet (sadece üst tabakasını almak). Uygun bir teknik lipoprotein tabakası 8 görselleştirmek yardımcı olmak için önceden boyanmış lipidlerin kullanılarak yapılabilir. TEM yanı sıra, biyokimyasal analizler, yani apolipoprotein B ve trigliserid analizleri, ayrıca u olabilirlipoproteinlerin başarılı izolasyonunu onaylamak için sed. Daha önce 8 bildirdin bu biyokimyasal analizler, aynı zamanda emilim miktarının yöntemlerin olarak hizmet verebilir. Bununla birlikte, TEM de şilomikron üretiminin potansiyel fazla tahmin neden 2 agrega lipoproteinlerin eğilimi nedeniyle yapılmalıdır.

Bu in vitro modeli, diyet yağ emilimini ve lipofilik ilaçlar, vitaminler ve diğer lipid çözünür besinlerin bağırsak emiliminin incelenmesi için özellikle yararlıdır. Ayrıca, oral lipofilik ilaçların zayıf biyolojik olarak sağlanmalarım arttırmak için bir model olarak hizmet edebilir. Lipitte çözünür malzeme dolaşıma taşıma enterositler tarafından şilomikronlar içine paketlenmiş olduğundan, şilomikron üreten Caco-2 hücreleri, lipofilik ilaç emmede daha verimli olacaktır. Buna ek olarak, bu model müfettişler gut (farmakogenetik) tarafından ilaç emilimi belirli bir genin rolünü belirlemek için izin verir. Aynı zamanda içinde veriyorvestigators Oral lipofilik ilaç biyoyararlanımı üzerinde çeşitli diyet yağların etkisini karşılaştırmak. Bu uygulamaların hepsi, daha önce 6 tartışılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115, (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131, (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127, (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8, (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32, (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2, (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4, (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21, (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439, (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274, (28), 19565-19572 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats