ה
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

Cite this Article

Copy Citation

Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

organoids מעיים הראשי הוא מערכת מודל ערך כי יש הפוטנציאל להשפיע על השדה משמעותי האימונולוגיה רירית. עם זאת, את המורכבות של מאפייני צמיחת organoid לשאת אזהרות משמעותיות עבור החוקר. באופן ספציפי, את דפוסי הצמיחה של כל organoid הבודד הם משתנים מאוד וליצור אוכלוסייה הטרוגנית של תאים אפיתל בתרבות. עם אזהרות כאלה, שיטות בתרבית רקמה משותפת לא יכולות להיות מיושמות פשוט למערכת organoid בשל המורכבות של המבנה התאי. ספירת ציפוי מבוסס אך ורק על מספר תא, אשר נפוץ תאים מופרדים בנפרד, כגון שורות תאים, אינה שיטה אמינה organoids אלא טכניקת נורמליזציה כמה מוחלת. נירמול לתוכן חלבון כולל עשוי מורכב בשל מטריקס חלבון התושב. מאפיינים אלה במונחים של תא מספר, צורה וסוג התא צריכים להילקח בחשבון בעת ​​הערכת con המופרשאוהלים מן המונית organoid. פרוטוקול זה נוצר להתוות תהליך פשוט לתרבות ולטפל organoids מעי דק עם פתוגנים חיידקים ודפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs). זה גם מדגיש את טכניקות הנורמליזציה כי צריך להיות מיושמות כאשר ניתוח חלבון נערך אחרי תיקול כזה.

Introduction

היכולת לקצור organoids עיקרי התרבות תואר עבור מעי דק, מעי גס, לבלב, כבד ומוח והם התקדמות מרגשת רלוונטית להבנת תופעות נציג יותר פיסיולוגי לביולוגית רקמות 1-5. השיטות הראשונות מתארות את התרבות ותחזוקה של organoids מעי הדק נמסרו על ידי סאטו et al. מחוץ למעבדה של נס Clevers 1. לפני זה שיטה, קציר והתרבות של תאים אפיתל במעי העיקרי הוכיחו להיות מוגבל ולא יעיל בשמירת צמיחת תאי אפיתל. טכניקות אלה היו דיסוציאציה של רקמות באמצעות דגירה עם אנזימים, כגון collagenase ו dispase, שיובילו בסופו של דבר אל התולדה של תאי פיברובלסטים העיקריים intermixed 6. תנאים אלו גם להיות מוגבלים בזמן בשמירה על תרבית תאי אפיתל. מינימל ללא נישת תא אפיתל יהווה כמו התאים אפיתל ייכנסו אפופטוזיס בשלחוסר גורמים או אובדן צמיחה המתאימים של שלמות מגע, כינת 7 anokis. הופעתו של מערכת התרבות 3D-organoid ספקה שיטה לתאי מעי עיקריים תרבות המכילים מגוון של סוגי תאי מעי בתרבות מתמשכת 1. יש organoids אפיתל אלו יתרונות על פני שורות תאים להיות שהם מורכבים של תאים מובחנים מספר, וטוב יותר לחקות את האיבר הם נגזרים in vivo 8. התהליך בסופו של דבר "לגדל בטן מינית בצלחת" הוכיחה להיות כלי רב ערך להערכת התגובה של אפיתל מעי תחת לגירויים שונים. חוקר את האינטראקציה של תאי מעי עיקריים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן חיידקים (PAMPs) רלוונטי בתחום האימונולוגיה דפוסים המולקולריים אלה יכולים לווסת תגובות מגוונות משני מארח חיידק 9. לא רק חוקרים יכולים כעת לחקור את יחסי הגומלין הללו עם organoids עכבר, אבל הםיכול להיות מתורבת מבני אדם, כמו גם 2. טכנולוגיה זו יש פוטנציאל לשנות באופן דרמטי רפואה אישית וזה מפתה להעלות השערות לגבי ההתקדמות כי טכניקה זו תאפשר בעתיד הקרוב.

המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק פרוטוקול לתרבות, הרחבה, וטיפול organoids מעיים עם מגוון רחב של גירויים. גירויים כאלה בסופו של דבר יכול לנוע בין חיסונים, PAMPs בקטריאלי, פתוגנים חי, העיכול (GI) ו בריפוי הסרטן. הבידוד והתרבות של organoids עכבר המעיים הותאמו מ סאטו et al. למרות שקיימות סטיות קלות המשייטת המקורית, המוצר הסופי להיות organoid התרבות עדיין מושג כאשר בעקבות פרוטוקול זה. שיטה זו מתמקדת בתיאור טכניקה נאותה לנורמליזציה ראויה כשעובד עם מבנים של תאים הלא-הומוגנית, אשר חייב להילקח בחשבון כאשר מבצעים assay מבוסס על תא nחוּם אֲדַמדַם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקר אושר ועורך תחת הנחיות IACUC וירג'יניה טק

1. הכינו R-Spondin1 אוויר מדיה מקו תא HEK293T-Rspo1

  1. דור של תאי HEK293T-Rspondin1 תואר בעבר 10. זרע HEK293T-Rspondin1 מפריש תאים ב 5-10% confluency, כ 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 תאים, בתוך בקבוק T-175 עם 40 מ"ל של מדיום הנשר שונה של 1x Dulbecco (DMEM) + 10% עוברית שור סרום ( FBS) כמו תקשורת הצמיחה, ו לדגור על 37 ° C + 5% CO 2.
    הערה: המדיה הצמיחה של תאים מפרישי HEK293T-Rspondin1 ישמש התקשורת מותנה R-spondin1. R-spondin1 ניתן לרכוש לחילופין כגורם צמיחה רקומביננטי להשתמש בריכוז סופי של 500 ng / ml.
  2. לגדל את התאים HEK293T-Rspondin1 במשך שבעה ימים או עד שמגיעים 95% confluency נקבע על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. קציר 40 מ"ל של התקשורת המותנה ולהעביר 50צינור חרוטי מ"ל. מחק את בקבוק T-175 של תאים מפרישי HEK293T-Rspondin1.
  3. צנטריפוגה הצינור המכיל תקשורת מותנית ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולת פסולת הסלולר. אסוף את supernatant, כינה R-spondin1 מותנה התקשורת, ו aliquot לתוך 15 מ"ל צינורות. aliquots חנות ב -20 ° C לטווח קצר או -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: לאחר מופשר, R-Spondin1 מותנה התקשורת ניתן לאחסן עד 1 שבוע 4 ° C..

2. הכנת Organoid צמיחת מדיה ריאגנטים עבור קציר קטן מעי מאורות  

  1. יום אחד לפני הקטיף, למקם את מטריקס חלבון קפוא על הקרח להפשיר לילה ב 4 ° C.. חיטוי מספרי לנתח, מלקחי שקופיות זכוכית אשר ישמש לקציר הקריפטה.
  2. למחרת, להתחיל בהכנות 40 מ"ל של התקשורת צמיחה organoid המכילים תוספי גורמי גדילה על ידי הוספת ריכוזים המניה ל -40 מ"ל של 1x DMEM / F-12. תוספי מדיה מכילים: 10 מ"מ 2 [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-י.ל] חומצה ethanesulfonic (HEPES) - 400 μl, תוספת גלוטמין 1x - 400 μl, 1x B27 ללא ויטמין A - 400 μl, N2 1x - N- אצטיל-ציסטאין 200 μl, 1 מ"מ - 40 μl, 100 ng / ml מ-שהגולגולת - 40 μl, 50 ng / ml מ-EGF - 4 μl ומניחים באמבט מים C 37 o עד השימוש. לחמם aliquot 15 מ"ל של R-spondin1 עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. 24 גם סטרילי חם שלוש צלחות ל -37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על ידי הצבת באינקובטור. הכן 50 מ"ל לכל עכבר 1x בופר פוספט (PBS) + 2 מ"מ Ethylenediamine חומצה tetraacetic (EDTA) ומצננים עד 4 מעלות צלזיוס. הכן 100 מ"ל לכל עכבר 1x PBS המכיל 10% FBS ו לצנן עד 4 מעלות צלזיוס.

3. מאורות המעי הדק musculus קציר Mus עבור Organoid תרבות 1

  1. להקריב גיל עכבר C57B6 / J זכר 6-12 שבועות של גיל מעלים על צ'או מכרסם סטנדרטי מים זמיניםכרצונך מודעה בהתאם להנחיות מוסדיות. להרדים באמצעות CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    ההערה: שמור פגר על קרח עד קציר רקמות ולבצע את קציר הרקמות בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי למזער את הסיכון לזיהום.
    הערה: עכבר זכר או נקבה ניתן להשתמש כדי ליצור organoids.
  2. (אופציונלי) לגלח את העכבר כדי להסיר את הפרווה לפני submersing באתנול 70%. Submerse העכבר באתנול 70% למשך 2 דקות ו להצמיד גפיים כדי הצמיד לוח עם הצד הגבי של העכבר לגעת הלוח.
  3. השתמש סטריליזציה מראש לנתח מספריים מלקחיים לעשות חתך אונליין באמצע על החלק הגחוני של העכבר. הפוך את החתך על אברי המין שימשיך גולגולתי אל בבסיס הצוואר. פתח את החתך בעור רוחבי עם פינצטה להצמיד לעור ללוח המצמיד לחשוף הצפק.
  4. ביצוע חתך אונליין באמצע הצפק של הבטן עם מספריים לנתח ומקפלים ההצפק דואר עם מלקחיים רוחביים פיני ללוח המצמיד כדי לחשוף את אברי הבטן.
    הערה: תשמרי על עצמך כדי למנוע חיתוך אברי הבטן.
  5. הסר את המעי הדק מחלל הבטן עם לנתח מלקחיים ומספריים ידי חיתוך לצומת הפרוקסימלי של המעי הדק מחובר הקיבה לצומת דיסטלי מחוברת המעי האטום. מניחים את המעי הדק בצלחת פטרי סטרילית המכילה 10 מ"ל של קר כקרח 1x PBS.
  6. שטוף את התוכן הכלול בתוך לומן של המעי הדק עם קרים כקרח 1x PBS בעזרת פיפטה 1 מ"ל. חזור על שלב זה עד הפסולת בתוך לומן של המעי הדק מוסר.
  7. חותכים את המעי הדק עם מספריים לנתח לתוך 3-4 כ רצועות שוות באורכן ולהניח את רצועות longitudinally על צלחת פטרי חדש סטרילי. עבור כל רצועה, הכנס את חוד החנית של המספריים לנתח בתוך לומן של המעי הדק כדי לבצע חתך O את אורכוf הרצועה. שימוש במלקחיים כדי רוחבי לקפל פתוח החתך כדי לחשוף את לומן של המעי הדק.
  8. השתמש שקופיות זכוכית סטרילית לגרד ממנו את villi בעדינות על פני השטח luminal של המעי הדק. חותכים את המעי הדק לרצועות אורך 1-2 ס"מ במספריים לנתח ולהעביר רצועות אלה כדי צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל קר כקרח 1x PBS.
  9. מערבב את התוכן בעדינות על ידי צינור היפוך 50 מיליליטר החרוטים ולאפשר את תוכן הרקמות להתיישב אל החלק התחתון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשאוב PBS 1x וחזור שלוש פעמים על ידי שטיפת רקמות עם 10 מ"ל של קר כקרח 1x PBS. על שטיפה של דבר לעזוב את צינור חרוטי על קרח למשך 10 דקות המכיל 10 מ"ל 1x PBS ואת קטעי רקמה המעי הדק.
  10. לשאוב PBS 1x ולהוסיף 25 מ"ל של 1x PBS + 2 mM EDTA. מניחים על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C או בתוך דלי קרח במשך 45 דקות. בעוד הרקמה דוגרת, לתייג שישה 15 מיליליטר צינורות חרוטים "שבריר # 1-6."
  11. אפשר את תוכן הרקמות להתיישב אל החלק התחתון של הצינור. הסר ולהעביר את supernatant אל חרוטי מ"ל צינור 15 שכותרתו "חלק 1". חזור על FBS 1x PBS + 10% רועד צעד (3.11) חמש פעמים ולהעביר את התוכן supernatant כדי צינור שכותרתו חלק כראוי.
  12. צנטריפוגה ב 125 XG במשך 5 דקות. לשאוב את כדורי supernatant ו resuspend ב 5 מ"ל מחומם מראש 1x DMEM / F-12, ללא גורמי גדילה הוסיף.
  13. צנטריפוגה ב 78 XG למשך 2 דקות. לשאוב 4 מ"ל של supernatant ו resuspend כל גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת הנותרים.
  14. הסר 20 מ"ל כל חלק מן ולהוסיף זכוכית שקופית. דמיינו מאורות ופסולת תחת מיקרוסקופ אור ולקבוע אילו שברים לשלב וברכה בהתאם כדי להשיג את הפרס הגדולntage של מאורות יחס פסולת.
    הערה: שברי 2-6 להניב האחוז מהאורות הגדול להיות מצופים. שברים לבריכת הם לרוב חלק 3 עם חלק 4, שברים 5 עם חלק 6.
  15. שברי צנטריפוגה להיות מצופים ב 125 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant עוזב 50-100 μl הנותרים מעל הגלולה.
  16. שמור צינורות על הקרח ולהוסיף 1 מ"ל של מטריקס חלבון שברים נקווה. Pipet מעלה ומטה לאט כדי למנוע תוספת של בועות אוויר.
  17. הסר 24 מחומם מראש צלחות גם מ -37 ° C החממה ולהוסיף 50 μl של השעיה מטריקס חלבון / קריפטה באמצע של כל טוב. מעביר את הצלחת נזרעה על 37 מעלות צלזיוס חממה במשך 10 דקות כדי לאפשר ירידת מטריקס החלבון כדי לחזק.
  18. להוסיף 450 μl של תקשורת צמיחת organoid הכין בעבר + 50 μl של spondin1 R מותנה תקשורת בכל טוב. דגירה צלחות ב 37 ° C + 5% CO 2 לילה.
  19. להוסיף 50-100 μl של Medi מותנה R-spondin1עבור כל מספר גם יומי. כל 3 ימים rd להחליף תקשורת צמיחת organoid כולו עם 450 תקשורת צמיחת organoid המוכן טרי μl / טוב כמתואר בשלב 2.2. בנוסף להוסיף 50-100 μl של התקשורת מותנה R-spondin1 לכל טוב.
    הערה: הירידה מטריקס חלבון שומרת על שלמותה במשך שבוע אחד, אבל אחרי 7 ימים להמשיך organoids passaging

4. Passaging Organoids Every Day 7 th

  1. להפשיר את מטריקס חלבון על לילה קרח ב 4 ° C יום לפני passaging. אחד 24 חמה סטרילי צלחת גם ל -37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות. כן תקשורת צמיחת organoid כמתואר בשלב 2.2 ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עד שימוש.
  2. הסר את צלחת organoid מן החממה להתחיל passaging של צלחת על הקרח. תקשורת צמיחה לשאוב עם טפטף 10 מיליליטר 3-4 בארות להתחיל.
    הערה: לשמור את אמצעי האחסון aspirated ב פיפטה 10 מ"ל, כמו זה ישמש כדי לסלק את הירידה מטריקס חלבון בשלב הבא.
  3. ב- ASפירטים-בארות, עד פיפטה ולמטה כדי לסלק את ירידת מטריקס החלבון מן הצלחת. גירוד עדין עם קצה פיפטה 10 מ"ל הוא מועיל פירוק ירידה מטריקס חלבון. מעבירים את תכולת לצינור חרוטי 15 מ"ל.
  4. דגירה צינורות חרוטי 15 מ"ל על קרח למשך 10 דקות ו צנטריפוגות ב 125 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. שים לב גלולה לבנה בחלק התחתון של צינור החרוטים. לשאוב בעדינות וזורק את רוב supernatant / מדיה צמיחת organoid הישנה מעל גלולת organoid עוזב 100-200 μl מעל הגלולה.
  5. לשבור את מאורות organoid באמצעות מחט 23 מד מצורף מזרק 1 מ"ל. לשאוב והוצא 10-15 פעמים על מנת לנתק את המאורות. מזער היווצרות בועת אוויר בשל pipetting מוגזם.
  6. Resuspend את organoids ב 500 μl של מטריקס חלבון ולהוסיף 50 μl לכל היטב צלחת מראש חימם חדש 24 גם. להוסיף 450 μl של תקשורת צמיחת organoid הכין בעבר + 50 μl של R-spondin1תקשורת בכל טוב מותנה. דגירת צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

5. ציפוי Organoids ביום 14 עבור זיהוי תבניות קולטן גירוי עם PAMPs ו חיידקי ליסטריה עבור ניתוח ביטוי גנים

  1. יומיים לפני לאתגר, פס החוצה L. חיידקים על צלחת אגר BHI.
  2. למחרת לבחור L. חיידקי המושבה ולגדול 10 מ"ל של מרק BHI ב 37 ° C רועד לילה ב 200 סל"ד.
  3. להפשיר את מטריקס חלבון על לילה קרח ב 4 ° C יום לפני אתגר organoid. אחד 24 חמה סטרילי צלחת גם ל -37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות. כן תקשורת צמיחת organoid כמתואר בשלב 2.2 ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עד שימוש.
  4. הסר תרבות organoid מן החממה להתחיל passaging של organoids.
  5. לשאוב התקשורת 3-4 בארות ולשמור התקשורת aspirated ב -10 מ"ל pipete כמו זה ישמש כדי לסלק את הירידה מטריקס חלבון. פיפטה למעלהלמטה כדי לנשל את הירידה מטריקס חלבון מן הצלחת. גירוד עדין עם קצה פיפטה 10 מ"ל הוא מועיל פירוק ירידה מטריקס חלבון. מעבירים את תכולת לצינור חרוטי 15 מ"ל.
  6. דגירה צינורות חרוטי 15 מ"ל על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 125 XG במשך 10 דקות ב 4 °. שים לב גלולה לבנה בחלק התחתון של צינור החרוטים. בעדינות לשאוב supernatant עוזב כ 100 μl של supernatant שיורית מאחור.
  7. Resuspend גלולה organoid ב 5 מ"ל של קר כקרח 1x PBS ולהסיר aliquot 10 μl לספור. מוסיפים את aliquot 10 μl לאמצע של hemocytometer בלי להחליק את מכסה זכוכית. בעדינות כיסוי coverslip הזכוכית על גבי הירידה.
    הערה: hemocytometer יסתום עם organoids אם שקופיות הזכוכית אינה מוסרת ראשונה.
  8. לספור את המספר הכולל של organoids באמצעות מיקרוסקופ אור בכל רשת / התא השלם של hemocytometer ולקבוע את ריכוז organoid: numבער organoids הכולל נספר לכל 10 μl.
  9. סור נפח מתאים מתוך 15 צינור חרוטי המ"ל שיאפשר מספרים נאותים של organoids להיות זורעים עבור assay צנטריפוגות השעיה זו ב 125 XG במשך 10 דקות.
    הערה: הטווח בין 40-100 organoids לכל גם צלחת 24 באר מספיק לניתוח RNA גודל organoid הטיפוסי יכול לנוע בין 300 מיקרומטר 1,000 מיקרומטר קוטר.
  10. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 500 מ"ל של מטריקס חלבון מבלי ליצור בועות אוויר. הוסף 50 מ"ל של השעיה מטריקס organoid / חלבון לכל היטב צלחת 24 היטב.
    הערה: כמות מטריקס חלבון המשמשת resuspend organoids ישתנה עבור מספר תנאי טיפול משכפל טכני.
  11. הוסף 500 μl של תקשורת צמיחת organoid (ללא N- אצטיל-ציסטאין) זה טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2 עבור שעה 1.
  12. כן ריכוזי 2x של PAMPs (כלומר flagellin,lipopolysaccharide) ולחיות L. חיידקים. למדוד את OD של חי ל חיידקים וסטייק על צלחת BHI לספור. פנקו organoids ב 1 x 10 6 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / מ"ל.
    הערה: OD להגדרת CFU ישתנה על ידי חיידקים להקליד יש לבחון לפני organoid גירוי. לדוגמה, OD של 0.6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml עבור L. חיידקים, אבל צריכים גם להיות מוערכים לפני עצמאי הניסוי.
  13. Streak את דילול סדרתי ממלאי לטיפול L. חיידקים כדי לקבוע מהו טיפול CFU / ml במדויק. המחברים מוצאים כי דילול 1 x 10 8 של 100 μl על צלחת אגרה BHI מספיק לספור מושבות לקבוע CFU / ml מדויק.
  14. כן פתרון נהרג חום של L. חיידקי ידי לקיחת aliquot 1 מ"ל של L. חי חיידקי פתרון צנטריפוגות ב 5000 XG במשך 10 דקות. לשאוב supernatant לשטוףגלולה חיידקי עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    1. צנטריפוגה L. חיידקי ב 5000 XG במשך 10 דקות ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS 1x. מחממים להרוג את L. חיידקים בתוך צינור פוליפרופילן 1.7 מיליליטר על ידי חימום על C 80-90 מעלות במשך שעה 1. תרבות aliquot 100 μl של החום הרג L. חיידקים על צלחת אגר BHI לאשר לא נשארים חיידקים חיים.
    2. הוסף 500 μl של PAMP 2x המתאים ו / או טיפול חיידק למדיה 500 μl תושב בבארות המיועד לשינוי על ידי המשתמש. לדגור על 37 ° C + 5% CO 2 למשך 24 שעות.
      הערה: הוספת aliquot 500 μl של טיפול 2x PAMP / חיידק 500 μl של התקשורת תושב יביא לריכוז הטיפול 1x בנפח כולל של 1 מ"ל.
  15. למחרת, באופן ידני לספור L. חיידקי מושבות עבור קביעה מדויקת של מיליליטר טיפול CFU /. תקשורת לשאוב מהצלחת של organoids מטופלים ולשטוף t בארותפעמים hree עם PBS 1x.
  16. המשך מיצוי RNA באמצעות פנול / כלורופורם 11 או ערכת חילוץ RNA על פי הוראות היצרן. הערכת ביטוי גנים באמצעות 12 qRT-PCR תקן.

6. ציפוי Organoids ביום 14 עבור PAMP ול 'חיידקי אתגר עבור ניתוח חלבון Supernatant

  1. יומיים לפני לאתגר, להתחיל תרבית תאים של תאי קאקו-2, צפיפות זריעה ≈1 x 10 6 תאים בקבוק T-75 עם 1x DMEM + 20% FBS ו דגירה התאים קאקו-2 ב 37 ° C + 5 % CO 2. בגין תרבות בקטריאלי של L. חיידקים על צלחת BHI דגירת צלחת בתוך חממת חיידקים על 37 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת לבחור L. חיידקי המושבה ולגדול 10 מ"ל של מרק BHI ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להפשיר את מטריקס חלבון על לילה קרח ב 4 ° C יום לפני אתגר organoid.
  3. להלן יום חם אחד 96 סטרילית היטב, שחור קירותצלחת ל -37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות. כן תקשורת צמיחת organoid ללא N- אצטיל-ציסטאין כמתואר בשלב 2.2 ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עד שימוש. הסר תרבות organoid מן החממה להתחיל passaging של organoids.
    הערה: גודל organoid הטיפוסי יכול לנוע בין 300 מיקרומטר 1,000 מיקרומטר קוטר.
  4. לשאוב התקשורת 3-4 בארות ולשמור התקשורת aspirated ב -10 מ"ל pipete כמו זה ישמש כדי לסלק את הירידה מטריקס חלבון. Resuspend עם טפטפת כדי לנשל את הירידה מטריקס חלבון מהצלחת. גירוד עדין עם טפטף 10 מיליליטר הוא מועיל פירוק ירידת מטריקס החלבון. מעבירים את תכולת לצינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. דגירה צינורות חרוטי 15 מ"ל על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 125 XG במשך 10 דקות ב 4 °. שים לב גלולה לבנה בחלק התחתון של צינור החרוטים. בעדינות לשאוב supernatant עוזב 100 μl של supernatant שיורית מאחור.
  6. Resuspend גלולה organoid ב 5 מ"ל של קרים כקרח1x PBS ולהסיר aliquot 10 μl לספור. מוסיפים את aliquot 10 μl לאמצע של hemocytometer בעדינות כיסוי coverslip הזכוכית.
    הערה: hemocytometer יסתום עם organoids אם שקופיות הזכוכית אינה מוסרת ראשונה.
  7. לספור את המספר הכולל של organoids באמצעות מיקרוסקופ אור בכל הרשת של hemocytometer / תא כולו ולקבוע את ריכוז organoid: מספר organoids הכולל נספר לכל 10 מ"ל.
  8. סור נפח מתאים מתוך 15 צינור חרוטי המ"ל שיאפשר מספרים נאותים של organoids להיות זורעים עבור assay צנטריפוגות השעיה זו ב 125 XG במשך 10 דקות.
    הערה: כמות מטריקס חלבון המשמשת resuspend organoids ישתנה עבור הסכום של תנאי טיפול משכפלים טכני. המחברים מוצאים כי 40-100 organoids מספיקה לניתוח חלבונים המופרשים.
  9. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של מטריקס חלבון / טוב מבלי ליצורבועות אוויר.
    הערה: כמות מטריקס חלבון המשמשת resuspend organoids ישתנה עבור הסכום של תנאי טיפול משכפלים טכני.
  10. השאר לפחות שתי עמודות ריקות על 96 הצלחת בתרבית רקמה השחורה קירות גם אלה ישמשו בארות זרע עם תאי קאקו-2 עבור הדור של עקומת סטנדרט. הוסף 50 μl של חלבון מטריקס + ההשעיה organoid לכל טוב לצלחת בתרבית רקמה טרום חימם 96 גם שחור קירות. אחסן את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי לאפשר מטריקס חלבון כדי לחזק.
  11. הוספת 100 μl של תקשורת צמיחת organoid (ללא N- אצטיל-ציסטאין) זה טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2 עבור שעה 1.
  12. כן הריכוזי 2x של PAMPs ולחיות L. חיידקים. הוספת 100 מיליליטר של כל תנאי טיפול שניתן לכל היטב דגירה במשך 24 שעות.
  13. הצלחת למחרת קאקו-2 תאים בבארות העקומות הסטנדרט. בגין על ידי ההתחממות PBS 1x סטרילי, 0.25% טריפסין t FBS 1x DMEM + 20%o 37 ° C.
  14. הסר את בקבוק T-75 המכיל תאי קאקו-2 ו לשאוב תקשורת תרבית תאים. שוטפים את התאים עם 10 מ"ל 1x PBS. לשאוב את PBS 1x, להוסיף 2 מ"ל 0.25% טריפסין ו הבקבוק במקום T-75 ב -37 ° C חממה עבור 15 דקות.
  15. דמיינו את הבקבוק תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח את תאים יש מנותקת מכן להוסיף 8 מ"ל של FBS 1x DMEM + 20% על התאים קאקו-2 מנותק ולהעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הסרת aliquot 10 μl ולספור את התאים על ידי מיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.
    הערה: מספר התא העליון של 60,000 תאים / גם עובד היטב דילולים יכול להתנהל עבור הדור של עקומת סטנדרט עד 2,500 תאים / היטב.
  16. Resuspend תאי קאקו-2 במטריצת חלבון ולהוסיף 50 μl לכל היטב בארות מתאימות. אפשר מטריקס החלבון כדי לחזק ב 37 מעלות צלזיוס במשך תאי קאקו-2.
    הערה: תקשורת צמיחה עבור תאי קאקו-2 אינה צורך להוסיף באים מיצוקים של מטריקס החלבון.
  17. הבאזמן הטיפול 24 שעות עבור assay organoid, לשאוב ולשמור התקשורת supernatant הסלולר organoid ולשמור על הקרח. לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 1X PBS. הוספת 100 μl של מתנול 100% זה טוב כולל הבארות עקומות סטנדרט קאקו-2 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס או על קרח למשך 20-30 דקות כדי לתקן את organoids.
    הערה: לא נדרש כי הבארות עקומות סטנדרט קאקו-2 להישטף עם 1x PBS, כפי שהם יכולים להוסיף מתנול ישירות.
  18. לאחר דגירת מתנול, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם קרח קר 1x PBS. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 1-2 שבועות.
  19. להוסיף צבע מכתים גרעיני בריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​לכל טוב, מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  20. השתמש 96 קורא צלחת גם למדוד עירור לצבוע מכתים גרעיני / פליטה (350nm / 461nm בהתאמה) לנרמל כל organoid היטב עקום התקן של תאי קאקו-2.
  21. המשך מבחני במורד הזרם, כגון ELISA

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר בעקבות פרוטוקול זה לטפח organoids מעיים, organoids כדור בצורת המאפיין יהיה נוכח לאחר קטיף. תוספת של התקשורת מותנה R-spondin1 יומי תיזום צמיחה נביטה של ​​organoids. הצמיחה של organoids מוצג באיור 1 א - F, והוא נציג של organoids מעיים בימים 1, 2, 4, 5, 6 ו יום 14. איור 1F מייצג את מאפייני הצמיחה הלא הומוגנית של organoids ביום 14.

לאחר organoids גדל כדי מספר מספיק, הם יכולים להיות replated וקראו תיגר עם PAMPs השונה ו / או חיידקים. ניתוח ביטוי יכול להתבצע באמצעות טכניקות סטנדרטיות. זו מיוצגת באיור 2A-C אשר מראה את הביטוי mRNA של ציטוקינים דלקתיים IL-18, IL-6, ו TNFα אשר נותחו בעקבות24 שעות אתגר של organoids עם חום הרג L. חיידקים ואת flagellin PAMP. הרציונל להערכת ביטוי mRNA ציטוקינים IL-18, IL-6, ו TNFα היה כי אלה היו מועמדים טובים להיות מווסתת על ידי תאי אפיתל בתגובה אתגר פתוגניים, אפנון של ציטוקינים דלקתיים אלה היה להדגים את האפקטיביות של טכניקה.

איור 3 א - C מדגים את המכתים הגרעיני היחסי של organoids מעיים עם צבע מכתים גרעין בסיום קיבעון עם מכתים רקע מינימאלי של פסולת במטריצת חלבון התושב. שיטה זו של קיבעון והכתים ניתן ליישם לנרמל מבחנים, אשר יביא בחשבון שונה מספרים סלולריים בכל טוב. זו באה לידי ביטוי באיור 4 בעת יצירת עקומת סטנדרט של דילולים סדרתי של קאקו-2 תאים מצופה מטריקס חלבון, ואז קבוע מוכתם גרעינילצבוע מכתים. ערך R 2 של 0.89 מצביע על קשר ליניארי בין מספר הסלולרי ולהתכוון עוצמת פלורסנט, ואת משוואה ליניארית יכול לשמש כדי לנרמל organoids למספר התא. עקומת התקן המתוארת באיור 4 מתחילה להגיע למגבלת הרוויה מעבר ל -30,000 תאים לכל טוב. טיטרציה של תאים מעל 30,000 תאים לכל היטב הוכח באיור 4 לכלול את מגוון הרוויה של הצבע מכתים גרעיני. דיוק של נורמליזציה מוגברת יושג עם מספר תאים המשקף את המגוון ליניארי של צבע המכתים הגרעיני לפני הוא הגיע לגבול הרוויה.

איור 1
איור 1:. קטן מעי Organoid צמיחת הזמן כמובן של צמיחה עבור organoids נגזר מעי דק murine הבא בבידוד. (א) יום 1. (ב) יום 2. (Cיום) 4. (ד) יום 5. (E) יום 6. (F) יום 14. תמונות המייצגות צמיחה organoid לכל יום נתון. ברי סולם שווים 200 מיקרומטר בתמונה השמאלית עבור A, B, C, D ו- E. ברי סולם שווים 100 מיקרומטר התמונה הנכונה עבור A, B, C, D, E. וברי סולם שווים 1,000 מיקרומטר ו -200 מיקרומטר תמונות על ימין ועל שמאל עבור F, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ביטוי mRNA של ציטוקינים דלקתיים בעקבות אתגר 24 שעות PAMP ביטוי mRNA יחסית של organoids wild-type מעיים תיגר למשך 24 שעות עם PAMPs ו חיידקי ליסטריה נהרג חום (A - C) מייצגים שינוי הקיפול של i.. ציטוקינים nflammatory IL-18, IL-6 ו- TNFα בהתאמה. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מכתים פלורסנט יחסית של Organoids לנורמליזציה מכתים גרעיני של organoids עם באי קיבעון.. (א) שדה מואר של organoids. (ב) מכתים פלורסנט של organoids עם צבע מכתים גרעיני. (C) תמונה ממוזגת של שדה בהיר מכתימה ניאון. ברי סולם שווים 400 מיקרומטר כל התמונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"> איור 4
איור 4: עקומת סטנדרט שנוצר מתאי קאקו-2 עקומת סטנדרט שנוצר מבארות בשלושה עותקים.. היה תא זריעת מגוון החל מ 60,000 תאים לכל היטב עם דילולים עד 2,500 תאים לכל טוב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. סקירה של תרשים פרוטוקול 1-Top לוח של איור ממחיש קצירת התקשורת מותנה R-spondin1. לוח 2-התיכון של איור ממחיש היבטים של פרוטוקול למסוק ועכבר תרבות organoids המעי הדק. לוח 3-תחתון של איור ממחיש: (א) הציפוי של organoids בתרבית 14 יום. (ב) אתגר עם PAMPs / ל 'חיידקים, ובארות פנויות עוזבות כדי ליצור עקומה סטנדרטית. (C) בעקבות אתגר PAMP, הציפוי של קאקו-2 תאים בבארות הפנויות בעבר כדי ליצור עקומה סטנדרטית. (ד) בעקבות קיבעון תוספת של צבע מכתים גרעיני, מדידת עירור / פליטה של בארות נרמול נגד עקומת סטנדרט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התרבות והתחזוקה של organoids מעיים היא הליך זה ניתן לשלוט על ידי כל אדם עם טכניקה בתרבית רקמה נאותה. יש דקויות ב passaging בהשוואה לגידול תאים בשכבה קונבנציונלית יותר, אבל הדקויות הללו אינן שקשה להתגבר עליו. השלבים הקריטיים של שיטה זו כרוך יכולת לגדל את organoids צפיפות גבוהה מספיק עבור זריעה אופטימלית. ניסויים חייב להיות scaled למטה עם organoids כמו צפיפות זריעה גדולה שיכולה להיות מושגת בדרך כלל עם שורות תאים אינן מעשיות. זה הופך בולט במיוחד כאשר יש קבוצות טיפול מרובות.

פרוטוקול זה מיועד לספק צעד אחר צעד בשיטה כדי לחקור אינטראקציות הפתוגן שורה של האפיתל במעי עם מגוון רחב של חיידקים שונים, פתוגנים ויראליים, פטרייתיים, כמו גם קשיים כתובת באמצעות מערכת זו ביחס לנורמליזציה. דוחות זמינים כי describדואר האינטראקציות של organoids מעיים עם סלמונלה פתוגן החיידקים, אך אינו מתייחס שיטות נורמליזציה כאשר מודדים ציטוקינים מופרשים 13.

ישנם מספר קשיים כי הם נתקלו בעת נרמול תרבויות organoid על ידי שיטות שונות. נרמול חלבון המופרש באמצעות assay חומצה bicinchoninic (BCA) הוא אופציה; עם זאת, מרכיבי הגידול נדרשים תרבות organoid (N2 ו / או B27 ויטמין) להפריע assay BCA (מידע לא מוצג) נורמליזציה באמצעות כדאיות הסלולר, כגון assay MTT שונה תואר 14.; עם זאת, טיפול שישנה את פעילות המטבולית המיטוכונדריה של organoids יכיר שיטה מדויקת לנורמליזציה באמצעות טכניקה זו כפי MTT מבוסס על הפחתה ידי הפעולה של דהידרוגנאז המיטוכונדריה 15. כמו כן יש להסיר-ציסטאין N-Acetyl (NAC) מהתקשורת, לא על ly אם נורמליזציה באמצעות טכניקת MTT היא רצויה, אבל אם בטיפול עם פתוגן חיידקים כמו NAC יכול לעכב התפתחות חיידקי 16.

יתרונות של טכניקה זו הם כי ציטוקינים מופרשים ומוצרי חלבון מן organoids יכולים להיות מנורמלים כעת נגד עקומת סטנדרט של תאי קאקו-2. מגבלות של טכניקה זו הן כי הנורמליזציה היא גומלת כי מכתים גרעין של organoids אפיתל העיקרי הלא טרנספורמציה מנורמל נגד מכתים הגרעין של שורת תאי סרטן מעי גס. המחברים מוצאים כי תיקון עם גרעיני מתנול מכתים עם גרעיני מכתים צבע הוא טכניקת נורמליזציה יעילה נגד עקומת סטנדרט של תאי קאקו-2. אם כי מאפייני הצמיחה של קו מעי גס סרטן תאים זה לא בדיוק לחקות את מאפייני הצמיחה של organoids מעיים, באמצעות גרעיני כתם ומדידת עוצמת קרינה ממוצעת היא אסטרטגיה טובה כדי לנרמל נגד מספר תא הכולל.

ילדה = "jove_content"> יחדיו, הטכניקה המתוארת כאן מספקת נקודת התחלה טובה לחקות אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן עם נורמליזציה נאותה כי הוא חיוני לביצוע פרשנויות מדויקות באמצעות מערכת מודל זה. המשמעות של טכניקה זו ביחס לשיטות חלופיות היא נורמליזציה ראויה חייבת להתבצע בעת ביצוע הערכה כלשהי של חלבון מופרש, כגון מבחנים מבוססים ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  3. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  4. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160, (1-2), 299-312 (2015).
  5. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, (7467), 373-379 (2013).
  6. Freshney, R. I., Freshney, M. G. Culture of epithelial cells. 2nd edn. Wiley-Liss. (2002).
  7. Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123, (6), 1980-1991 (2002).
  8. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31, (3), 417-422 (2013).
  9. Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35, (11), 538-548 (2014).
  10. Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309, (5738), 1256-1259 (2005).
  11. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1, (2), 581-585 (2006).
  12. Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34, (6), 854-865 (2011).
  13. Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2, (9), (2014).
  14. Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
  15. Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
  16. Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5, (1), 58-61 (1977).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats