Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

הפרוטוקול המודגם בסרטון זה מאפשר לנו להבין את התפקיד של מטבוליטים במעיים על מורפוגנזה מקף פטרייתי. טכניקת אקס ויוו זו פחות או יותר את הקירוב הקרוב ביותר של המעיים לחקר מורפוגנזה מקף פטרייתי באופן שאף מחקר במבחנה לא יכול לשכפל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את התפקיד של מטבוליטים במעיים על פתוגנים א המעית אחרים.

לנתח עכברים באמצעות מספריים חדים מעוקלים אוטומטית ומלקחיים. לאחר המתת חסד, לאבטח את החיה למשטח ניתוח על ידי הצמדת כל הגפיים כדי לחשוף את הבטן. יש לרסס את אזור הבטן ב-70% אתנול כדי למנוע מפרווה להידבק למדפים, מספריים או חלקי מעיים.

השתמש מדפים כדי לצבוט ולהרים קטע של העור בבסיס הבטן וליצור חתך קטן דרך העור ואת fascia הבסיסית דואגת כדי למנוע ניקור cecum או דופן המעי. מרחיבים את החתך הזה לבית החזה וחושפים חלקית את חלל הצלף, ואז עושים חתך שמתחיל בנקודת החתך הראשוני משני הצדדים ונמשך כלפי מעלה וצד. משוך מדפים אלה באופן כללי ולהצמיד אותם למשטח ניתוח כדי לחשוף באופן מלא את חלל צפירה.

לחלץ את מערכת העיכול עם מטליות תוך שימוש במספריים כדי להפוך חתכים מעולה על הבטן באזור דיסטלי של המעי הגס כדי להבטיח איסוף של הכמות הגדולה ביותר של תוכן המעיים. בעת הסרת מערכת העיכול, יש לדאוג להימנע מפגיעה ברכיבים הבודדים. להפריד את הקיבה, המעי הדק, cecum, ואת המעי הגס בקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים שלהם.

לאיסוף תכולת המעיים מכל מקטע, בצע חתך יחיד בקצה הדיסטלי, ולאחר מכן הוצא ידנית את תכולת המעיים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עם מטליות. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס לשעבר vivo assays. פסים תרבות טרייה של C.albicans SC5314 על צלחת אגר YPD ודגירה אותו לילה ב 30 מעלות צלזיוס.

ביום שלמחר, בחר שתיים או שלוש מושבות בודדות בגודל בינוני ותייסוף שוב במיליליטר אחד של PBS. יש לאחזר תכולת מעיים קפואה מהמקפיא ולהפשיר אותם ב-25 מעלות צלזיוס. מעבירים כ-150 מיליגרם של תכולת המעיים לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומעבירים אותם מחדש עם 150 מיקרוליטר של PBS.

Vortex המדגם במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי homogenize את תכולת המעיים ולאפשר לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך כדקה. צנטריפוגה homogenates ב 1, 000 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר דואג לא להעביר שום פסולת. לאחר חזרה על הצנטריפוגה, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אינקולום C.albicans לעל-טבעי, מערבבים היטב, ודוגרים את המדגם ב-37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות.

כדי לבדוק את ההשפעה של מטבוליטים אקסוגניים על C.albicans, להוסיף את הריכוז הרצוי של מטבוליטים לתכלית המעיים ותערובת PBS, ואז מערבולת המדגם במהירות גבוהה במשך 30 שניות, לתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולבצע צנטריפוגה וחיסון כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה תרבות התא הפטרייתי ב 1, 000 פעמים G במשך שתי דקות ולהשליך את העל טבעי. תקן את הדגימות ב 100 microliters של 2%PFA במשך 15 דקות, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה ולהשליך את supernatant.

לשטוף את הדגימות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS על פי הוראות כתב היד, ולאחר מכן להדגיר את הדגימות בטמפרטורת החדר ב 100 microliters של PBS עם נוגדן C.albicans polyclonal במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את המדגם שלוש פעמים נוספות עם PBS, עובד באור עמום כדי למנוע photobleaching. בחדר חשוך, הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ב 100 microliters של PBS המכיל נוגדן אנטי ארנב IgG Alexa Fluor 488 בדילול אחד עד 500.

לאחר שטיפת הדגימה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS, להשתמש בו מחדש ב 100 microliters של PBS ולהעביר אותו צלחת 96 באר להדמיה. תדמיין את התאים הפטרייתיים עם מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי באמצעות עדשות אובייקטיביות 20X ו- 40X ומסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק. כאשר C.albicans גדל ex vivo בתמציות הומוגנטיות במעיים שנלקחו מהבטן, המעי הדק והמעי הגס של שליטה לא מטופלת ועכברים שטופלו באנטיביוטיקה, זה בדרך כלל מתפתח עם מורפולוגיה שמרים.

עם זאת, כאשר גדל תמצית cecal מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה, C.albicans בקלות עובר מורפוגנזה וכתוצאה מכך שמרים וצורות hyphae. זה מצביע על כך טיפול אנטיביוטי גורם לשינויים בסביבת cecal, אשר לגרום מורפוגנזה מקף של C.Albicans. תוספת אקסוגנית של גלוקוז ל-cecal homogenate של עכברים שטופלו באנטיביוטיקה הראתה התפתחות מקף מסיבית אקס ויוו.

תוצאות אלה מראות כי תוספת של מטבוליטים במעיים בחזרה הומוגנאט cecal של עכברים שטופלו באנטיביוטיקה דיפרנציאלי מווסת את המורפוגנזה של C.albicans. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי אופטימיזציה של דילול של תוכן המעיים מבטיח אוסף מספיק של מטבוליטים במעיים ללא אוסף של פסולת. אין לחרוג מדילול תוכן מדיה-בטן של שניים לאחד ולכוון לדילול נמוך יותר במידת האפשר.

טכניקה זו נמצאת בשימוש כעת כדי לחקור כיצד מטבוליטים ספציפיים בהתפתחות המקף השפעת המעיים, המאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את התפקיד של מטבוליטים במעיים על פתוגנזה פטרייתית.