Säkerhetsåtgärder och rutiner i en (A) BSL-4 Laboratorie: 2. Allmänna metoder

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Arbete i en skyddsnivå 4 (BSL-4) inneslutningslaboratorium kräver tid och stor uppmärksamhet på detaljer. Samma arbete som görs i en BSL-2 laboratorium med icke-high-konsekvens patogener tar betydligt längre i en BSL-4 inställning. Denna ökade krav tid beror på en mängd faktorer som syftar till att skydda forskare från laboratorieförvärvade infektioner, arbetsmiljö från eventuella föroreningar och det lokala samhället från eventuellt frigörande av hög konsekvens patogener. Inne i laboratoriet, är rörelse begränsas på grund av luftslangar kopplade till de obligatoriska hela kroppen säkerhets kostymer. Dessutom krävs desinfektion av alla objekt som tas bort från klass II biosäkerhet skåp (BSC). Laboratoriespecialister måste utbildas i praxis BSL-4 laboratorium och måste visa hög kunskaper i de färdigheter de utför. Fokus i denna artikel är att beskriva lämpliga förfaranden och tekniker för att säkerställa laboratorium Biosafety och experimentell noggrannhet med en vanlig viral plackanalys som ett exempel förfarande. I synnerhet rätt teknik arbeta säkert i en BSL-4 miljö när man utför ett experiment kommer att visuellt understrykas. Dessa tekniker inkluderar: inrätta en klass II BSC för experiment, ordentlig rengöring av klass II BSC när du är klar fungerar, avfallshantering och säker hantering av avfall som genereras i en BSL-4 laboratorium, och avlägsnande av inaktiverade prover från insidan av en BSL- 4 laboratoriet till BSL-2 laboratorium.

Introduction

Som laboratoriepersonalens säkerhet hanterar hög konsekvens patogener (ingen infektion profylax eller behandlingsalternativ finns) är av största vikt, har US Department of Health and Human Services fastställt riktlinjer för anläggning konstruktion och bästa praxis för säker genomförande av arbete med patogener i biomedicinsk och kliniska laboratorier från en biosäkerhet perspektiv en. Genom lagstiftning och reglering, många av de metoder och procedurer har blivit obligatoriska krav som måste följas för arbete med dessa patogener. I USA, patogener som lätt överförs från person till person, resultera i höga fall dödligheten, och / eller har potential för större inverkan på folkhälsan och bioterrorism, kategoriseras som National Institute of Health / National Institute of Allergy och Infectious sjukdom (NIH / NIAID) Prioritet A Pathogens och eller Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism Kategori A Agents 2. Dessutom hög-konsekvens patogener klassificeras som Tier 1 Välj ombud om dessa patogener är potentiella bioterrorism agenter, har potential för mass olyckor eller förödande effekter på ekonomin, kritisk infrastruktur eller allmänhetens förtroende 3.

BSL-4 verksamhet, inklusive tillgång till institut med BSL-4 laboratorier, är mer mycket kontrollerad än BSL-2/3 operationer. Till exempel, är det betydligt svårare att få tillgång till en BSL-4 laboratorium jämfört med en BSL-2 eller BSL-3 laboratorium på grund av väsentliga krav passa utbildning, omfattande mentorskap krav, och ytterligare medicinsk biosäkerhet förutsättningar. Dessutom finns det oftast mer fysiska säkerhetsbarriärer i BSL-4 anläggning mot en BSL-2 eller BSL-3 anläggning 4-6. Som beskrivs i vår första artikel om förfaranden BSL-4 infarter och utfarter laboratoriepersonalen genomgå omfattande utbildning och psykologisk screening för att kvalificera för inträde i BSL-4 laboratorium 7. Wnom BSL-4 laboratorium, är risken för infektion och misstag undvikas eller mildras genom att följa etablerade procedurer. Forskningen måste gå försiktigt och medvetet, med minimal multitasking eller distraktioner. Böjd över i positiv tryckdräkter är svårt, och ansiktsskydd kan begränsa procedurer såsom mikroskopi. Skrymmande handskar hindra utförandet av finmotoriska uppgifter, såsom hantering av små föremål eller märkning rör. För att minimera tiden i BSL-4 laboratorier, bör laboratorie specialister granskar arbetssätt för att identifiera åtgärder som kan göras i förväg i en BSL-2 laboratorium och sedan transportera dessa material i BSL-4 laboratorium för slutförande av uppgiften (s). När du tar bort material för vidare bearbetning i BSL-2 laboratorium, är material fixeras och avlägsnas från BSL-4 laboratorium i en förseglad sekundära behållaren. Exempel på prover som kan behöva tas bort innefattar: fasta plattor eller rör av infekterat material som kommer att analyseras genom enzymkopplad immunosorbent analys (ELISA), immunfluorescensanalys (IFA), eller polymeraskedjereaktion (PCR).

Förutom större fysiska begränsningar som personlig skyddsutrustning som krävs i BSL-4 laboratorier jämfört med dem i BSL-2 laboratorier, förfaranden för inaktivering av hög konsekvens patogener i cellodlingsplattor och avfallshantering är strängare än de som krävs för mindre patogena virus studeras i en BSL-2 laboratorium. Åtminstone bör dessa metoder uppfyller CDC krav. Till exempel kan kontaminerade cellodlingsplattor och annat material inaktiveras med kemiska reagens, såsom neutral-buffrat formalin. Behandlade cellodlingsplattor eller rör som skall placeras i värmeförseglings påsar innehållande formalin och avlägsnas från laboratoriet via en dunk tank fylld med en flytande desinfektionsmedel. Avfalls hinkar fyllda med desinficerande lösningar och spray desinfektionsmedel används för att temporärt ta emot avfall som genereras under experimentet och för DISInfecting handskar, rengöring biosäkerhet skåp ytor och instrument, respektive. Kvartar ammonium desinfektionsmedel lösning på koncentration listas anses den gyllene standarden för alla amerikanska BSL-4 laboratorier (Barr J, personlig kommunikation, 2015). Fast avfall från en avfallshinken autoklaveras för att eliminera risken för förorening.

I ett försök att visuellt visa arbetsflödet och begränsningar allmänna BSL-4 förfaranden, använde vi en standard viral plackanalys som ett exempel på en vanligt förekommande viral förfarande. Medan virusanalysförfarandet beskrivs i allmänhet, vi betona om biosäkerhet metoder som används för att garantera säkerheten för laboratoriepersonal i detta protokoll. Se tidigare klassiska plack analys visualiseringar för ytterligare bakgrund på plackanalystekniken 8,9.

De förfaranden som presenteras här följer BMBL specifikationer som anges av CDC 1. Emellertid de presenterade protokollen ärspecifika för IRF-Fredrik. Varje BSL-4 Anläggningen har olika standardrutiner (SOP) och arbetssätt som påverkar genomförandet av experiment inom BSL-4 laboratorium. Alternativa förfaranden för avfallsflödet hantering och utförande av plackanalyser kan variera beroende på förvaltning och drift av dessa laboratorier. Trots det kommer en allmän förståelse för installationen av en BSL-4 kostym laboratorium och förfaranden för att utföra arbetet med klass II skåp inne i BSL-4 miljö hjälpa forskarna att förstå de begränsningar och säkerhetskonsekvenser när de överväger studier av högrisk patogener. Ökad medvetenhet om externa medarbetare av svårigheterna i arbete i en BSL-4 laboratorium kan leda till justerade förväntningar och större lätthet i att utveckla medicinska motåtgärder i forskarsamhället.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Laboratorie Entry

  1. Samla alla leveranser från en BSL-2 laboratorium för experimentet (t.ex. celler, media och förbrukningsmaterial) före inträde i BSL-4 laboratorium.
  2. Slutföra BSL-4 ingångs förfarande (skisserat i detalj i referens 7).

2. Framställning av en klass II biosäkerhet skåp i BSL-4 Laboratory

  1. Väl inne i BSL-4 laboratorium, säkerställa den dagliga interna checklista (Figur 1) har slutförts. Fyll i checklistan om checklistan inte tidigare har fyllt ut och ange vilka virus kommer att användas. Om checklistan har redan genomförts, tillfoga namn och vilket virus kommer att användas till listan.
  2. Rengöra Klass II BSC genom sprutning ned hela insidan av BSC (inklusive bågen) med 5% dubbla kvartar ammonium desinfektionslösning (t.ex. n-alkyl-dimetylbensyl-ammoniumklorid, n-alkyl-dimetyl etyl bensyl ammoniumklorid eller annan desinfektionsmedel lämpligt för medlet som används) och torka med hushållspapper 10,11. Spray 70% etanollösning inuti skåpet och bågen för att avlägsna klibbiga desinfektionsmedel lösning.
  3. Om sittande, ställ in stolen framför klass II BSC på en bekväm höjd för att säkerställa att baksidan av skåpet kan nås och att inför laboratorie specialist ligger ovanför den främre öppningen (Figur 2) 11.
  4. Förbered en avfallsbehållare för biosäkerhet skåpet. Säkerställa att den slutliga koncentrationen av dubbla kvartar ammonium desinfektionslösning i avfallsbehållaren är inte mindre än 5%. Planera för detta och göra en 10% lösning, till vilken avfallet kommer att läggas som kommer att späda ut desinfektionsmedel. Dessutom, placera en sprayflaska med 5% dubbla kvartar ammonium desinfektionsmedel lösning inne i klass II BSC att spruta någon produkt före avlägsnande och handskar på händerna under och efter slutförandet av analysen.
  5. <li> Placera lämpliga material som behövs för hela experimentet i klass II BSC så långt tillbaka i skåpet som möjligt för att undvika introduktioner upprepade material i klass II BSC och störningar av luftflödet 11.

3. Exempel: Plaque Assay

  1. Hämta virusinnehållande prov och kontrollera virus från lagringsplatsen för hand och tina material i en inkubator vid 37 ° C.
  2. Märk brunnarna i 6-brunnsplattor som skall användas i enlighet med virusspäd planerade. Markera lock och kropp av plattorna för att säkerställa ett framgångsrikt matchning om locken och kroppen skiljs åt.
  3. Ta material från steg 3,1-3,2 i klass II BSC. Placera alla objekt som inte har eller inte kommer i kontakt med viruset på ena sidan ( "ren sida") och avfall på den andra sidan ( "smutsig sida"). Om möjligt, hålla "rena poster" minst 30 cm mellanrum från "smutsiga objekt" under aerosol genererande aktiviteter 11.
  4. Arbeta så nära insidan mitten av klass II BSC som möjligt, eftersom insidan centrum är utformad för att vara det mest effektiva läget för att skydda sig själv 11.
  5. Avlägsna 50 pl av virusprov och kontrollvirus och placera i 450 | il Dulbeccos modifierade Eagles medium med 2% fetalt bovint serum. Gå vidare med att göra serieutspädningar så långt ut som behövs (figur 3A).
  6. Under utspädning, blanda de virusprov åtminstone 5 gånger med en pipettspets långsamt och försiktigt samtidigt som man försöker i proverna minimera luftbubbla generation. Byt pipettspetsar efter varje tillsats till nästa utspädning väl.
  7. I den sista utspädningen, efter blandning av provet 5 gånger, kasta 50 pl virusprov till avfallsbehållare för att säkerställa lika stora volymer av späd.
  8. Vid avyttring av tips, skölj varje spets med desinfektionslösning från avfallshinken att sanera insidan och utsidan av spetsen innan expelling spets i avfallshinken.
  9. När de spädningar görs, ställ utspädnings brunnar åt sidan och börja aspirera media från brunnarna i cellodlingsplattor och lämnar 500 pl av media i varje brunn i en 6-brunnsplatta.
  10. När den är klar med pipettspetsen, aspirera desinfektionslösning från avfallshinken till toppen av pipetten med hjälp av en manuell, justerbar volym, tryckknapp pipett, för att säkerställa korrekt dekontaminering av insidan av pipetten. Lämna spetsen i avfallshinken till slutet av experimentet.
  11. När media har tagits bort från plattorna, tillsätt 100 pl av den korrekta provet i rätt väl i förväg märkta plattor i duplikat, ändra tips vardera för varje prov.
  12. Efter avslutad plackanalys vaccinationer, spraya av handskar på händerna med desinfektionslösning och använda en pappershandduk indränkt med desinfektionslösning för att torka av utsidan av alla plattorna innan placera plattorna tillbaka i inkubatorn för hand. Retorv denna process tills alla plattor är tillbaka in i inkubatorn.
  13. Vagga plattorna i en figur-8 rörelse för att säkerställa korrekt dispergering av provet över cellerna var 15 min i 1 h.
  14. Efter slutförandet av gung plattor, retur plattorna in i klass II BSC tillsammans med en blandning av 2 x Eagles minimala essentiella medium och 1,6% dragant, ett halvfast överlägg som är lättare att manipulera än agaros, som används för en överlagring av plackanalys.
  15. Tillsätt 2 ml av överlagringsblandningen till varje brunn i en 6-brunnsplatta och rock återigen i en figur-8 rörelse för jämn fördelning av överlagringen i hela ytan av brunnen. Upprepa denna process tills alla används väl är övertäckt med overlay blandning.
  16. Se till att spetsen på serologisk pipett inte vidrör någon vätska i brunnarna för att undvika korskontaminering när man utför överlagringsförfarandet.

4. Avfallshantering och rengöring av instrument och biosäkerhetsskåp

<ol>
  • Helt dränka allt avfall i 5% desinfektionslösning i avfallshink under en kontakttid av åtminstone 10 min. Desinficera pipettspetsar, serologiska pipetter, och annat avfall som beskrivits ovan. Dessutom spraya avfallshinken (inifrån och ut) med 5% desinfektionslösning låt lösningen förblir i kontakt med avfallshinken för en kontakttid av 10 min.
  • I väntan på kontakttiden förflyta för avfallet, blöt en pappershandduk med 5% desinfektionslösning, torka instrument såsom mikropipetter, och ta bort dem från BSC. Spray behandskade händer med 5% desinfektionssprit innan föra handskar på händerna ur klass II BSC.
    1. Efter avlägsnande av mikropipetter från BSC, torka dem med en separat pappershandduk med 70% etanollösning för att undvika klibbiga uppbyggd på instrumenten. Spray några instrument som inte effektivt kan torkas av med 5% desinfektionsmedel och lämna i kontakt med lösningen i BSC 10 min.
  • Efter tillräcklig kontakttid, ta bort alla objekt från BSC. Ta föremål, inbegripet avfall hink med avfallsmaterial, till diskbänken. Skölj objekt som kan återanvändas för att avlägsna desinfektionsmedel återstod. Returnera alla objekt till deras minnesplatser.
  • Rengöra Klass II BSC: s arbetsyta, skåpsidor och tillbaka, inre av glas och fönsterbågen 1 med 5% desinfektionslösning, följt av 70% etanollösning.
  • Dra ut och tömma serologiska pipetter från avfallshinken och placera utanpå desinficeras serologiska pipetter i separata pipett fack för autoklavering (serologiska pipetter kan presentera en avfallsfara och kan riva genom soppåse. Placera dessa pipetter i en hård ensidig behållaren innan autoklavering).
  • Häll innehållet i avfallshinken till en sil placerad i botten av sink.
  • Ta en biologiskt avfallsbehållare som är fodrad med en röd biologiskt påse till diskbänken och dumpar innehållet i strainer in den röda biologiskt påse. Inte når in i sil för att ta bort mikropipett tips som kan fastna på insidan av silen. Hit silen längs insidan av avfallsbehållaren tills alla tips tas bort, eller använd en pincett för att ta bort tips från silen.
  • Skölj ur avfallshinken och plats att torka på räcket bredvid diskhon.
  • 5. Autoklavering Avfall

    1. Ta bort biologiskt påse från biologiskt avfallsbehållaren och placera i en autoklav bricka på en vagn.
    2. Lämna Biohazard påsar öppna och placera en bit autoklav tejp över utsidan av påsen, som förbinder sidorna av autoklav facket för att hålla påsen säkras i facket.
    3. Placera två bitar av autoklav tejp på serologiska pipettspetsen fack och märka den med sina initialer och datum. Placera serologisk pipett facket på vagnen med autoklav facket.
    4. Öppna autoklaven. Anslut den medföljande autoklav lastning / lossning cart till autoklaven och ta fram det indrag autoklav plattform för att vila på vagnen.
    5. Ta bort metallstången från autoklaven och öppna den övre. Placera en biologisk indikator flaska innehållande sporer av Geobacillus stearothermophilus i metallstången för att kontrollera att autoklaven steriliseringscykeln har slutförts.
    6. Placera metallstången in i centrum av dränagepåsen i autoklaven magasinet men se till att metallstången är fortfarande lätt att komma åt.
    7. Placera autoklav bricka fylld med avfall och serologisk pipett facket på det uppfällbara autoklav plattformen och skjut tillbaka i autoklaven.
    8. Lösgöra autoklav lastning / lossning i kund från autoklaven och stäng autoklav dörren.
    9. Starta autoklaven.
    10. Lämna inte autoklaven tills cykeln har startat. Rörelse skärm autoklaven indikerar återstående tid för att springa.
    11. Efter autoklaven körningen är klar tar den biologiska indicator och utvärdera för tillväxt genom upphettning i ett specificerat inkubator. Om tillväxten upptäcks på den biologiska indikatorn åter köra soporna i autoklaven, och bedöma på nytt indikator. Om ingen tillväxt detekteras bort skräp från anläggningen.

    6. Exempel: Fastställande och färgning av placktester

    1. Efter ett lämpligt antal dagar (som är beroende av det virus som används) har gått tillbaka tillbaka in i laboratoriet och utför steg från avsnitten 1 och 2 en gång.
    2. Försiktigt bort plack analysplattor från inkubatorn avslutades i steg 3.1.2, och placera i klass II BSC hand.
    3. Pipett bort allt material och beläggningsmaterial och fördela i desinfektionslösningen behållare och ersätta med en blandning av 10% neutral formalin och 0,8% kristallviolett 12,13. Låt blandningen stanna kvar på plattorna under 30 min för att inaktivera viruset på plattorna.
    4. Efter inaktivering, försiktigt bort neutralaformalin / kristallviolett blandning och plats i en separat avfallsbehållare som ska neutraliseras före avyttring.
    5. Spraya handskar på händerna med desinfektionsmedel och torka av utsidan av plattorna innan de passerar dem ut ur Klass II BSC såsom beskrivits ovan.
    6. Fortsätt till diskbänken, skölj plattorna för att avlägsna överskott fläck, och sedan placera plattorna på en vagn för att torka.
    7. När plattorna är helt torr, använd en ljuslåda för att räkna plattorna. Registrera alla punkter och beräkna virustitrar från standard ekvation (Figur 3B).

    7. Ta bort Prover från BSL-4 Laboratory

    1. Inaktivera alla prover som kommer att manipuleras enligt BSL-2 laboratorieförhållanden. Följ en av två metoder som godkänts av den interna biosäkerhet kontor på IRF-Frederick med hjälp av 10% neutral formalin (NBF) eller Trizol LS (fenol, guanidinisotiocyanat, ammoniumtiocyanat, natriumacetat, glycerol) 1,14. överföring samples till ett nytt rent rör eller platta utanför BSC före förpackningen för avlägsnande från BSL-4 laboratorium.
    2. Värmeförseglingsinaktiverade prover i rör eller plattor i ett värmeförseglingspåse innehållande tillräckligt med 5% desinfektionsmedel eller fixeringslösning för att desinficera insidan av påsen och utsidan av provrören undergår överföring ut ur BSL-4 laboratorium. Placera påsen i en annan påse efter samma procedur.
    3. Försegla den andra påsen och placera det värmeförseglade påsen in i en dunk tank innehållande 5% desinfektionsmedel lösning under minst 10 min för att desinficera utsidan av det värmeförseglade påsen.
    4. Fyll i en dunk tank loggbok i labbet genom avgränsa antalet och storleken av rör, volym i rör, medel som används, inaktive metod som används, och rum där prover kommer att överföras.
    5. Samordna med en kollega på utsidan av BSL-4 laboratorium för att hämta påsen från dunk tank och ta prover till BSL-2 laboratorium.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Efter lämpliga förfaranden inom BSL-4 laboratorium är avgörande för att säkerställa en säker och effektiv slutförande av analyser. Genom att hänvisa till den färdiga daglig inhemsk checklista (Figur 1), laboratoriepersonal se till att utrustningen är i full drift. Korrekt positionering kropp i centrum av BSC säkerställer att Experimentet utförs under optimala luftströmningsförhållanden (figur 2). Virusprovet är seriespäddes för erhållande av plåtar som har 30-300 plack per platta (figur 3A), samt av vilka virustiter (figur 3B). Ett antal faktorer påverkar bildandet av plack, inklusive virus tropism för värdcellinjer, ympning teknik, förutsättningar för virustillväxt, lämplig utspädning intervall, och overlay val 8. Avfall som genereras i BSC under förfarandet ordentligt desinficerade före avlägsnande från BSC och igen genom autoklavering förelämnar BSL-4 miljö. Genom att följa dessa förfaranden, har inga laboratorieförvärvade infektioner har registrerats under BSL-4 forskning vid IRF-Fredrik.

    Figur 1
    Figur 1:. Prov dagliga interna system checklista Daily slutförandet av denna checklista säkerställer att laboratoriepersonal har kontrollerat utrustning inom laboratoriet (viktigast BSC) innan man inleder arbetet. Om BSC befinns vara utanför det kalibrerade området, detta BSC inte användas, och underhåll bör anmälas. Alla BSC skall vara rätt kalibrerad och fungerar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2. Baksida och sida av en laboratorie specialist pipettering prov i en klass II biosäkerhet skåp (A) avfall hink med gul desinfektionslösning och använda pipetter är till höger om brunnsplattor (B), och desinfektionsmedel sprayflaska är att rätt avfallshinken (A). klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3: Beräkning av viral titer av prov Viral titer uttrycks som plackbildande enheter (pfu) per ml.. Att beräkna den virala titern, räkna antalet klart definierade plack (pfu) och dividera med produkten av utspädningsfaktorn (d) gånger volymen av utspädd virus tillsatta till brunnen (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Arbete i en BSL-4 laboratorium kräver betydande tid och ytterligare uppmärksamhet på detaljer. Alla typer av arbete i denna miljö kräver välutbildade, noggrann och samvetsgranna människor. Standarden viral plackanalys ger en exakt modell av ett gemensamt förfarande för att arbeta med hög konsekvens patogener i BSL-4 laboratorium, som analysen omfattar flera stora koncept där laboratoriepersonal måste utbildas.

    Den första stora konceptet är korrekt användning och tillämpning av säkra rutiner i klass II BSC, som fungerar som primär inneslutning för hög konsekvens patogener. Förståelse för hur en klass II BSC funktioner kommer att diktera metoder som kraftigt begränsar exponerings risker för individer. Arbetsförlopp från ett rent område ( "ren sida") till ett förorenat område ( "smutsig sida") över arbetsområdet i klass II BSC bidrar också till att undvika korskontaminering 11. Ren och förorenat material och suppltalet bör skiljas åt för att begränsa rörelsen av förorenade föremål över rena poster.

    Den andra stora koncept är fysisk och biologisk avfallshantering. Lämpliga åtgärder i avyttra båda typerna av avfall är viktigt att se till att de laboratoriespecialister förblir säker och miljön inte förorenas. Steg under ett experiment är utformade för att inaktivera och förstöra patogener innan proven förs ut från BSL-4 laboratorium. Exempel på sådana kritiska steg innefattar: pipettering desinfektionsmedel i varje spets, vilket gör att åtminstone en 10 minuters kontakttid potentiellt förorenade material med desinfektionsmedel, autoklavering avfall och validera sterilitet under autoklavcykler. Dessa steg är utformade att vara redundant för att säkerställa destruktion av hög-konsekvens-patogener.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics