Il
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

organoidi intestinali primarie sono un modello di sistema di valore che ha il potenziale per avere un impatto significativo nel campo delle mucose immunologia. Tuttavia, la complessità delle caratteristiche di crescita organoide portano avvertimenti significativi per l'investigatore. In particolare, i modelli di crescita di ogni singolo organoide sono molto variabili e creano una popolazione eterogenea di cellule epiteliali in coltura. Con tali limitazioni pratiche coltura tissutale comune non possono essere semplicemente applicate al sistema organoide a causa della complessità della struttura cellulare. Conteggio e placcatura basato esclusivamente sul numero di cellule, che è comune a cellule separate individualmente, quali le linee cellulari, non è un metodo affidabile per organoidi se viene applicata una tecnica di normalizzazione. Normalizzazione al contenuto totale di proteine ​​è fatta complessa a causa della matrice proteica residente. Queste caratteristiche in termini di numero di cellule, forma e tipo di cellula dovrebbero essere presi in considerazione quando si valuta con secretotende dalla massa organoide. Questo protocollo è stato generato per delineare una procedura semplice per la cultura e il trattamento di piccoli organoidi intestinale con agenti patogeni microbici e pamp (PAMPs). Si sottolinea, inoltre, le tecniche di normalizzazione che dovrebbero essere applicate quando l'analisi delle proteine ​​sono condotte dopo una tale sfida.

Introduction

La capacità di raccogliere e organoidi coltura primaria sono stati descritti per intestino tenue, colon, pancreas, fegato e cervello e sono progressi entusiasmanti germano per comprendere un fenomeno fisiologicamente più rappresentativo per la biologia dei tessuti 1-5. I primi metodi che descrivono la cultura e la manutenzione di piccoli organoidi intestinale è stata riportata da Sato et al. Fuori dal laboratorio di Hans Clevers 1. Prima di questo metodo, la raccolta e la coltura di cellule epiteliali intestinali primarie ha dimostrato di essere limitato e inefficace nel sostenere la crescita delle cellule epiteliali. Metodi incluse dissociazione del tessuto tramite incubazione con enzimi, come collagenasi e dispasi, che finirebbe per portare alla conseguenza di fibroblasti primari mescolati 6. Queste condizioni potrebbero anche essere il momento limitati a sostenere la coltura delle cellule epiteliali. Minimo a nessun nicchia delle cellule epiteliali possano costituire, come le cellule epiteliali sarebbero entrati a causa di apoptosila mancanza di fattori di crescita appropriati o perdita di integrità contatto, definito anokis 7. L'avvento del sistema di coltura 3D-organoide ha fornito un metodo per cellule intestinali primarie coltura contenenti una gamma di tipi di cellule intestinali in coltura sostenuta 1. Questi organoidi epiteliali presentano vantaggi rispetto alle linee cellulari è che essi sono composti da diverse cellule differenziate, e meglio imitano l'organo che sono derivati ​​da 8 in vivo. Il processo di definitiva "crescere un mini budello in un piatto" ha dimostrato di essere un valido strumento per valutare la risposta di epitelio intestinale sotto diversi stimoli. Indagare l'interazione delle cellule intestinali primarie con modelli patogeni microbici associati molecolari (PAMPs) è rilevante per il campo dell'immunologia come questi modelli molecolari in grado di regolare diverse risposte sia da host e microbo 9. Non solo è possibile investigatori ora esplorare queste interazioni con organoidi del mouse, ma hannopuò essere colta da esseri umani come ben 2. Questa tecnologia ha il potenziale per alterare radicalmente la medicina personalizzata e si è tentati di speculare sui progressi che questa tecnica renderà possibile in un prossimo futuro.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo per la coltura, l'espansione e il trattamento di organoidi intestinali con una varietà di stimoli. Tali stimoli possono infine variare da vaccini, PAMPs batteriche, agenti patogeni dal vivo, gastrointestinale (GI) e cancro terapeutica. L'isolamento e la coltura di topo organoidi intestinali è stato adattato da Sato et al. Anche se ci sono lievi deviazioni dal metodo originale, il prodotto finale è organoide cultura è ancora raggiunto quando si segue questo protocollo. Questo metodo è focalizzato sulla descrizione una tecnica adeguata per una corretta normalizzazione quando si lavora con strutture cellulari non omogenei, che devono essere presi in considerazione quando condurre un saggio basato su cellule nterra d'ombra.

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Protocol

Tutte le ricerche è stato approvato e condotto secondo le linee guida Virginia Tech IACUC

1. Preparare R-Spondin1 condizionata media Da HEK293T-Rspo1 Cell Line

  1. Generazione di cellule HEK293T-Rspondin1 è stata precedentemente descritta 10. Seme HEK293T-Rspondin1 cellule secernenti al 5-10% di confluenza, circa 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 cellule, in un pallone T-175 con 40 ml di 1x Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% siero fetale bovino ( FBS) come mezzi di crescita e incubare a 37 ° C + 5% CO 2.
    NOTA: I media di crescita per le cellule che secernono HEK293T-Rspondin1 servirà come R-spondin1 condizionata media. R-spondin1 può essere alternativamente acquistato come fattore di crescita ricombinante impiegato ad una concentrazione finale di 500 ng / ml.
  2. Crescere le cellule HEK293T-Rspondin1 per sette giorni o fino a raggiungere il 95% di confluenza determinato tramite microscopia in campo chiaro. Raccogliere i 40 ml di mezzi di comunicazione e trasferimento condizionati ad un 50tubo conico ml. Eliminare il pallone T-175 di cellule secernenti HEK293T-Rspondin1.
  3. Centrifugare la provetta contenente mezzi condizionati a 300 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare detriti cellulari. Raccogliere il surnatante, denominato R-spondin1 mezzi condizionati, e aliquota in provette da 15 ml. aliquote conservare a -20 ° C per breve termine o di -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
    NOTA: i media Una volta scongelato, il R-Spondin1 condizionata possono essere memorizzati fino a 1 settimana a 4 ° C.

2. Preparazione di organoide Crescita media e di reagenti per la raccolta Piccolo intestinale cripte  

  1. Un giorno prima della raccolta, posizionare la matrice proteica congelato su ghiaccio e scongelare una notte a 4 ° C. Autoclave forbici, pinze e vetrini che verranno utilizzati per la raccolta cripta dissezione.
  2. Il giorno seguente, inizia preparando 40 ml di terreni di crescita organoide contenenti integratori e fattori di crescita con l'aggiunta di concentrazioni azionari a 40 ml di 1x DMEM / F-12. Integratori media contengono: 10 mm 2- [4- (2-idrossietil) piperazin-1-yl] etansolfonico acido (HEPES) - 400 ml, 1x glutamina supplemento - 400 ml, 1x B27 senza vitamina A - 400 ml, 1x N2 - 200 pl, 1 mM N-acetil-cisteina - 40 microlitri, 100 ng / ml m-Noggin - 40 microlitri, 50 ng / ml m-EGF - 4 microlitri e posto in un bagno d'acqua C 37 o fino utilizzo. Riscaldare un'aliquota 15 ml di R-spondin1 a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  3. Warm tre sterili piastre 24 e 37 ° C per almeno 30 min mettendo in un'incubatrice. Preparare 50 ml per il mouse 1x tampone fosfato (PBS) + 2 mM Ethylenediamine tetraacetico (EDTA) e raffreddare a 4 ° C. Preparare 100 ml per il mouse 1x PBS contenente il 10% FBS e raffreddare a 4 ° C.

3. La raccolta Mus musculus Piccolo intestinale cripte per organoide Cultura 1

  1. Sacrifica una età del mouse C57B6 / J maschio 6-12 settimane di età allevati in Chow roditori standard ed acqua disponibilead libitum secondo le linee guida istituzionali. Euthanize via CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale.
    NOTA: Mantenere carcassa in ghiaccio fino alla raccolta dei tessuti e eseguire la raccolta dei tessuti in un armadio di sicurezza biologica per minimizzare il rischio di contaminazione.
    Nota: Un mouse maschio o femmina può essere utilizzato per generare organoidi.
  2. (Opzionale) Shave il mouse per rimuovere il pelo prima submersing nel 70% di etanolo. Immergere il mouse in etanolo al 70% per 2 min e il pin arti per appuntare bordo con la parte dorsale del mouse si tocca la scheda.
  3. Utilizzare pre-sterilizzati dissezione forbici e pinze per fare una incisione linea mediana sulla parte ventrale del mouse. Effettuare l'incisione alla genitali procedendo cranica alla base del collo. Aprire l'incisione cutanea lateralmente con una pinzetta e il pin la pelle alla scheda pinning per esporre il peritoneo.
  4. Effettuare una incisione linea mediana nel peritoneo del ventre con dissezione forbici e piega °e peritoneo con una pinza lateralmente e perno alla scheda di pinning, al fine di esporre gli organi addominali.
    NOTA: Fare attenzione per evitare di tagliare organi addominali.
  5. Rimuovere il piccolo intestino dalla cavità addominale con dissezione pinze e forbici tagliando giunzione prossimale del piccolo intestino collegata allo stomaco e la giunzione distale collegata al cieco. Mettere l'intestino tenue in una capsula di Petri sterile contenente 10 ml di ghiaccio freddo 1x PBS.
  6. Lavare il contenuto contenute nel lume dell'intestino tenue con ghiaccio freddo 1x PBS utilizzando una pipetta 1 ml. Ripetere questa operazione fino a quando i detriti all'interno del lume del piccolo intestino viene rimosso.
  7. Tagliare il piccolo intestino con dissezione forbici in 3-4 strisce approssimativamente della stessa lunghezza e gettare le strisce longitudinalmente su una nuova piastra di Petri sterile. Per ogni striscia, inserire il bordo di taglio delle forbici sezionare all'interno del lume del piccolo intestino per fare un'incisione l'intera lunghezza of la striscia. Utilizzare pinze per piegare lateralmente aperta l'incisione per esporre il lume dell'intestino tenue.
  8. Utilizzare un vetrino sterile per raschiare delicatamente via villi sulla superficie luminale dell'intestino tenue. Tagliare il piccolo intestino in strisce lunghezza 1-2 cm con le forbici dissezione e trasferire queste strisce di un tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di ghiaccio freddo 1x PBS.
  9. Mescolare delicatamente il contenuto capovolgendo la provetta conica da 50 ml e permettono il contenuto di tessuto di depositarsi sul fondo della provetta conica da 50 ml. Aspirare il PBS 1x e ripetere tre volte lavando il tessuto con 10 ml di ghiaccio freddo 1x PBS. Sul lavaggio finale lasciare il tubo conico in ghiaccio per 10 minuti contenente 10 ml di PBS 1X ei piccoli segmenti di tessuto intestinale.
  10. Aspirare il PBS 1x e aggiungere 25 ml di 1x PBS + 2 mM EDTA. Collocare su una piattaforma oscillante a 4 ° C o in un cestello di ghiaccio per 45 min. Mentre il tessuto è in incubazione, etichettare sei provette da 15 ml coniche "frazione # 1-6."
  11. Lasciare il contenuto di tessuto di depositarsi sul fondo della provetta. Rimuovere e trasferire il surnatante al tubo 15 ml conica con l'etichetta "frazione 1". Ripetere l'1x PBS + 10% FBS scuotendo passo (3.11) cinque volte e trasferire il contenuto surnatante al fine di tubo adeguatamente etichettati-frazione.
  12. Centrifugare a 125 xg per 5 min. Aspirare il pellet surnatante e risospendere in 5 ml di pre-riscaldato 1x DMEM / F-12, senza fattori di crescita aggiunto.
  13. Centrifugare a 78 xg per 2 minuti. Aspirare 4 ml del supernatante e risospendere ogni pellet in 1 ml di materiale rimanente.
  14. Rimuovere 20 ml da ogni frazione e aggiungere ad un vetrino. Visualizza cripte e detriti sotto un microscopio ottico e determinare quali frazioni di combinare e unire di conseguenza per ottenere la massima Percentage delle cripte a rapporto di detriti.
    NOTA: Le frazioni 2-6 resa la maggiore percentuale di cripte per essere placcato. Le frazioni di piscina sono più spesso frazione 3 con un'aliquota del 4, e la frazione di 5 con frazione di 6.
  15. frazioni centrifuga da piastrate a 125 xg per 5 min. Aspirare il surnatante lasciando 50-100 ml rimanendo sopra il pellet.
  16. Mantenere i tubi in ghiaccio e aggiungere 1 ml di matrice proteica alle frazioni pool. Pipettare su e giù lentamente per prevenire aggiunta di bolle d'aria.
  17. Rimuovere 24 pozzetti pre-riscaldato dal 37 ° C incubatore e aggiungere 50 ml di matrice proteica / sospensione cripta al centro di ogni bene. Trasferire la seminato piastra in un incubatore a 37 ° per 10 minuti per consentire la caduta matrice proteica solidificare.
  18. Aggiungere 450 ml di mezzi di crescita organoide precedentemente preparati + 50 ml di R-spondin1 mezzi condizionati per pozzetto. Incubare le piastre a 37 ° C + 5% di CO 2 durante la notte.
  19. Aggiungere 50-100 ml di R-spondin1 condizionata mediuna per bene tutti i giorni. Ogni 3 ° giorno sostituire tutta mezzi di crescita organoide con appena preparato terreni di crescita organoide 450 ml / pozzetto descritto al punto 2.2. Inoltre aggiungere 50-100 ml di R-spondin1 condizionata supporti per pozzetto.
    NOTA: La caduta matrice proteica mantiene la sua integrità per una settimana, ma dopo 7 giorni procedere al organoidi passaging

4. Passaging organoidi Ogni 7 ° giorno

  1. Scongelare la matrice proteica durante la notte ghiaccio a 4 ° C il giorno prima passaging. Warm sterile 24 pozzetti a 37 ° C per almeno 30 min. Preparare i media di crescita organoide descritte al punto 2.2 e mantenere a 37 ° C fino a quando l'utilizzo.
  2. Rimuovere la piastra organoide da incubatore e cominciare passaging della piastra sul ghiaccio. Aspirare mezzi di crescita con una pipetta 10 ml da 3-4 pozzi per iniziare.
    NOTA: Tenere il supporto aspirato nella pipetta 10 ml, in quanto questo sarà utilizzato per rimuovere la caduta di matrice proteica nella fase successiva.
  3. Nel comepiratati-pozzi, pipetta su e giù per rimuovere il calo matrice proteica dalla piastra. raschiatura Gentle con la punta di una pipetta 10 ml è utile per staccare il calo matrice proteica. Trasferire il contenuto in una provetta da 15 ml.
  4. Incubare le provette da 15 ml coniche su ghiaccio per 10 minuti e centrifugare a 125 xg per 5 minuti a 4 ° C. Osservare un pellet bianco sul fondo della provetta conica. Delicatamente aspirare e scartare la maggior parte del / vecchi media crescita organoide surnatante sopra il pellet organoide lasciando 100-200 ml di sopra del pellet.
  5. Rompere le cripte organoide utilizzando un ago 23 attaccato ad una siringa da 1 ml. Aspirare ed espellere 10-15 volte al fine di dissociare le cripte. Ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria a causa di pipettaggio eccessivo.
  6. Risospendere le organoidi in 500 ml di matrice proteica e aggiungere 50 ml per pozzetto in una nuova 24 pozzetti pre-riscaldato. Aggiungere 450 ml di mezzi di crescita organoide precedentemente preparati + 50 ml di R-spondin1mezzi condizionati per pozzetto. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.

5. placcatura organoidi il 14 giorno per Pattern Recognition recettore stimolazione con PAMPs e Listeria monocytogenes per l'analisi di espressione genica

  1. Due giorni prima di sfidare, striscia fuori L. monocytogenes su una piastra di agar BHI.
  2. Il giorno seguente scegliere un L. monocytogenes colonia e crescere in 10 ml di brodo BHI a 37 ° C per una notte in agitazione a 200 rpm.
  3. Scongelare la matrice proteica durante la notte ghiaccio a 4 ° C il giorno prima sfida organoide. Warm sterile 24 pozzetti a 37 ° C per almeno 30 min. Preparare i media di crescita organoide descritte al punto 2.2 e mantenere a 37 ° C fino a quando l'utilizzo.
  4. Rimuovere la cultura organoide da incubatore e cominciare passaging di organoidi.
  5. supporti Aspirare da 3-4 pozzi e mantenere il supporto aspirato nella pipete 10 ml in quanto questo sarà usato per rimuovere il calo matrice proteica. Pipetta su egiù per spostare la goccia matrice proteica dalla piastra. raschiatura Gentle con la punta di una pipetta 10 ml è utile per staccare il calo matrice proteica. Trasferire il contenuto in una provetta da 15 ml.
  6. Incubare le provette da 15 ml coniche in ghiaccio per 10 min. Centrifugare a 125 xg per 10 min a 4 ° C. Osservare un pellet bianco sul fondo della provetta conica. Aspirare delicatamente il surnatante lasciando circa 100 ml di surnatante residuo dietro.
  7. Risospendere il pellet organoide in 5 ml di ghiaccio freddo 1x PBS e rimuovere un'aliquota 10 microlitri per il conteggio. Aggiungere l'aliquota di 10 microlitri per mezzo di un emocitometro, senza la polizza di copertura in vetro. sovrapporre delicatamente il vetrino di vetro sulla parte superiore della goccia.
    NOTA: Il emocitometro intasare con organoidi se il vetrino non viene rimosso prima.
  8. Contare il numero totale di organoidi tramite un microscopio ottico in ogni griglia / l'intera camera del emocitometro e determinare la concentrazione organoide: numBER di organoidi totale contato per 10 ml.
  9. Rimuovere un volume appropriato dal tubo conico 15 ml che permetterà un numero sufficiente di organoidi da seminate per il dosaggio e centrifugare questa sospensione a 125 xg per 10 min.
    NOTA: L'intervallo tra i 40-100 organoidi per pozzetto di una piastra ben 24 è sufficiente per l'analisi di RNA La dimensione tipica organoide può variare da 300 micron a 1000 micron di diametro.
  10. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di matrice proteica senza generare bolle d'aria. Aggiungere 50 ml di / proteine ​​della matrice sospensione organoide per pozzetto in una piastra ben 24.
    NOTA: La quantità di matrice proteica utilizzata per sospendere di nuovo organoidi varierà per il numero di condizioni di trattamento e replicati tecnici.
  11. Aggiungere 500 ml di terreni di crescita organoide (senza N-acetil-cisteina) a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C + 5% CO 2 per 1 ora.
  12. Preparare concentrazioni 2x di PAMPs (cioè flagellina,lipopolisaccaride) e vivere L. monocytogenes. Misurare il diametro esterno di vivere L. monocytogenes e bistecca su un piatto BHI per il conteggio. Trattare organoidi a 1 x 10 6 unità formanti colonie (CFU) / ml.
    NOTA: Il OD di determinazione CFU varierà in base al tipo di batteri e dovrebbero essere valutati prima di organoide stimolazione. Ad esempio, un diametro esterno di 0,6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml per L. monocytogenes, ma dovrebbero anche essere valutati in modo indipendente prima dell'esperimento.
  13. Streak una diluizione in serie dal trattamento stock di L. monocytogenes per determinare con precisione il trattamento CFU / ml. Gli autori ritengono che una diluizione di 1 x 10 8 di 100 microlitri su una piastra di agar BHI è sufficiente per contare le colonie per determinare un'accurata CFU / ml.
  14. Preparare una soluzione di calore ucciso di L. monocytogenes prendendo un'aliquota 1 ml del live L. monocytogenes soluzione e centrifugare a 5000 xg per 10 min. Aspirare il surnatante e lavareil pellet batterico con 1 ml di PBS 1x.
    1. Centrifugare la L. monocytogenes a 5.000 xg per 10 min e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1x. Riscaldare uccidere il L. monocytogenes in un tubo di 1,7 ml di polipropilene mediante riscaldamento a 80-90 ° C per 1 ora. Cultura un'aliquota di 100 ml di calore ucciso L. monocytogenes su un piatto di agar BHI per confermare nessun batteri vivi rimangono.
    2. Aggiungere 500 microlitri della PAMP 2x appropriata e / o il trattamento microbo 500 microlitri mezzi residente in pozzetti determinati dall'utente. Incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 per 24 ore.
      Nota: aggiunta un'aliquota di 500 microlitri di un trattamento / microbo 2x PAMP a 500 microlitri di media residenti porterà la concentrazione trattamento a 1x in un volume totale di 1 ml.
  15. Il giorno seguente, contare manualmente L. monocytogenes colonie per una determinazione accurata di trattamento CFU / ml. supporti Aspirare dalla piastra di organoidi trattati e lavare pozzi tvolte hree con PBS 1x.
  16. Procedere alla estrazione di RNA tramite fenolo / cloroformio 11 o un kit di estrazione di RNA in base alle istruzioni del produttore. Valutare l'espressione genica utilizzando standard di qRT-PCR 12.

6. organoidi placcatura il 14 giorno per PAMP e L. monocytogenes sfida per l'analisi delle proteine ​​in Surnatante

  1. Due giorni prima di sfidare, avviare una coltura cellulare di cellule Caco-2, densità di semina ≈1 x 10 6 cellule in un pallone T-75 con 1x DMEM + 20% FBS e incubare le cellule Caco-2 a 37 ° C + 5 % di CO 2. Iniziare una coltura batterica di L. monocytogenes su piastra BHI e incubare piastra in un incubatore batterica a 37 ° C.
  2. Il giorno seguente scegliere un L. monocytogenes colonia e crescere in 10 ml di brodo BHI a 37 ° C durante la notte. Scongelare la matrice proteica durante la notte ghiaccio a 4 ° C il giorno prima sfida organoide.
  3. Il giorno seguente calda uno sterile 96 e nero a paretepiastra a 37 ° C per almeno 30 min. Preparare mezzi di crescita organoide senza N-acetil-cisteina descritto al punto 2.2 e mantenerlo a 37 ° C fino al loro utilizzo. Rimuovere la cultura organoide da incubatore e cominciare passaging di organoidi.
    NOTA: La dimensione tipica organoide può variare da 300 micron a 1000 micron di diametro.
  4. supporti Aspirare da 3-4 pozzi e mantenere il supporto aspirato nella pipete 10 ml in quanto questo sarà usato per rimuovere il calo matrice proteica. Risospendere con una pipetta per rimuovere il calo matrice proteica dalla piastra. raschiatura delicata con una pipetta 10 ml è utile per sloggiare la caduta di matrice proteica. Trasferire il contenuto in una provetta da 15 ml.
  5. Incubare le provette da 15 ml coniche in ghiaccio per 10 min. Centrifugare a 125 xg per 10 min a 4 ° C. Osservare un pellet bianco sul fondo della provetta conica. Aspirare delicatamente il surnatante lasciando 100 l di surnatante residuo dietro.
  6. Risospendere il pellet organoide in 5 ml di ghiaccio freddo1x PBS e rimuovere un'aliquota 10 microlitri per il conteggio. Aggiungere l'aliquota di 10 microlitri per mezzo di un emocitometro e sovrapporre delicatamente il vetrino di vetro.
    NOTA: Il emocitometro intasare con organoidi se il vetrino non viene rimosso prima.
  7. Contare il numero totale di organoidi tramite un microscopio ottico in ogni griglia della emocitometro / l'intera camera e determinare la concentrazione organoide: numero di organoidi totali contate per 10 ml.
  8. Rimuovere un volume appropriato dal tubo conico 15 ml che permetterà un numero sufficiente di organoidi da seminate per il dosaggio e centrifugare questa sospensione a 125 xg per 10 min.
    NOTA: La quantità di matrice proteica utilizzata per sospendere di nuovo organoidi varierà per la quantità di condizioni di trattamento e replicati tecnici. Gli autori ritengono che 40-100 organoidi è sufficiente per l'analisi proteina secreta.
  9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di matrice proteica / bene senza generarebolle d'aria.
    NOTA: La quantità di matrice proteica utilizzata per sospendere di nuovo organoidi varierà per la quantità di condizioni di trattamento e replicati tecnici.
  10. Lasciare almeno due colonne vuote sulla 96 piastra di coltura tissutale e nero parete come queste serviranno come pozzi seminati con cellule Caco-2 per la generazione di una curva standard. Aggiungere 50 ml di matrice proteica + sospensione organoide per pozzetto di una piastra di coltura dei tessuti pre-riscaldato a 96 pozzetti nero parete. Conservare la piastra a 37 ° C per 10 min per permettere matrice proteica solidificare.
  11. Aggiungere 100 ml di terreni di crescita organoide (senza N-acetil-cisteina) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 per 1 ora.
  12. Preparare concentrazioni 2x di PAMPs e vivere L. monocytogenes. Aggiungere 100 ml di ogni data condizione di trattamento per pozzetto e incubare per 24 ore.
  13. Il seguente piastra giorno cellule Caco-2 nei pozzetti curva standard. Iniziare il riscaldamento sterile 1x PBS, 0,25% tripsina e 1x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
  14. Rimuovere le pallone T-75 contenenti cellule Caco-2 e aspirare i mezzi di coltura cellulare. Lavare le cellule con 10 ml di PBS 1X. Aspirare il PBS 1x, aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e posto T-75 pallone a 37 ° C incubatore per 15 min.
  15. Visualizza la boccetta sotto un microscopio ottico per garantire che le cellule hanno staccato quindi aggiungere 8 ml di 1x DMEM + 20% FBS alle staccati cellule Caco-2 e trasferire in un tubo da 15 ml. Rimuovere una aliquota di 10 microlitri e contare le cellule al microscopio ottico con un emocitometro.
    NOTA: Un numero cella superiore di 60.000 cellule / pozzetto funziona bene e diluizioni può essere condotta per la generazione della curva standard fino a 2.500 cellule / pozzetto.
  16. Risospendere le cellule Caco-2 in matrice proteica e aggiungere 50 ml per pozzetto di pozzetti. Lasciare che la matrice proteica a solidificare a 37 ° C per cellule Caco-2.
    NOTA: i media di crescita per le cellule Caco-2 non ha bisogno di essere aggiunti in seguito solidificazione della matrice proteica.
  17. A seguireil tempo di trattamento 24 ore per il test organoide, aspirare e salvare le organoide mezzi surnatante cellulari e tenere in ghiaccio. Lavare i pozzetti tre volte con PBS 1x. Aggiungere 100 ml di metanolo al 100% in ogni pozzetto comprese le Caco-2 pozzi curva standard e incubare a 4 ° C o in ghiaccio per 20-30 minuti per fissare i organoidi.
    NOTA: Non è necessario che le Caco-2 pozzi curva standard essere lavati con PBS 1x, in quanto possono avere metanolo aggiunto direttamente.
  18. Dopo l'incubazione metanolo, lavare i pozzetti tre volte con PBS freddo ghiaccio 1x. Conservare la piastra a 4 ° C per un massimo di 1-2 settimane.
  19. Aggiungere colorante colorazione nucleare ad una concentrazione di 1 mg / ml per pozzetto, coprire la piastra con foglio di alluminio e incubare a 4 ° C durante la notte.
  20. Utilizzare un lettore di piastre da 96 pozzetti per misurare colorante colorazione nucleare di eccitazione / emissione (350nm / 461nm, rispettivamente) e normalizzare ogni organoide bene alla curva standard di cellule Caco-2.
  21. Procedere al test a valle, come ad esempio ELISA

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Representative Results

Quando si segue questo protocollo per coltivare organoidi intestinali, caratteristica a forma di sfera organoidi saranno presenti dopo la raccolta. L'aggiunta di R-spondin1 mezzi condizionati ogni giorno avvierà la crescita e la gemmazione delle organoidi. La crescita di organoidi è mostrato in Figura 1A - F e rappresentativa organoidi intestinali nei giorni 1, 2, 4, 5, 6 e il giorno 14. Figura 1F rappresenta le caratteristiche di crescita non omogenei di organoidi il giorno 14.

Una volta che i organoidi sono coltivate in un numero adeguato, possono essere ripiastrate e sfidato con vari PAMPs e / o microbi. Analisi di espressione può essere eseguita mediante tecniche standard. Questo è rappresentato nella Figura 2A-C che mostra l'espressione di mRNA di citochine infiammatorie IL-18, IL-6 e TNFa che sono stati analizzati dopo un24 ore sfida di organoidi con il calore ucciso L. monocytogenes e la flagellina PAMP. Il razionale per valutare l'espressione mRNA citochine IL-18, IL-6 e TNFa è che questi erano buoni candidati per modulato da cellule epiteliali in risposta alla sfida patogeni, e la modulazione di queste citochine infiammatorie sarebbe dimostrare l'efficacia della tecnica.

Figura 3A - C dimostra la colorazione nucleare relativo di organoidi intestinale con colorante colorazione nucleare dopo fissazione con sfondo minima colorazione dei detriti nella matrice proteica residente. Questo metodo di fissaggio e la colorazione può essere applicato per normalizzare saggi, che rappresenteranno diverso numero di cellule in ciascun pozzetto. Questo è evidente in figura 4 quando si genera una curva standard di diluizioni seriali di cellule Caco-2 placcati in matrice proteica, poi fissate e colorate con nuclearetintura colorazione. Il valore di R 2 di 0,89 indica una relazione lineare tra il numero di cellule e media intensità di fluorescenza, e l'equazione lineare può essere usata per normalizzare organoidi al numero di cellule. La curva standard illustrato nella figura 4 comincia a raggiungere il limite di saturazione oltre 30.000 cellule per pozzetto. Una titolazione di celle sopra 30.000 cellule per pozzetto è stato mostrato in Figura 4 per includere la gamma di saturazione di colorante colorazione nucleare. Maggiore precisione di normalizzazione sarà ottenuta con un numero di cellule che riflette il range lineare del colorante colorazione nucleare prima di raggiungere il limite di saturazione.

Figura 1
Figura 1:. Piccolo intestinale organoide Crescita Tempo percorso di crescita per le piccole intestino organoidi murine derivate seguenti isolamento. (A) Giorno 1. (B) 2. Day (C) Giorno 4. (D) Day 5. (E) Giorno 6. (F) Giorno 14. Le immagini sono rappresentativi della crescita organoide per ogni dato giorno. bar scala uguale a 200 micron nell'immagine a sinistra per A, B, C, D, ed E. Scala bar uguale a 100 micron di l'immagine giusta per A, B, C, D, ed E. Scala bar eguagliare 1.000 micron e 200 micron per le immagini sinistra e destra per F, rispettivamente. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: L'espressione dell'mRNA di citochine infiammatorie Dopo 24 ore PAMP sfida mRNA espressione relativa di wild-type organoidi intestinali contestato per 24 ore con PAMPs e calore ucciso Listeria monocytogenes (A - C) rappresentano piega cambiamento di i.. citochine nflammatory IL-18, IL-6 e TNFa rispettivamente. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: colorazione fluorescente relativa di organoidi per la normalizzazione colorazione nucleare di organoidi con i seguenti fissazione.. (A) campo luminoso di organoidi. (B) colorazione fluorescente di organoidi con tintura colorazione nucleare. (C) immagine unita di campo luminoso e colorazione fluorescente. Bar scala uguale a 400 micron di tutte le immagini. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"> Figura 4
Figura 4: curva standard generata da cellule Caco-2 curva standard generata dai pozzi in triplicato.. Cellulare semina aveva una gamma a partire da 60.000 cellule per pozzetto con diluizioni giù a 2.500 cellule per pozzetto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Panoramica del diagramma protocollo 1-Pannello superiore della figura illustra la raccolta del R-spondin1 mezzi condizionata. Panel 2-centro della figura illustra gli aspetti del protocollo per la raccolta e il mouse cultura piccole organoidi intestinali. Pannello 3-inferiore della figura illustra: (A) La placcatura di 14 giorni organoidi coltivate. (B) Sfida con PAMPs / L.monocytogenes, e lasciando pozzi non occupate per generare una curva standard. (C) A seguito della sfida PAMP, la placcatura di cellule Caco-2 nei pozzetti in precedenza non occupate per generare una curva standard. (D) Dopo la fissazione e l'aggiunta di un colorante colorazione nucleare, misurando l'eccitazione / emissione dei pozzi e normalizzante nei confronti di una curva standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La cultura e la manutenzione di organoidi intestinali è una procedura che può essere masterizzato da qualsiasi persona con la tecnica di coltura tissutale adeguata. Ci sono sottigliezze in passaging rispetto a crescere le cellule in un monostrato più convenzionale, ma queste sottigliezze non sono difficili da superare. I passaggi critici di questo metodo comporta poter far crescere le organoidi ad una densità sufficientemente elevata per la semina ottimale. Gli esperimenti devono essere ridimensionati con organoidi come grandi densità di semina che può comunemente essere raggiunti con linee cellulari non sono pratici. Questo diventa particolarmente evidente quando ci sono più gruppi di trattamento.

Questo protocollo è destinato a fornire un metodo passo-passo per studiare le interazioni ospite-patogeno dell'epitelio intestinale con una varietà di differenti batterica, patogeni virali e fungine, nonché difficoltà indirizzo usando questo sistema rispetto a normalizzazione. I rapporti sono disponibili che describe le interazioni di organoidi intestinale con il patogeno batterico Salmonella, ma non affrontano i metodi di normalizzazione quando si misura citochine secrete 13.

Ci sono diverse difficoltà che si incontrano quando la normalizzazione culture organoide con metodi diversi. Normalizzare proteina secreta attraverso test acido bicinconinico (BCA) è un'opzione; Tuttavia, i componenti di crescita necessari per la cultura organoide (N2 e / o vitamina B27) interferisce con il saggio BCA (dati non mostrati) Normalizzazione via vitalità cellulare, ad esempio un saggio MTT modificato è stata descritta. 14; tuttavia, un trattamento che alterare l'attività metabolica mitocondriale delle organoidi introdurrà un metodo impreciso per la normalizzazione tramite questa tecnica come MTT è basato sulla riduzione dall'azione delle deidrogenasi mitocondriali 15. È inoltre necessario rimuovere N-acetil-cisteina (NAC) dal supporto, non sullaly se normalizzazione mediante la tecnica MTT è desiderato, ma se il trattamento con un agente patogeno batterico come NAC può inibire la crescita batterica 16.

I vantaggi di questa tecnica sono che le citochine secrete e prodotti proteici da organoidi possono ora essere normalizzata contro una curva standard di cellule Caco-2. Limitazioni di questa tecnica sono che la normalizzazione è correlativa causa colorazione nucleare di non trasformati organoidi epiteliali primarie sono normalizzati contro la colorazione nucleare di una linea di cellule di cancro del colon. Gli autori ritengono che la fissazione con metanolo e la colorazione dei nuclei con nucleare colorazione colorante è una tecnica normalizzazione efficace contro una curva standard di cellule Caco-2. Anche se le caratteristiche di crescita di questa linea di cellule di cancro al colon non esattamente imitano le caratteristiche di crescita di organoidi intestinali, con una macchia nucleare e misurando l'intensità media di fluorescenza è una buona strategia per normalizzare contro il numero totale delle cellule.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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