预测与基因调控元件的验证激活过程中维甲酸诱导胚胎干细胞分化

1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

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Abstract

胚胎发育是涉及到许多基因的激活和镇压一个多步骤的过程。在基因组中的增强子元件是公知的细胞分化过程中以促进基因表达的组织和细胞类型特异性调节。因此,他们的鉴定和进一步调查,以了解细胞的命运是如何决定的重要。基因表达数据( 例如,微阵列或RNA-SEQ)和染色质免疫沉淀(ChIP)为基础的全基因组研究(芯片起)结果的整合使得这些调控区域大规模鉴定。然而,细胞类型特异性增强剂的功能验证进一步要求体外体内实验程序。在这里,我们描述了活性增强剂如何可以识别和实验验证。通过芯片起数据分析,2)克隆和EXPER 1)鉴定调节区:此协议提供了一步一步的工作流程,其包括在报道实验所识别的基因组序列的推定的调节潜力imental验证,和3)测定增强子活性的体内通过测量增强RNA转录水平。所提出的协议是不够详细,帮助任何人设立这个工作流程中的实验室。重要的是,该协议可以很容易地适应,并在任何细胞模型系统中使用。

Protocol

1.基于芯片序列分析选择增强

  1. 从http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/下载RXR芯片起原始数据FASTQ文件(mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz)
  2. 下载并提取对准所需的BWA索引文件(在我们的例子: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    注:关于生物信息学分析的步骤参观https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts获取更多信息,并下载下面使用的脚本。
  3. 对准例子FASTQ文件MM10基因组(使用脚本:perform_alignment.sh)。这将创建一个.bam文件和比对统计数据的文件夹中。不结盟RXR芯片起的数据(mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam),以及相应的索引文件(.bai)都可以在这里:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    注:BWA是一个软件包,对齐RELAtively短序列( 例如,芯片起的结果),以一序列数据库,如鼠标参照基因组( 例如,MM10)13。
  4. 润峰主叫和从头主题分析脚本(callpeaks.sh)。使用.bam文件作为输入。该脚本是基于荷马findPeaks 14。
    注意:输出文件给我们关于峰的总数,富集的图案,背景的百分比,并与基序的靶序列相关信息。 ( 图1)。通常几个主题中列出了它们的重要性顺序。
  5. 重新映射排名第一的基序(NR半`AGGTCA`)(使用脚本:remap_motif.sh)
    注意:作为结果,脚本生成.bed文件,该文件的ChIP-峰覆盖包含感兴趣的转录因子的规范结合位点的基因组区域,将显示。
  6. 下载并可视化对准RXR芯片起读取结果(mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam(也下载.bai))和AGGTCA基序发生(mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed)通过结合基因组浏览器(IGV)15,以确定推定RAR / RXR结合位点( 图2图3)。
    注:各种芯片起的数据整合,将有助于更精确地预测好的候选增强16,17。最近的研究表明,活性增强剂通常富集P300和H3K4me1和H3K27ac相关,并位于开放染色质区域,从而显示DNase的我超敏反应还建议18-21。
  7. 使用在IGV 15“ 定义的感兴趣区域 ”,以获得200 -所选择的基因组区域的400bp的序列和用于随后的引物设计的序列。

2.报告基因检测

注:萤光素/萤光素酶系统用于作为一个非常敏感的报告基因检测的转录调控。取决于增强子活性萤光素酶是产生将催化萤光素氧化成氧化萤光素导致bioluminescense,它可以被检测到。作为第一步骤,确定推定的增强子序列应当亚克隆到报告载体( 例如,TK萤光素酶22的pGL3或NanoLuc)。

  1. 引物设计
    1. 设计PCR引物200扩增-通过引物3假定增强地区的400基点(可在这里:http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23
    2. 复制 - 粘贴IGV基因组序列,其中包括假定的结合位点为:引物(见步骤1.7)。集产品尺寸范围250 - 在引物3 300基点。
    3. 验证使用UCSC基因组浏览器的PCR引物在硅片 PCR工具(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)24
      注意:此协议在后面的步骤用HindIII和BamHI限制性内切酶进行克隆。检查是否由UCSC 的In-硅片的PCR工具预测将包含AAGCTT或GGATCC限制性位点的PCR扩增序列( 例如,http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)。
    4. 获得从商业供应商所需的引物。
  2. 从基因组DNA增强子序列的PCR扩增
    1. 从净化主要细胞( 初级胚胎成纤维细胞)的模板基因组DNA。使用基因组DNA的分离商业工具并按照制造商的说明。
      注:基因组DNA的高品质是成功的PCR扩增至关重要。如果PCR是不从基因组DNA容易适当BAC克隆都可以使用。
    2. 制备含有100ng的基因组DNA,5μl的10×缓冲液,3微升用MgSO 4(25毫摩尔),5微升的dNTP(2mM的各),1.5微升正向引物(10μM),1.5微升启引物50微升的PCR反应(10μM) ,1微升DNA聚合酶
    3. 设置PCR循环(2分钟95℃(20秒95℃,10秒58 - 65℃,18秒70℃)X25重复,2分钟70°C,永远4℃)。设置退火温度为审议底漆的预计值的Tm值。
    4. 净化与商业PCR纯化试剂盒PCR产物,并按照制造商的说明。
    5. 通过用引物重复PCR如上使用,但对它们的5添加突出端引入用于克隆的限制性位点'末端( 例如,正向:5'-ATAT AAGCTT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'(HindⅢ位),版本:5'-TATA GGATCC XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3'(BamHⅠ位))。
    6. 运行5微升在琼脂糖凝胶上对PCR产物的检查非特异性PCR产物。
      注:如果检测到更多的频段,从而使整个PCR产物和由商业凝胶提取试剂盒净化合适的频段。
    7. 限制
      注意:要插入克隆TK启动22纯化的PCR产物和载体( 例如,TK-吕克)的上游侧应用HindIII和BamHI消化。
      1. 制备含1微克纯化的PCR产物,1微升的HindIII(20U /微升),1微升的BamHI(20U /微升)和5微升10X缓冲液50微升反应混合物。
      2. 制备250μl的反应混合物含有5μg的向量(TK吕克,或替代报告载体),5微升的HindIII(20U /微升),5微升的BamHI(20U /微升),5微升的热敏碱性磷酸酶(1U /微升)和25微升10X缓冲。
        注:AP治疗载体的大大降低单消化的载体的自身连接,从而所述背景。
      3. 孵育4小时,反应混合物在37℃,然后纯化消化的PCR产物和用市售的PCR纯化试剂盒的载体。
    8. Ligatioñ
      1. 设置用于连接在PCR管包括2微升10×T4 DNA连接酶缓冲液,10毫微克TK-吕克矢量,50纳克刀片(消化的PCR产物),1微升T4 DNA连接酶(400单位/微升)和无核酸酶水,反应多达20微升。
        注:准备一个阴性对照,其中在反应中不包含插入片段。
      2. 轻轻吹打起来并混合反应下来,后短暂离心使用mini-离心机的PCR管,然后在室温孵育10分钟。
      3. 热灭活在65℃下10分钟,然后冰浴,并使用5微升用于转化的产物进50微升感受态细胞( 例如,DH5α)。
      4. 使用标准的热休克过程转化细菌,拿起殖民地和隔离质粒DNA与商业套件。通过之前的下一步测序验证所有的结构。
    9. ES细胞的转染
      1. 使用48孔板。加入200微升0.1%明胶SOLUT离子/孔30分钟前,细胞电镀。
      2. 板胚胎干细胞(ES细胞)转染的前一天。使用无饲养ES细胞和板以每孔3×10 4个细胞在250μl的ES介质/孔的密度。
      3. 制备质粒混合物(每个组合计算了8个孔,4未处理和4视黄酸处理的) 混合1:1250纳克TK-吕克空(阴性对照),950纳克β半乳糖苷酶编码向量(的βGal), 混合2 :1.250纳克TK-吕克的Hoxa1增强(阳性对照),950毫微克的βGal, 混合3:1.250纳克TK-吕克PRMT8增强剂(感兴趣区域),950毫微克的βGal。
        注:ES细胞表达所需的转录因子(RAR / RXR)。离开井未转染的过程中的荧光素酶和β半乳糖苷酶的测量后,确定基值。
      4. 转染的品质降低血清培养基添加到每个质粒混合高达106微升总体积(足够用于8孔)。
      5. 加入4.5微升ES质量染离子试剂通过移液15倍上下仔细混合。在室温下孵育10分钟的转染混合物。
      6. 加入13微升转染混合物,以每口井的细胞,吹打调匀。将细胞放回孵化器(37°C)O /配体治疗N前。
      7. 从细胞中吸小心取出媒体,并添加250微升新鲜培养基/孔含有0.01 - 1μM全反式维甲酸(RA)作为最终的浓度或DMSO作为溶媒。孵育细胞24 - 48小时。
        注:维甲酸对光敏感。
    10. 细胞裂解液的制备
      1. 稀释5倍裂解缓冲液(1.25毫升中含0.5摩尔Tris pH值= 7.8,加入1ml的1M二硫苏糖醇(DTT)(以H 2 O),将10毫升的0.1M的EDTA的pH = 8.0,将50ml甘油,加入5ml的Triton X-100,无菌加水至100毫升)至1x使用无菌水,加入20微升的1M DTT / 10毫升并在使用前平衡至室温。制备出10毫升在测定当天的48孔板中。 从细胞中吸小心取出介质。用1X PBS冲洗细胞一次。 200μl的1×裂解缓冲液/孔直接添加到细胞中。
      2. 在RT(化学裂解)摇动2小时。冻结在平板上的细胞裂解物在-80℃(机械裂解)。裂解物可以储存在-80℃几天。
      3. 解冻的裂解。完成解冻后,使用电子多道移液器转移细胞裂解物至96孔板中。转移80微升细胞溶胞产物的96孔透明板β半乳糖苷酶测定法和40微升细胞裂解物,以白色板为萤光素酶测定。避免形成任何气泡。
    11. β半乳糖苷酶测定法
      注:β-半乳糖苷酶或替代性的第二记者应该被用作内部对照,以占非特异性的实验变异。
      1. 准备β半乳糖苷酶底物缓冲液80.0克Na 2 HPO 4•7H 2 O,3.8克 NaH 2 PO 4•H 2 0,30.0克氯化钾,将1.0g硫酸镁4•7H 2 O,使多达1000毫升无菌水。调节pH至7.4。过滤消毒(0.2微米),并存储在4℃
      2. 混合1毫升β半乳糖苷酶底物缓冲液与4毫克ONPG(邻 - 硝基苯基β-D-半乳糖苷酶)。使用前添加3.5微升每1毫升缓冲液2-巯基乙醇(βME)的。 100μl的β半乳糖苷酶底物缓冲液添加到80μl的细胞裂解物。
      3. 在37℃孵育反应,直到昏黄色开发。阅读在OD 420处的吸光度的酶标仪和出口数据。
        注:时间取决于转染效率,通常是超过30分钟不再。
    12. 萤光素酶检测
      1. 准备50毫升萤光素底物试剂:15.1毫克D-荧光素盐,82.7毫克ATP盐,185毫克硫酸镁4•7H 2 O,加至50ml聚丙烯管,然后加入1.5毫升1M的HEPES缓冲液,48​​.5毫升ATP免费的水,旋涡,确保所有的化合物完全溶解。保持5 - - 10毫升分装,在-80℃。
      2. 温馨5毫升萤光素底物试剂,以RT在开始之前。吸移管将100μl底物试剂到含有40微升细胞溶胞产物的白色板的每个孔中,并立即用发光计数器机器测量信号。
      3. 从一式三份转染至少三个独立的实验获得的活动。
      4. 首先计算每个井的基部标准化荧光素酶活性和碱规范化β半乳糖苷酶值减去用于从测得的各值的非转染的细胞测得的平均值。然后计算萤光素酶/β半乳糖苷酶的活性的比值。

    3.增强RNA的表征

    注:增强活动的一个更直接的指标已经从最近的基因组-W涌现该确定的许多短的非编码RNA,从50至2000个核苷酸,这是从增强剂转录大小不等,和被称为增强剂的RNA(eRNAs)IDE研究16,25,26( 图4)。尔娜感应与相邻的外显子编码基因的诱导高度相关。因此,与信号相关 ​​的增强子活性可以在体内通过比较用RT-qPCR的各种条件之间尔娜生产定量。

    1. 指引引物设计用于检测尔娜用RT-qPCR的
      1. 选择尔娜测量基因组区域是至少1.5 - 2 kb的距离注释转录起始位点。
        注:重要的是,高含量的整个基因内增强剂的mRNA转录防止尔娜的准确定量的有义方向,在基因内增强剂反义eRNAs是可检测的,并且在基因外增强剂水平eRNAs相似。
      2. 作为一般规则,使用地区200 - 1,000 bp的往复m为转录因子结合的任一对有义或反义链( 图4图6),用于引物设计的兴趣点的中心。
        注意:如果GRO-以次,DNase的以次,H3K4me1,H3K4me3的或H3K27ac芯片起数据可从所需细胞类型和条件下,它可以用于更准确的引物设计。 eRNAs从特征在于高水平的H3K4me1和ME3的推定增强子区转录。 eRNAs的表达与活化蛋白增强标记H3K27ac的富集正相关。
      3. 设计PCR引物eRNAs的基于染料的荧光RT-qPCR的测量由引物3(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23生成用于引物设计为每反义序列(反向有义链的互补): http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html。插入200 - 引物设计300bp的有义或反义序列的。
    2. 尔娜转录的测量
    3. 根据制造商的建议从处理的细胞与商业酸性苯酚/基于氯仿提取试剂分离总RNA。
    4. 使用DNA酶I,以逆转录反应使用它们之前,对待分离的RNA。根据逆转录现有的制造商的建议,灭活脱氧核糖核酸酶。
    5. 测量RNA浓度的DNase I处理后,用每RT反应1000纳克。使用高品质的逆转录酶。
      注:由于大量eRNAs可能无法聚腺苷酸化,反转录需要使用随机引物。
    6. 检测用标准程序逆转录尔娜用RT-qPCR的。测量用于归一非治疗依赖性的mRNA(如 36B4,PPIA,GAPDH,Actb的)。

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Representative Results

我们使用了泛特异性RXR抗体以鉴定的全基因组其类风湿性关节炎调节基因在它们的靠近受体富集。从用视黄酸处理的ES细胞获得RXR芯片起数据的生物信息学分析揭示了核受体半位点(AGGTCA)下的RXR占用位点( 图1)的富集。使用生物信息学算法我们映射回的基序,检索结果为半位点的RXR芯片起数据( 图2)。这种分析有助于我们准确地识别,用规范的核受体结合位点重叠的沉淀峰。这些网站在IGV的可视化表示中的Hoxa1,一个以前的特点RAR / RXR目标( 图2图3)的接近这些转录因子的富集。我们还确定了新的RA的靶基因,即PRMT8 27。此Latter区包含与两个半位点(AGGTCAAGGTCA)( 图3)之间没有间隔物核苷酸的直接重复。在功能验证确定了的Hoxa1的确可以绑定RAR / RXR和规范由RA元素构建含有〜300bp的基因组区域,包括确定的元素TK-荧光素酶报告载体。我们还构建的载体没有响应元件( 图5)。 ES细胞转染和荧光素酶活性在不存在和视黄酸的存在下( 图5)测量的。含有视黄酸反应元件(RARE)构造确实在治疗RA显示出增加的荧光素酶的信号强度,而没有不多见结构不是诱导。

我们还研究了的Hoxa1增强剂的视黄依赖性酸的活性。以确定是否所述的Hoxa1 RAR / RXR结合的增强子C的有义和反义尔娜表达与该基因的mRNA的表达orrelate,我们还测量的Hoxa1 mRNA的水平( 图6)。这些结果证实了增强活性通过短期治疗RA(3小时)诱导的,从而证实了增强剂可能参与RA的依赖性增强调节。

图1
图1. 荷马D E诺 母题的结果。荷马的例子RXR芯片起产生的输出HTML(homerResults.html)所示。序列标识对应的顶部在RXR结合位点通过从头 motif发现鉴定丰富转录因子图案。 7463 RXR占用被用于基序搜索基因组区域。这些区域的77.66%含有AGGTCA样基序(列为#1)。有关详细说明,请访问:(http://homer.salk.edu/ho滨海/主题/) 点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. 排列RXR芯片起的利息。可视化的模式发现的基因组区域读取(mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam和AGGTCA主题事件(mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed)通过综合基因组学查看器(IGV)。路线是由读链有色(读在+链:红, -股:蓝色)基因组用于对齐:MM10。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3 的Hoxa1和PRMT8增强剂。来自未处理和RA处理(24小时,1μM)的胚胎干细胞27获得RXR芯片起信号的IGV快照的基因组基因座被示出。鉴定结合序列为红色。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
4. 实验设计试验尔娜编码序列选择用于增强RNA(尔娜)测量增强剂应位于至少1.5 - 2 kb的距离相对于所述最接近的基因的转录起始位点(TSS)。的利益和基序分析转录因子(TF)的芯片起的数据可以被用来识别直接结合位点的全基因组。作为转录结合TIONAL共激活因子(如 P300)往往标志着远端增强,丰富了TF和P300这两个地区是很好的候选增强。 eRNAs的表达是积极与激活增强组蛋白标记H3K27ac的富集相关。地区200 -推荐尔娜引物设计1000碱基有义或反义方向远离转录因子结合中心请点击此处查看该图的放大版本。

图5
5. 表示记者荧光素酶活性构造ES细胞 。所述的Hoxa1增强剂表明基因组区域克隆到TK-吕克载体并转染到胚胎干细胞。建设1和2含有视黄酸反应元件(RARE,联合国derlined序列)。细胞用RA(24小时,1μM)处理。的βGal用作内部对照用于标准化。条代表从四个生物学重复平均值的标准值。 ±SD *** P <0.005 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.维甲酸诱导增强RNA的转录。的Hoxa1基因和尔娜水平由RT-qPCR的测量。总RNA从3小时用视黄酸(RA)或DMSO作为溶媒(辆)处理的ES细胞中分离。对有义和反义尔娜检测和PCR扩增子的正向引物被示出。从RXR结合位点的中心由尔娜RT-qPCR的检测的区域的距离表示。值归一化到平均36B4 MR的NA。数据表示平均值±SEM *** P <0.005 请点击此处查看该图的放大版本。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

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References

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