Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University
Biology

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Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

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Abstract

Introduction

4 - Studien der intestinalen Aufnahme von Nahrungsfett und lipidlösliche Arzneimittel und Vitamine können in vivo unter Verwendung eines Lymphfistel Modell 1 durchgeführt werden. Jedoch sind die Operationstechniken involviert nicht nur anspruchsvoll, sondern auch kostspielig. Obwohl in vivo-Ansätzen auf fäkale Analysen können verwendet werden, basieren, sind sie hauptsächlich verwendet, um die prozentuale Aufnahme durch den Magen-Darm-2,5 bestimmen. Die in diesem Dokument beschriebenen in vitro-Modell ist kostengünstiger, und die Techniken beteiligt sind wohl weniger anspruchsvoll. Genetische Veränderung Studien sind auch wirtschaftlicher und weniger zeitaufwendig, wenn sie mit diesen in-vitro-Modell durchgeführt.

Da lipidlöslichen Materialien, die von Enterozyten genommen werden, in Lipoproteinen 6,7 verpackt ist, wird die Wirksamkeit dieser in vitro-Modell zu erzeugen Lipoproteine ​​entscheidend. Die zwei Haupt intestinal Lipoproteine ​​Chylomikronen und sehr geringer Dichte (VLDL). Chylomikronen, definiert als Lipoproteine ​​mit 80 nm oder mehr im Durchmesser, werden ausschließlich durch den Dünndarm produziert, wenn Lipide in Fülle im Magen-Lumen vorhanden sind. Da sie die größte Lipoproteine ​​Chylomikronen sind denkbar die effizientesten Lipidtransportern. Dieses in vitro-Modell, das in der Lage ist Chylomikronen 8 kann verwendet werden, um Nahrungsfettabsorption, lipidlösliches Vitamin Absorption durch den Darm und die orale Bioverfügbarkeit lipophiles Arzneimittel zu untersuchen. Die Anwesenheit von lipidlösliche Moleküle, Vitamine oder Drogen in der Lipoproteinfraktion ist ein Indikator für deren Absorption durch den Dünndarm. Wie zuvor erläutert, kann dieses Modell verwendet werden, um die orale Bioverfügbarkeit lipophilen Arzneimittel 6 zu verbessern.

Dieses Papier beschreibt, wie Caco-2-Zellen sollten in durchlässige Membran oder regelmäßige Gewebekulturschalen, wie die Lipid-mi beibehalten werdenBefestigung zur Stimulierung Lipoproteinsynthese sollten darauf vorbereitet sein, wie die Lentivirus-Expressionssystem verwendet werden, um effektiv eine Überexpression zu erreichen, und wie die isolierte Lipoproteine ​​sollten analysiert werden.

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Protocol

1. Wartung der Caco-2-Zellen

  1. Verwenden von regulären Gewebekulturschalen
    1. Tauen die Caco-2-Zellen, die aus einem gefrorenen Fläschchen durch Platzieren des Gefäßes in einem 37 ° C Wasserbad, und fügen Sie sie sofort auf eine 10 cm Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmten Wachstumsmedien (15% fötalem Rinderserum (FBS ) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM)).
      1. Wenn die Caco-2-Zellen 50-70% Konfluenz erreicht, spalteten sich 1: 6, indem die Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin / 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 ° C, bis sie abgenommen werden (15 min) . Zu Zelle Verklumpung zu vermeiden, mischen Sie die Zellen mehrfach durch vorsichtiges Pipettieren. 0,5 ml der Trypsin-Zellen auf eine 10 cm-Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmtem Nährmedium.
    2. Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. Vermeiden Sie wirbeln die Gerichtewie es in einer ungleichen Zelldispersion führen.
    3. Die Schalen werden auf eine flache Oberfläche in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 zugeführt wird. Geneigten Flächen kann auch in einer ungleichen Zelldispersion führen.
    4. Ändern Sie den Wachstumsmedien einen Tag nach Beginn der Inkubation.
    5. Überwachen Sie die Zellen, und notieren Sie den Tag ihrer Zusammenfluss zu erreichen. Es wird ca. 1 Woche dauern, bis die Zellen bis zur Konfluenz ab dem Tag sie aufgeteilt werden zu erreichen.
    6. Ändern Sie den Wachstumsmedien zweimal pro Woche, bevor die Zellen Konfluenz erreichen. Sobald die Zellen Konfluenz erreicht, ändern Sie die Wachstumsmedien jeden zweiten Tag. Nachdem die Zellen 7 Tage post-konfluente, ändern Sie die Wachstumsmedien täglich.
      Anmerkung: Die Zellen sind bereit für Experimente, wenn sie 13 Tage nach der Konfluenz (Abbildung 1). Da die Zellen werden schließlich weniger wirksam in der Herstellung von Lipoproteinen, verwenden Zellen, die zwischen 13 bis 17 Tage post-konfluente 8 sind. Zum, wie man das Experiment durchführen Schritt 3.
  2. Verwendung der permeablen Membransystem
    1. Samen der Caco-2-Zellen in der durchlässigen Membran Einsatz wie in Schritt 1.1.1.1 beschrieben. über. Vermeiden Sie Zellen aus einem zugefrorenen Fläschchen, weil ihre Zellwachstum ist in der Regel langsamer (Erholungszeit). Kurz gesagt, werden 0,5 ml der Zellen mit Trypsin behandelt, um die apikale Kammer (Oberkammer), die mit 10 ml vorgewärmtem Nährmedium enthält. Außerdem werden 10 ml des vorgewärmten Nährmedium zur basolateralen Kammer (unteres Fach).
      Hinweis: Für Best Practice, fügen Sie die Wachstumsmedien zur apikalen Kammer und dann zur basolateralen Kammer. Beim Entfernen der alten Medien, entfernen Sie den basolateralen Medien vor den apikalen Medien. Vermeiden Stossen die Polycarbonatmembran, da es die Membran reißen.
    2. Aufgrund der schlechten Sicht durch die Zelle Polycarbonatmembran, Saatgut die Caco-2-Zellen in einem normalen Gewebekulturschale mit ähnlicher Dichte, und verwenden Sie dieses Gericht, das Zellkonfluenz beurteilen.
    3. Folgen Sie sTEPs 1.1.2-1.1.6 oben.

2. Genüberexpression

  1. Mit Hilfe der regulären Transfektionsansatz
    1. Samen der Caco-2-Zellen auf einer Gewebekulturschale wie oben in 1.1.1.1.-1.1.4 beschrieben.
      Hinweis: Wenn die Zellen etwa 40-50% konfluent, bereit, transfiziert werden, sind sie.
    2. Hinzuzufügen 67 ul des Transfektionsreagenz auf 472 & mgr; l der reduzierten Serum-Medium in einem Reaktionsgefäß. Kontakt mit unverdünntem Transfektionsreagenz mit der Rohrwand zu vermeiden.
    3. Hinzuzufügen 23 ug pLL3.7 enhanced green fluorescent protein (eGFP) 9 in das Transfektionsreagenz / reduziert Serum Mediengemisch.
    4. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei RT.
    5. Ersetzen Sie die Caco-2-Zellen "Wachstumsmedien mit 8 ml 10% FBS in DMEM.
    6. Fügen Sie die DNA / Transfektionsreagenz / reduziert Serum Medien Mischung tropfenweise in die Schale.
    7. Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und backward Richtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung.
    8. Die Schale in der 37 ° C-Inkubator.
    9. Ersetzen Sie die Medien in der Schale mit 10 ml Wachstumsmedium einen Tag nach Beginn der Inkubation.
    10. Überwachen Sie die Genexpression.
      1. Überwachen Sie die Genexpression ohne 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Färbung. Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, bestimmen den Prozentsatz der Zellen, die grün sind. Der Anteil stellt die Transfektionseffizienz.
      2. Überwachen Sie die Genexpression mit DAPI-Färbung.
        1. Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dreimal Waschen der Zellen.
        2. Fixieren die Zellen durch Zugabe von 10 ml von 4% Formaldehyd in PBS (10 min Inkubation bei RT).
        3. Dreimal mit PBS waschen der Zellen.
        4. Die Zellen im Dunkeln inkubieren für 15 min bei RT mit 8 ml PBS, das 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% Digitonin.
        5. Dreimal mit PBS waschen der Zellen.
        6. Usingen ein Fluoreszenzmikroskop, bestimmen die Anzahl der Zellen, die grün / blau im Vergleich zu denen, die blaue (Abbildung 2 oberes Feld) sind. Der errechnete Prozent stellt die Transfektionseffizienz.
  2. Verwenden des Lentivirus Expression System 10
    1. Seed menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T-Zellen in einer 15 cm Gewebekulturschale (10% FBS in DMEM als Wachstumsmedien).
      Hinweis: Wenn die Zellen etwa 60-70% konfluent, bereit, transfiziert werden, sind sie.
    2. Fügen Sie 162 ul der Transfektionsreagenz auf 1.133 & mgr; l der reduzierten Serum-Medien in ein Mikrozentrifugenröhrchen 11. Kontakt mit unverdünntem Transfektionsreagenz mit der Rohrwand zu vermeiden.
    3. In 24 ug pLL3.7 eGFP (oder ein anderes Konstrukt), 15,6 ug Rev-Response-Element (RRE), 6,0 & mgr; g REV, und 8,4 ug des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG) in das Transfektionsreagenz / reduced Serum Medienmischung.
    4. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei RT.
    5. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 16 ml 10% FBS in DMEM.
    6. Fügen Sie die DNA / Transfektionsreagenz / reduziert Serum Medien Mischung tropfenweise in die Schale.
    7. Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. Es ist normal, einige der HEK293T-Zellen freistehend an dieser Stelle zu sehen.
    8. Die Schale in den Inkubator.
    9. Nach 24 Stunden Inkubation, ersetzen Sie die Medien in der Schale mit 25 ml Wachstumsmedium.
    10. Am folgenden Tag, sammeln das Wachstumsmedium, das die Lentivirus (erste Kollektion).
    11. Wiederholen Sie Schritt 2.2.10 mehr Lentivirus (die zweite Sammlung) zu sammeln.
    12. Bündeln die erste und die zweite Sammlung, und entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation (2500 × g für 5 min).
    13. Filtern Sie die Sammlung mit einem Einweg-Flaschenaufsatz-Filter (0,45 um Poren) undKonzentrat, das Virus durch Zentrifugation der Sammlung 31.400 × g für 2 Stunden bei RT (JA-20-Rotor). Markieren den Boden des Zentrifugenrohrs, wo das Pellet entfernt. Den Überstand umfüllen, und lassen Sie das Rohr bei RT invertiert für etwa 15 min.
    14. Resuspendieren virushaltige Pellet mit 100 ul 1X PBS. Vermeiden Sie Luftblasen.
    15. Bewahren Sie die konzentrierte Virus bei -80 ° C. Vermeiden Einfrieren und Auftauen.
    16. Bestimmung der optimalen Menge des Virus benötigt, um die Caco-2-Zellen durch Titration zu transduzieren. Um Kosten zu sparen, verwenden Sie eine 24-Well-Platte (0,3 ml Wachstumsmedium / well) anstelle eines 10 cm Gewebekulturschale für die Titration.
      1. Hinzuzufügen zunehmenden Mengen des konzentrierten Virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, und 50 ul / Vertiefung), ergänzt mit Polybren (Endkonzentration = 5 & mgr; g / ml) auf 40-70% konfluent Caco-2-Zellen. Schütteln Sie die Platte mit 24 Vertiefungen vorsichtig wie in 1.1.2 beschrieben.
      2. Überwachung ihrer Genexpression (Schritt 2.1.10.) (Abbildung 2 unten4 Platten).
    17. Da die Expression des Transgens in der Regel aufrechterhalten, pflegen die transduzierten Zellen für zukünftige Experimente und ihre Genexpression kontinuierlich zu überwachen (Schritt 2.1.10.).

3. Förderung der Lipoproteinsekretion

  1. Mit Hilfe der regulären Gewebekulturschale
    1. Vorbereitung einer 100X Lipidgemisch durch Mischen von 50 mg Ölsäure 40 mg Lecithin und 48 mg Natriumtaurocholat. Bringen Sie die Lautstärke auf 900 ul mit PBS (ausreichend für 8 Geschirr). Mischen Sie den Lipidmischung kräftig.
    2. Add 900 ul 100X Lipidgemisch in 89,1 ml Wachstumsmedium. Zu mischen, und Filtern der lipidhaltigen Medien. Die Endkonzentrationen (1X) Ölsäure, Lecithin und Natriumtaurocholat sind 2,0 mM, 1,36 mM und 1,0 mM.
    3. 10 ml des lipidhaltigen Medien zu den Zellen.
    4. Die Zellen mit dem lipidhaltigen Medien Inkubieren 4 Stunden in eine 37° C Inkubator.
    5. Dreimal mit PBS waschen der Zellen.
    6. 10 ml Wachstumsmedium zu den Zellen, um die Lipoproteinsekretion sammeln.
    7. Inkubieren für 2 Stunden in einem 37 ° C Inkubator.
    8. Sammeln Sie die Lipoprotein-haltigen Medien.
  2. Verwendung der permeablen Membransystem
    1. Führen Sie die Schritte, um den Lipid 3.1.1-3.1.2 Mischung herzustellen.
    2. 10 ml des lipidhaltigen Medien zur apikalen Kammer und 10 ml des Wachstumsmediums zur basolateralen Kammer.
    3. Inkubieren für 4 Stunden in einem 37 ° C Inkubator. Sammeln Sie die Lipoprotein enthaltenden Medien in der basolateralen Kammer.

4. Lipoprotein Isolation (Abbildung 3)

  1. Entfernen der Zelltrümmer aus der Lipoprotein enthaltenden Medien durch Zentrifugation (2.000 × g für 5 min).
  2. Dekantieren Sie das Medium in einen 50-ml-Tube.
  3. Hinzuzufügen 5,95 g Natriumchlorid zu den Medien.
  4. Wenn der sample wird durch die TEM untersucht werden, fügen 1 Proteaseinhibitor-Cocktail-Tablette, die Integrität der Lipoproteine ​​aufrechtzuerhalten.
  5. Bringen Sie die Lautstärke auf 23 ml mit Wasser (1,2 g / ml NaCl-Lösung Dichte).
  6. Lösen sich die gelösten Stoffe vollständig.
  7. Dekantiert die gesamte Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat.
  8. Überlagern Sie vorsichtig die 1,2 g / ml Dichte Lösung mit 0,5 ml Wasser (1,0 g / ml Dichte).
  9. Gleichgewicht der Röhre beträgt und nicht auf das Volumen.
  10. Die Rohre in dem T865 Rotor sanft zu laden.
  11. Dreh die Proben in der Ultrazentrifuge bei 429.460 xg für 24 h bei 4 ° C.
  12. Sofort isolieren die Spitze 0,5 ml Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Halten Sie das Rohr so ​​ruhig wie möglich.

5. TEM-Analyse

  1. Vorbereitung 5 ml 2% Phosphorwolframsäure (w / v) und der pH-Wert auf 6,0.
  2. Filtern Sie die 2% Phosphorwolframsäure mit einem Spritzenfilter (Porengröße: 0,2 um).
  3. Drop 20 ul der Probe auf einem Lipoprotein sterile Schüssel.
  4. 20 ul Tropfen der filtrierten 2% Phosphorwolframsäure neben der Probe auf der gleichen Schale.
  5. Fallen sanft ein EM Gitter mit der stumpfen Seite auf der Probe aufliegt.
  6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
  7. Klopfen Sie leicht die Seite des EM Gitter auf einem Filterpapier, um die Probe aus dem Netz zu entfernen.
  8. Drop Sie vorsichtig die EM Gitter mit der stumpfen Seite auf der 2% Phosphorwolframsäure ruhen.
  9. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
  10. Klopfen Sie leicht die Seite des EM Gitter auf einem Filterpapier, um die Phosphorwolframsäure aus dem Netz zu entfernen.
  11. Verwendung eines TEM, erfassen die Bilder der Lipoproteine ​​(Abbildung 4).

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt die normale 13-Tage nach der konfluenten Caco-2-Zellen. Das Aussehen des kuppelförmigen Strukturen und intrazellulären Lipidtröpfchen Charakteristik unterschieden Caco-2-Zellen. Wenn die Caco-2-Zellen werden nicht in gleicher Weise während der Aussaat dispergiert werden sie verklumpen und wuchern in bestimmten Bereichen der Schale; und es gibt ein paar Bereiche in der Schale ohne Zellen sein. Wirbelnden und Platzieren der Schale auf einer schrägen Fläche zu vermeiden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass postkonfluente Caco-2-Zellen sind anfälliger für Ablösung, wenn neue Wachstumsmedium zu den Zellen zu grob gegeben. Deshalb sollten die neuen Medien vorsichtig zugegeben werden, um Zellablösung zu verhindern.

Basierend auf diesen Studien wurde die Transfektionseffizienz von Caco-2-Zellen, die zwischen 30-60% (Abbildung 2 oben Panels). Im Gegensatz dazu war die Transduktionseffizienz von Caco-2 mit dem Lentivirus-Expressionssystem ca. 100% (Abbildung 2 Fig. 2 zeigt auch, dass die optimale Menge an konzentrierter Lentivirus betrug 10 ul. Die transduzierten Caco-2-Zellen wurden bis zu 12 Passagen aufrechterhalten. Wie gezeigt, immer noch zum Ausdruck auch nach 12 Durchgängen die transduzierten Zellen eGFP. Die Transduktionseffizienz hängt eindeutig von der Lentivirus-Konzentration. Die Bestätigung der Transfektion / Transduktion ist kritisch und sollte als eine Routine Voranalyse vor den eigentlichen Experimente durchgeführt werden. Obwohl Western Blot-Analyse kann verwendet werden, um die prozentuale Steigerung der Genexpression zu schätzen, sollte es nicht die wichtigste Methode, um die Transfektion / Transduktion bestimmen.

Verwendung des NaCl-Dichtegradienten Ultrazentrifugationsverfahren (Abbildung 3), wurden die Lipoproteine ​​von den Caco-2-Zellen sezerniert isoliert und auf einem TEM analysiert. Einige der Chylomikronen, Lipoproteinen größer als 80 nm im Durchmesser wurden in Abbildung4. Die kleineren Lipoproteine ​​VLDL, waren ebenfalls anwesend. Es ist wesentlich für die erfolgreiche Isolierung von beiden Chylomikronen und VLDL auf einem TEM bestätigen. Wie zuvor diskutiert 8 sollten biochemische Analyse nicht die primäre Methode der Bestätigung. Das Fehlen von Lipoproteinen, insbesondere Chylomikronen zeigt, dass der Lipidtransport durch die Caco-2-Zellen nicht effizient ist. Folglich werden sie nicht als ein gutes Modell, um Lipidtransport untersuchen zu dienen. Die Anzahl der Chylomikronen Teilchen bezogen auf die Gesamtzahl der Lipoproteinteilchen gezählt 8 werden. Ein hoher Prozentsatz zeigt effiziente Lipidtransport.

Abbildung 1
Figur 1. Repräsentative mikroskopische Aufnahme 13tägigen postkonfluente Caco-2-Zellen. Die intrazelluläre Lipidtröpfchen in einigen Zellen (roter Pfeil) sichtbar. Die einzigartige kuppelförmige Strukturen (schwarzer Pfeil) fovon einigen Caco-2-Zellen Rmed generell nur vorhanden, nachdem die Zellen Konfluenz erreicht. Vergrößerung = 100X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Vergleich der Wirksamkeit der Lipidbasis Transfektion und Lentivirus Expressionssystem Deckplatte:. Caco-2-Zellen wurden mit pLL3.7 eGFP unter Verwendung des nicht-liposomalen Transfektionsreagenz (Maßstab = 20 & mgr; m) transfiziert. Bodenplatten 4: Caco-2-Zellen wurden mit pLL3.7 eGFP Verwendung der Lentivirus-Expressionssystem mit verschiedenen Mengen (1, 2, 5 oder 10 ul) der konzentrierten Lentivirus (LV) transduziert. Die dargestellten Zellen wurden von der 12-ten Durchlauf der Original transduzierten Zellen. Die linke Felder zeigen die DAPI-Färbung, die mittlere panels zeigen die GFP-Fluoreszenz und die richtigen Felder zeigen die zusammengeführten Bilder. Die Lentiviren Expressionssystem war offenbar wirksamer als die lipidbasierten Transfektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3. Isolierung von Darm Lipoproteine ​​mit NaCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die Dichte-Lipoprotein-haltigen Medien ist auf 1,2 g / ml durch Zugabe der entsprechenden Menge von NaCl eingestellt. Das Volumen der Probe muss auch eingestellt werden, so dass es den gesamten Ultrazentrifugenrohrs, um einen Zusammenbruch zu verhindern, zu füllen. Um einen Dichtegradienten zu erreichen, wird mit 0,5 ml Wasser vorsichtig auf 1,2 g / ml Dichte Lösung überschichtet. Die Probe wird dann bei 429.460 × g für 24 Stunden unter Verwendung eines T865 gesponnenRotor (äquivalent zu 2,15 Svedberg-Einheiten). Die Darm Lipoproteine ​​sollten sofort durch vorsichtiges Pipettieren gewonnen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Figur 4. Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahme der durch die Caco-2-Zellen hergestellt Lipoproteine. Die Lipoproteine ​​NaCl Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden negativ mit 2% Phosphorwolframsäure (pH 6,0) gefärbt. Chylomikronen, Lipidpartikel größer als 80 nm im Durchmesser und VLDL, denen weniger als 80 nm, beide vorhanden sind. Maßstabsbalken = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In diesem Papier, um die beiden Systeme, die verwendet werden können, zu erhalten Caco-2-Zellen beschrieben werden, nämlich die normale Gewebekulturschale und die durchlässige Membran. Die Vorteile der Verwendung der permeablen Membransystem umfassen die Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten, und die Fähigkeit, das Lipid-Mischung zu inkubieren, und gleichzeitig sammelt die Lipoproteinsekretion. Jedoch sind die durchlässigen Membraneinsätze teuer, und ihre Polycarbonat-Membran nicht für eine gute Sichtbarkeit Zelle ermöglichen. Einer der Vorteile von diesem in vitro-Modell ist, dass die genetische Manipulation Studien wirtschaftlich und weniger zeitaufwändig sein. Für eine Verbesserung der Wirksamkeit sollte der Lentivirus-Expressionssystem verwendet werden. Die transduzierten Caco-2-Zellen in der Regel halten die Ausdruck ihrer Transgens.

Die Fähigkeit von Caco-2-Zellen zu erzeugen Chylomikronen ist von größter Bedeutung. Ohne diese Fähigkeit würde Caco-2-Zellen nicht in der Lage sein efficiently transportieren lipophilen Materialien, einschließlich aber nicht beschränkt auf lipophile Wirkstoffe, Vitamin A, D, E und K, sowie alle lipidlösliche Nährstoffe begrenzt. Die richtigen Methoden zu Caco-2-Zellen herausfordern zu produzieren beide VLDL-Partikel und Chylomikronen werden beschrieben. Die erfolgreiche Isolierung dieser Lipoprotein-Partikel sollten auf einem TEM bestätigt werden. Auf der Grundlage der aktuellen Literatur bietet dieses Caco-2-Modell die effizienteste Lipidtransport unter anderem Caco-2-Modelle 12-14. Allerdings ist die in vivo Lymphe Kanülierung Modell noch transportiert Lipide effizienter als jede in vitro-Modell. Die Gründe hierfür sind vor kurzem diskutiert 8, nämlich weil Caco-2-Zellen produzieren 2 verschiedene Isoformen von Apolipoprotein B, Caco-2-Zellen nicht Triglyceriden aus Monoglyceriden synthetisieren kann und die Serumkomponente kritisch für Chylomicron Biogenese niedriger im Wachstumsmedium sein . Es ist auch wichtig, um die Begrenzung der in dieser Realisierungvitro-Modell; Dieses in vitro-Modell schließt einige potentielle wichtige Faktoren wie Darmmotilität Anatomie der Darm und die Wechselwirkung mit anderen Organsystemen.

Die Hauptfaktoren, die Caco-2-Zellen zu produzieren Chylomikronen ermöglichen effizient sind die Art / Menge der verwendeten Lipide und Zelldifferenzierung 8. Ohne die richtige Kombination dieser Faktoren wird Caco-2-Zellen keine signifikante Anzahl von Chylomikronen 8 herzustellen. Zu beachten ist, sollte NaCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ordnungsgemäß durchgeführt werden. Die erfolgreiche Isolierung der Lipoproteine, hängt von Zeitpunkt (sofort ohne nennenswerte Verzögerung), gute Probenhandling (robust, ohne viel Unruhe) und sorgfältiger Pipettierung (immer nur die oberste Schicht). Richtige Technik kann durch die Verwendung vorgefärbter Lipide zu helfen visualisieren die Lipoprotein-Schicht 8 durchgeführt werden. Neben TEM, biochemische Analysen, das heißt, Apolipoprotein B und Triglycerid-Analysen, auch U sein kannsed, um die erfolgreiche Isolierung der Lipoproteine ​​zu bestätigen. Diese biochemischen Analysen, die wir bereits berichtet haben, 8, kann auch als Methoden der Quantifizierung Aufnahme dienen. Jedoch sollte TEM noch aufgrund der Tendenz der Lipoproteine ​​geführt werden, um zu aggregieren 2, was zu einer Überschätzung der potentiellen chylomicron Produktion.

Diese in vitro-Modell ist besonders nützlich für das Studium Nahrungsfettabsorption und die intestinale Absorption von lipophilen Arzneimitteln, Vitaminen und anderen lipidlöslichen Nährstoffen. Es kann auch als ein Modell der schlechten Bioverfügbarkeit von oral lipophile Medikamente zu verbessern dienen. Da lipidlöslichen Materialien in Chylomikronen durch Enterozyten für den Transport zur Zirkulation verpackt werden Chylomikronen produzierenden Caco-2-Zellen effizienter absorbieren lipophile Medikamente. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell Ermittler, um die Rolle eines bestimmten Gens in der Medikamentenabsorption durch die Darm (Pharmakogenetik) zu bestimmen. Es ermöglicht auch investigators um die Wirkung verschiedener Nahrungsfette auf die orale Bioverfügbarkeit lipophiles Arzneimittel zu vergleichen. Alle diese Anwendungen haben die zuvor 6 erörtert.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

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References

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115, (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131, (4), 1197-1207 (2006).
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