מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה של העופות, כגון כיצד וירוסים מדכאי חיסון מקיימים אינטראקציה עם תאי B. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאים רלוונטיים יותר מאשר קווי תאים מונצחים המשמשים כיום במעבדה. למרות שיטה זו מספקת תובנה כיצד תאי עוף להגיב IBDV, זה יכול להיות מיושם גם על ALV ו REV.

שיטה זו מפחיתה את מספר הציפורים במחקר שלנו, והיא מועילה לשלושת ה-Rs, אשר מייצגים החלפה, הפחתה ועידון של השימוש בבעלי חיים במחקר. בארון בטיחות מיקרוביולוגי, לשטוף את BF ב 30 מיליליטר של PBS קר לפחות שלוש פעמים. מעבירים את הרקמה השטופה לצלחת פטרי, ומוסיפים חמישה מיליליטר של תוסף קולגנס D פי 1.

השתמש מספריים סטריליים או להב אזמל לחתוך את BF לחתיכות כי הם פחות מחמישה מילימטרים קוטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה תקופתית במשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר סטרילי כדי לשואפים שוב ושוב את התערובת כדי לעודד התפוררות של הרקמה.

מוסיפים עוד חמישה מיליליטר של פתרון קולגנס D 1X לרקמה, ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה תקופתית במשך 30 דקות נוספות. חזור על תהליך זה, שאפת התערובת, הוספת פתרון קולגנס D טרי, ודגירה עד הרקמה מתעכלת לחלוטין. שימו לב שיהיו גרגיריים קטנים שלא יתמוססו עוד יותר.

מעבירים את מתלי התא המתעכלים דרך מסננת תאים של 100 מיקרון ל-20 מיליליטר של 1X HBBS ללא סידן. צנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי, תן שימוש חוזר לכדור ב-10 מיליליטר של RPMI 1X עם 5%FBS.

לאחר מכן, כיסוי 10 מיליליטר של ההשעיה התא על גבי חמישה מיליליטר של מדיה הדרגתית צפיפות המכילה פוליסוכרוז ונתרן diatrizoate. ודאו שיש ממשק ברור בין שתי השכבות. צנטריפוגה ב 900 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

על התאים ליצור רצועה בממשק שבין מדיית התא למדיית מעבר הצבע של הצפיפות. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר סטרילי כדי להסיר את התאים ולהעביר אותם לצינור המכיל PBS קר. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 400 פעמים g במשך חמש דקות ולאחר מכן resuspending אותם PBS קר.

חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. ראשית, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. תן שימוש חוזר בתאים ב- 30 מיליליטר של IMDM מלא פי 1.

קח aliquot של ההשעיה התא, ולהוסיף אותו לפתרון כחול טריפאן. ספור את מספר התאים הקיימים שאינם כוללים את הכחול של Trypan וקבע את מספר התאים ואת יכולת הקיום באחוזים. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 פעמים g במשך חמש דקות.

תן שימוש חוזר בתאים ב- IMDM מלא בתוספת דילול של 1 עד 20 של ליגנד CD40 עוף בצפיפות של 10 מיליון תאים למיליליטר. תרבו את התאים בצלחות של 96 או 24 בארות במשך 48 עד 72 שעות. 48 עד 72 שעות לאחר הבידוד, להפשיר aliquot של הנגיף.

מערבולת הדגימה, ולאחסן אותו על קרח. התן מחדש את תאי bursal הראשיים במדיום IMDM. קח aliquot 10 מיקרוליטר של ההשעיה התא, ולהוסיף אותו 10 microliters של פתרון כחול טריפאן.

לאחר מכן, קבע את מספר התאים ואת יכולת הקיום באחוזים. לדלל את הנגיף ב IMDM מלא 1X לריבוי המתאים של זיהום כדי להפוך את הווירוס inoculum. מערבבים דילול זה על ידי מערבולת.

צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים בחיסון הנגיף. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם תסיסה תקופתית.

לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את אינוקולום הווירוס, ולשטוף את התאים במדיה IMDM מלאה 1X. תרבו את התאים בצלחות של 96 או 24 בארות.

במחקר זה, תאים בורסאליים ראשוניים עוף הם לתרבת ברציפות ex vivo בנוכחות עוף מסיס CD40 ligand. תאים מתורבתים בנוכחות לינד CD40 עוף מסיס נראים להגדיל פי ארבעה מ 902, 000 ל 3.63 מיליון למיליליטר על פני תקופה של שישה ימים. הכדאיות התא הוא גם השתפר באופן משמעותי בנוכחות עוף CD40 ligand.

בתמונות מיקרוסקופיות קונפוקל מייצגות, תאים נגועים נראים בעלי פלואורסצנטיות ירוקה סביב הגרעין, אשר עולה בקנה אחד עם נוכחות של IBDV בציטופלסמה. זה ניכר עבור שני זנים של IBDV, זן מותאם לתרבות התאים, D78, ומתח ארסי מאוד, UK661. לאחר מכן, RNA מופק בגיל חמש, 18, 24 ו-48 שעות לאחר ההדבקה וחשוף ל-RT-qPCR עם פריימרים ספציפיים לאזור שמור בגן IBDV VP4.

ביטוי IBDV VP4 נראה להגדיל ל 16, 603 עותקים ב 48 שעות לאחר ההדבקה עם D78 ו 38, 632 עותקים ב 48 שעות לאחר ההדבקה עם UK661. נתונים אלה מראים כי תאים בורסאליים ראשוניים של עוף יכולים לתמוך בשכפול של זני IBDV מותאמים לתרבות התאים וארסיים מאוד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו RT-qPCR, microarray או RNA-Seq כדי לענות על שאלות נוספות, כמו כיצד התאים מגיבים לזיהום.

השווינו את האופן שבו התאים מגיבים לזיהום עם זן יומת וזן ארסי מאוד של IBDV וכעת אנו חוקרים כיצד הם מגיבים לזיהומים ויראליים אחרים. היכולת לתרבת תאים אלה מאפשרת לנו לחקור היבטים של פתוגנזה וירוס ודיכוי חיסוני ללא צורך להדביק ציפורים. תהיה לכך השפעה מהותית על שלושת ה-Rs, ההחלפה, הזיקוק והצמצום של השימוש בבעלי חיים במחקר.