A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Visualização de moléculas de DNA grandes amarrados em superfícies de vidro ou talão tem sido utilizado para investigar as interações DNA-proteína, dinâmica de proteínas em substrato de ADN, 1,2 e física de polímeros. 3,4 Uma plataforma de moléculas de DNA grandes single-tethered tem um pouco distinta vantagens em comparação com outros métodos de imobilização de DNA. 5 primeiro, uma grande molécula de ADN amarrado na superfície tem uma conformação em espiral aleatória natural sem um fluxo de cisalhamento, o que é criticamente importante para uma proteína de ligação de ADN de reconhecer o seu local de ligação. Em segundo lugar, é muito fácil de alterar o ambiente químico em torno de moléculas de DNA para uma série de reacções enzimáticas em uma câmara de fluxo. Em terceiro lugar, um fluxo de cisalhamento de microfluidos induz ADN molecular do alongamento até 100% do comprimento do contorno completo, o que é muito difícil de conseguir utilizando o alongamento do ADN as abordagens alternativas, tais como a superfície de imobilização 6 e confinamento nanochannel. 7 Um totalmente stretchemolécula de DNA d também fornece informação de posição que pode ser útil para monitorizar os movimentos enzimáticas no mapa genómico.

No entanto, a abordagem DNA tethering tem uma lacuna crítica em que a tintura a intercalação, tal como YOYO-1 geralmente provoca moléculas de DNA amarrados para ser facilmente quebrado pela luz de excitação de fluorescência. De um modo geral, moléculas de DNA grandes têm de ser marcadas com um corante fluorescente para a visualização sob um microscópio fluorescente. Para este efeito, YOYO-1 ou outros corantes da série TOTO são usadas principalmente porque estes corantes fluoresce apenas quando intercalar de ADN de cadeia dupla. 8 No entanto, é bem conhecido que a bis-intercalantes corante faz com que o ADN induzida pela luz foto-clivagem porque da intercalação de fluoróforos. 9 Além disso, as moléculas de ADN fluorescentes coradas amarrados na superfície são mais frágeis uma vez que os fluxos de cisalhamento pode exercer forças de quebra no movendo-se livremente moléculas de ADN. Por isso, desenvolvemos FP-DBP como um romance Dcorante proteína NA-coloração para imagiologia de grandes moléculas de ADN na superfície amarrados. A vantagem da utilização de FP-PAD é que ela não provoca foto-clivagem das moléculas de ADN ao qual se liga. 10 Além disso, FP-PAD não aumenta o comprimento do contorno do DNA, enquanto que corantes bis-intercalantes aumentar o comprimento do contorno por cerca de 33%.

Este método de vídeo introduz a abordagem experimental para prender moléculas de DNA grandes a uma superfície PEG-biotina. A Figura 1 ilustra as diferentes abordagens de amarrar DNA com extremidades sem corte e extremidades pegajosas. Assim, este método de coloração pode ser aplicado a qualquer tipo de molécula de ADN. A figura 2 mostra uma representação esquemática da montagem de câmara de fluxo que pode ser controlada por uma bomba de seringa para gerar fluxos de cisalhamento para esticar moléculas de ADN, bem como a carga química e enzima soluções. a Figura 3 demonstra micrografias das moléculas de ADN esticadas inteiramente amarrados no PEGylatsuperfície ed 11 e corados com FP-PAD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Biotinila�o

  1. A biotinilação de DNA de extremos cerses usando transferase terminal (TdT)
    Nota: O uso de T4 DNA (166 kpb), que é um DNA de extremos cerses.
    1. Adicionar 5 uL de 2,5 mM de CoCl2, 5 ul de 10 × tampão de reacção, 0,5 ul de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 ul de transferase terminal (10 unidades) e 0,5 ul de ADN de T4 (0,5 ug / uL) à mistura de reacção. Adicione a um volume final de 50 ul pela adição de 38,5 ul de água.
    2. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 1 h.
      Nota: o tempo de reacção prolongado pode produzir ADN de dupla presa, ou seja, é possível que biotinas são marcados em ambas as extremidades.
    3. Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, pH 8.
    4. Manter o tubo a 4 ° C.
  2. A biotinilação de ADN ended pegajoso utilizando ADN ligase
    Nota: O uso λ ADN (48,5 kpb), que é um ADN pegajosa-fim. <ol>
  3. Adicionar 1 ul de DNA-ligase de T4, 5 uL de tampão de ligação 10 ×, 1 ul de 25 ng / ul de ADN de fago λ, e adicionar 43 ul de água para fazer um volume final de 50 ul.
  4. Manter o tubo a 4 ° C.

2. funcionalizados A derivação de superfície

Nota:. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN na superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1 Este processo de PEGilação é importante para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente o ruído aleatório criado por ligação de moléculas indesejáveis ​​sobre a superfície.

  1. Limpeza Piranha
    Nota: As soluções Piranha reagir violentamente com materiais orgânicos, pelo que deve ser manuseado com cuidado, seguindo as orientações de segurança adequadas.
    1. Lugar lamelas em um rack de politetrafluoretileno (PTFE), e mantê-los by PTFE veda-rosca longitudinalmente, metade na borda das superfícies e metade na prateleira. Após acondicionamento, deixar uma parte longa (~ 5 cm) de fita adesiva para lidar com a grade durante o procedimento de limpeza.
    2. Encher um copo de vidro de 1 L com 350 ml de H 2 SO 4 e 150 ml de H 2 O 2 para fazer a solução piranha numa hotte. Coloque o rack em solução piranha, durante 2 horas.
    3. solução vazia piranha da taça, e lamelas enxaguar abundantemente com água deionizada até que o pH da água no copo atinge neutro. Utilizar as tiras de papel de pH.
    4. Sonicar os suportes de lamelas na água proveta contendo, durante 30 min. água vazia do copo imediatamente antes amino silanização. Use 75 W de potência sonicação de limpar e derivar os substratos de vidro.
  2. Aminosilanization na superfície de vidro
    1. Adicionar 2 ml de N - [3- (trimetoxissilil) propil] etilenodiamina e 10 ml de ácido acético glacial em 200 mlde álcool metílico em um recipiente de polipropileno limpo para preparar a solução aminosilanization.
    2. Coloque lamelas limpas no recipiente de polipropileno. Agite-los a 100 rpm e a temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Sonicar a proveta com lamelas derivatizadas durante 15 minutos a 75 W. agitá-los a 100 rpm e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.
    4. Esvaziar a solução a partir do recipiente, e enxaguar lamelas cuidadosamente, uma vez com álcool metílico, e duas vezes com álcool etílico. lamelas de loja em álcool etílico e usá-los dentro de duas semanas.
  3. PEGilação da lamela
    1. Adicione 10 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO3). Filtra-se a solução com um filtro de seringa de 0,22? M.
    2. Dissolve-se 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidil (biotina-PEG-SC) e 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) em 350 ul de NaHCO3. Use um tubo de proteção contra a luz.
    3. Vortex do tubo vigorosamente durante 10 segundo, e centrifuga-se que a 10.000 × g durante 1 min para remover bolhas.
    4. Lavar uma lâmina de vidro com acetona, seguido por lavagem com álcool etílico. Permitir o slide secar ao ar completamente.
    5. Colocar uma gota (50 uL) de solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Cubra a gota suavemente com um amino silanizada lamela, sem gerar bolhas.
    6. Colocar as lâminas para 3 horas durante a noite em um escuro, bem nivelado câmara húmida à temperatura ambiente. Use um suporte de ponta de pipeta vazia como a câmara, com água na parte inferior. Selar solução de PEG residual no tubo e mantê-lo a 4 ° C.
    7. Lavar as lamelas PEGylated cuidadosamente com água deionizada. Armazená-lo em um lugar escuro e seco até o uso.

3. Montagem de uma câmara de fluxo

  1. Fabricar um suporte de acrílico perfurados, como na Figura 2. Assegure-se que o diâmetro do tubo de inserção é 0,762 milímetros, e designa um orifício de entrada é um e o outro éuma saída (Figura 2).
  2. Coloque tiras adesivas de dupla face de fita (largura 5-6 mm) sobre um suporte acrílico (Figura 2), alinhando perpendicularmente a um orifício de entrada e de saída, não perturbando quaisquer furos de canal. Use estas tiras de fita como paredes multi-canal para fazer câmaras. Esfregue a fita usando uma ponta de pipeta.
  3. Coloque uma lamela PEGylated na parte superior para fazer câmaras de fluxo, com o lado da PEGylated bruços.
  4. Para evitar qualquer solução de vazamento, pressione o topo de uma lamela sobre a área onde fitas de dupla face são colocados. Adicionar cola epoxi de secagem rápida, para fechar as extremidades da câmara na parte superior e na parte inferior (cor amarela na Figura 2).
  5. Conectar uma peça curta (2,5 cm) de tubo (diâmetro externo, OD, 0,042 ") para uma seringa estanque de gás e vedar a junta com cola epóxi.
  6. Conecte um longo tubo flexível (OD: 0,03 ") para a tubulação ligada à seringa e selar a junção com cola epóxi.
  7. Encha o tubing ligada à seringa com água DI. Certifique-se de que não há bolha de ar.
  8. Insira a tubulação no orifício da câmara de fluxo selada com cola epóxi.
  9. Coloque uma ponta amarela (200 ul ponta) do outro furo como um reservatório.

4. Amostra Carregando no fluxo Câmara

Nota: neutravidina pode ser substituído por outras proteínas avidina, tais como estreptavidina. Todas as reacções podem ser realizadas à temperatura ambiente, a menos que seja mencionado. Tome solução da amostra em uma ponta amarela, e instalar a ponta com a solução para o buraco do suporte de acrílico (Figura 2b).

  1. Definir a taxa de fluxo da bomba de seringa a 50 ul / min. Carga 20 ul de proteína de avidina (25 ug / ml em solução T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e mantê-lo durante 10 min.
  2. Carga 20 l de oligodesoxinucle�idos biotinilados (100 mm em 1 × TE), e mantê-lo por 10 min. Se transferase terminal é utilizado, pule o carregamentode oligodesoxinucle�idos.
  3. Carga de 20 uL de solução de ADN a partir do Passo 1 para a câmara de fluxo a uma taxa de fluxo de 10 uL / ​​min, e mantê-lo durante 30 min.
  4. Lava-se a câmara de fluxo com 1 x TE, e carregar 40 ul de FP-DBP de 10 (~ 80 nM).
  5. Observar ADN sob um microscópio de fluorescência com o fluxo contínuo de moléculas de coloração em 1 × TE numa lente objectiva 60X. Use 488 nm laser em estado sólido para excitação do FP (eGFP) -DBP. Para a completa extensão de moléculas de DNA, aplicar diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA usadas. Por exemplo, aplicam-se 50? L / min durante 48,5 kpb de ADN λ, e 100 ul / min durante 166 kpb de ADN de T4.
    1. Para reciclagem do titular do acrílico, mergulhe câmaras de fluxo montados em uma solução de detergente doméstico 12. Retirar fitas ou epóxi com uma lâmina de barbear e esfregar com as mãos para levá-los completamente desligado. Desobstruir furos com agulhas de seringa. Mantenha os titulares em água deionizada até à sua utilização.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A Figura 1 mostra dois métodos de ADN de ancoragem diferentes dependendo das estruturas terminais da molécula de DNA. A Figura 1a ilustra a forma como as moléculas de ADN casquilhos pegajosos são hibridados com os oligonucleótidos biotinilados complementares, que são imobilizadas na superfície de PEG a revestida com avidina. A Figura 1B mostra a adição de biotinilado ou ddNTP de dNTP para o grupo hidroxilo 3 'de um ADN de extremos cerses por transferase terminal. Nós adicionamos elementos de ligação flexíveis entre moléculas de DNA e biotina. Isto aumentou a eficiência de ligação e de ligação avidina-biotina para proporcionar espaço suficiente para as reacções. A Figura 1C mostra a representação esquemática geral para amarrar ADN na superfície de PEG a revestida com avidina.

A Figura 2 ilustra o conjunto da câmara de fluxo, juntamente com um suporte de acrílico. Em comparação com glass / lâminas de vidro de quartzo, um suporte de acrílico feito por medida simplifica a preparação da câmara de fluxo por microscopia de epi-fluorescência. 12 A câmara de fluxo permite a mudança instantânea de condições de tampão para reacções enzimáticas, 6 e as moléculas de ADN de alongamento.

A Figura 3 demonstra DNA single-tethered e T4 λDNA coradas com FP-PAD. cisalhamento microfluídico flui moléculas de DNA individuais alongadas até comprimentos de contorno completo, tal como 16,5 mm (DNA 48,5 kb λ x 0,34 nm) e 56,4 mm (166 kb de ADN T4 x 0,34 nm). Fomos capazes de repetir DNA alongamento e relaxamento várias vezes durante um período prolongado (por exemplo, meia-hora), já que utilizou FP-PAD que não cause foto-clivagem.

figura 1
Figura 1. Ilustração esquemática de tethering DNA. a) Um sADN ended tique é hibridado com um oligonucleótido biotinilado complementar. Trietileno-glicol é um agente de ligação flexível entre o oligonucleótido e biotina. B) biotinilado dNTP é adicionado a uma extremidade romba de ADN de cadeia dupla, por transferase terminal. Polycarbon espaçador (11 átomos) é um elemento de ligação flexível entre dNTP e biotina. C) ADN biotinilado é ancorada a uma proteína de avidina, que é ligado a um PEG biotinilado ligado de forma covalente à superfície do vidro. A proporção de PEG biotinilado para PEG normal foi de 0,025 (01:40). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Fluxo de câmara. a) câmara de fluxo consiste em um suporte de resina de ácido acrílico, tiras de fitas dupla face e uma PEGylated cobrir deslizamento. O titular de acrílico de dimensões 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x W x H), foi fabricado com corte a laser b) Vista lateral da câmara de fluxo:. Perfurado buracos são uma porta de entrada no qual uma ponta amarela é instalado para um reservatório tampão, e uma porta de saída que está conectado a um tubo controlado por uma bomba de seringa. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Imagens microscópicas fluorescentes de moléculas de DNA esticadas corados com FP-PAD. a) bacteriófago λ ADN (48,5 kpb) preso na superfície após a ligadura com oligonucleótidos complementares biotinilados. b) do bacteriófago T4 de ADN (166 kpb) preso na superfície após a adição de biotina com transferase terminal. setas indicadas mostrar molecul DNAES esticado até aos seus comprimentos de contorno completo, tais como 16,5 ^ M para o DNA λ e 56,4 mm para ADN de T4. Barras de escala:. 10 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aqui nós apresentamos uma plataforma para visualização de moléculas de DNA longos biotinilados para a ancoragem em superfícies. Nós relatamos uma abordagem para moléculas de DNA amarrados em uma superfície revestida de proteína avidina com albumina sérica bovina biotinilado. 6 Na abordagem anterior, verificou-se uma questão crucial de DNA photo-clivagem causada por corantes bis-intercalação que mancham moléculas de DNA amarrados na superfície. Como estes fluoróforos continuamente animado têm uma elevada probabilidade de atacar uma espinha dorsal de fosfato de DNA, 9 o poder de luz de excitação teve que ser minimizado para evitar photo-clivagem.

A fim de ultrapassar este inconveniente, foi desenvolvido por engenharia genética de proteínas fluorescentes com capacidade de ligação ao ADN (FP-PAD) para coloração de ADN sem a foto-clivagem. 10 Observou-se coloração de DNA fiáveis ​​sobre as superfícies de proteínas revestidas com avidina. No entanto, esta plataforma tinha um outro problema da agregação indesejável de proteínas fluorescentes nasuperfície da proteína, resultando em aumento de ruído de fundo. É essencial para minimizar este ruído aleatório para a análise de DNA única molécula para melhorar o contraste de ADN e as proteínas a partir do fundo. A utilização de FP-PAD, por conseguinte, requer passivação de superfície para evitar a proteína fluorescente de ser adsorvido na superfície. PEG pode ser um candidato poderoso para esta finalidade. 12 Assim, foi utilizado PEG-biotinilado, o que aumentou dramaticamente a relação sinal-ruído para as moléculas de ADN de imagem FP-PAD coradas amarrados na superfície.

Há várias etapas críticas e notas neste método de rendimentos mais elevados. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN sobre uma superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1. Este processo de passivação de superfície é crítica para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente adsorção aleatório de geração de ruído nas superfícies.Portanto, aminosilanization durante a noite e PEGylation são fortemente recomendados. Além disso, a limpeza da lâmina de vidro, bem como o vidro de cobertura com uma solução piranha pode reduzir ainda mais o ruído de fundo.

Um oligonucleótido biotinilado deve ter um grupo fosfato na extremidade 5 ', de modo a ligá-lo a 3' grupo hidroxilo de uma molécula de DNA grande. A sequência do oligonucleótido biotinilado é 5'-P-GGGCGGCGACCT-TEG-biotina-3 'para amarrar ADN λ. A solução de DNA λ tem de ser carregada logo após a preparação da solução de ADN λ (descrito em 1.1), por causa do ADN λ forma frequentemente concatemeros com armazenamento de longo tempo. Para ADN de extremidades lisas, tais como ADN de T4, de transferase terminal pode adicionar dUTPs biotinilados em ambas as extremidades de ADN, sem qualquer especificidade. Assim, o tempo de reacção de transferase terminal de tem de ser cuidadosamente ajustada em torno de uma hora, de outra forma estendida de reacção pode produzir ADN duplamente marcada (isto é, ambas as extremidades estão marcados com biotina). em addsição para ADN virai, tal como λ e T4, quaisquer tipos de ADN pode ser utilizada nesta plataforma. No entanto, é recomendado o uso de fragmentos de ADN genómico gigantesco após digestão por enzimas de restrição raro-cortador tais como SwaI ou NotI

taxas de fluxo diferentes são aplicadas para diferentes comprimentos de DNA. Normalmente, as moléculas de ADN mais longas requerem caudais mais rápidos para esticar completamente as moléculas de ADN, para coincidir com o comprimento do contorno exacto. Por exemplo, λ ADN pode esticar até 16,5 mm, o que corresponde ao valor calculado de 0,34 nm x 48502 pb.

É muito importante para preparar de fresco todos os materiais, em particular todas de proteínas e PEG. Por exemplo, neutravidina facilmente perde a sua função de ligação biotinas se ele é armazenado como uma solução diluída. Para soluções de PEG, o pH é crítica para conjugar os grupos funcionais de uma amina primária e N-hidroxissuccinimida. Portanto, recomenda-se preparar de fresco todos os materiais, pelo menos, a cada semana.

A visualização das grandes moléculas de DNA amarrados na superfície é uma plataforma versátil para ser aplicado para uma variedade de aplicações, tais como genómica, epigenomics, estudos bioquímicos para ADN e interacção de proteína, e estudos física de polímeros. No entanto, esta abordagem está actualmente limitada apenas para modelar sistemas que utilizam moléculas de ADN relativamente simples e bem conhecidas, tais como o genoma viral. Para ser estendido para o genoma humano e epigenoma, é extremamente importante para estabelecer uma plataforma robusta, confiável e simples para uso prático. Ao superar DNA photo-clivagem induzida por luz e prevenção da adsorção aleatória de proteína fluorescente na superfície, esta plataforma, portanto, proporciona imagens nítidas e de alto contraste para DNA alongada com os fluxos de cisalhamento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats