Visualisering av Surface-tjoret Large DNA-molekyler med et fluorescerende protein DNA Binding Peptide

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Visualisering av store DNA-molekyler tjoret på glass eller perle overflater har blitt brukt for å undersøke DNA-protein interaksjoner, protein dynamikk på DNA-substrat, 1,2 og polymer fysikk. 3,4 A-plattformen for single-forankrede store DNA-molekyler har noen distinkt fordelene i forhold til andre DNA-immobilisering metoder. 5 Først, et stort DNA-molekyl bundet på overflaten har en naturlig tilfeldig kveil-konformasjon uten en skjærstrømning, noe som er kritisk viktig for en DNA-bindende protein for å gjenkjenne dets bindingssete. For det andre er det meget enkelt å endre den kjemiske miljøet rundt DNA-molekyler for en serie av enzymatiske reaksjoner i et strømningskammer. For det tredje, induserer en mikrofluidskjærstrømnings DNA-molekyl som strekker seg opp til 100% av full lengde kontur, noe som er svært vanskelig å oppnå ved bruk av alternative DNA forlengelse tilnærminger, for eksempel overflate immobilisering 6 og nanochannel innesperring. 7 Et fullt stretched DNA-molekylet gir også posisjons informasjon som kan være nyttig for å overvåke enzymatiske bevegelser på genomisk kartet.

Ikke desto mindre, har DNA-tilknytning tilnærmingen en kritisk mangel ved at interkalerende fargestoff slik som YOYO-en generelt fører til binding av DNA-molekyler for å være lett brytes av fluorescenseksitasjon lys. Vanligvis store DNA-molekyler som måtte være farget med et fluorescerende fargestoff for visualisering under et fluorescerende mikroskop. For dette formålet, YOYO-en eller andre TOTO serie fargestoffer er først og fremst brukt fordi disse fargestoffer fluor bare når de intercalate dobbelttrådet DNA. 8 Men det er velkjent at bis-innføyings fargestoff fører lett-indusert DNA foto-spalting fordi av intercalation av fluoroforer. 9 videre fluorescens farget DNA-molekyler tjoret på overflaten er mer skjøre siden skjærstrømninger kan utøve bryte krefter på fritt bevegelige DNA-molekyler. Derfor utviklet vi FP-DBP som en roman DNA-farging protein fargestoff for avbilding av store DNA molekyler tjoret på overflaten. Fordelen med å bruke FP-DBP er at det ikke forårsaker foto-spalting av DNA-molekylene som det binder seg til. 10 I tillegg, FP-DBP øker ikke konturen lengden av DNA, mens bis-interkalerende fargestoff øke konturen lengde med omtrent 33%.

Denne videoen metoden introduserer eksperimentell tilnærming for tethering store DNA-molekyler til en PEG-biotin overflaten. Figur 1 viser ulike tilnærminger til tethering DNA med butte ender og klebrige ender. Således kan denne fargemetoden anvendes på hvilken som helst type DNA-molekylet. Figur 2 viser en skjematisk representasjon av strømningskammermontasjen som kan styres ved hjelp av en sprøytepumpe for å generere skjærstrømninger for å strekke DNA-molekyler, så vel som å laste kjemisk og enzym løsninger. Figur 3 viser mikrografer av helt strukket DNA-molekyler tjoret på PEGylated overflaten 11 og farget med FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Biotinylation

  1. Biotinylation av stump ended DNA ved hjelp av Terminal transferase (TdT)
    Merk: Bruk T4 DNA (166 kbp), som er en stump endet DNA.
    1. Tilsett 5 ul av 2,5 mM CoCl 2, 5 ul av 10 x reaksjonsbuffer, 0,5 ul 10 mM biotin-11-dUTP, 0,5 mL av terminal transferase (10 enheter), og 0,5 pl T4 DNA (0,5 ug / mL) til reaksjonsblandingen. Gjør til et endelig volum på 50 ul ved tilsetning av 38,5 ul vann.
    2. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 1 time.
      Merk: Forlenget Reaksjonstiden kan gi dobbelt-bundet DNA, det vil si, det er mulig at biotins er merket i begge ender.
    3. Stopp reaksjonen ved å tilsette 5 ul 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Hold røret ved 4 ° C.
  2. Biotinylation av klebrig ended DNA Bruke DNA Ligase
    Merk: Bruk λ DNA (48,5 kbp), som er en klebrig-end DNA. <ol>
  3. Tilsett 1 pl av T4 DNA-ligase, 5 pl 10 x ligeringsbuffer, 1 pl av 25 ng / mL λ fag-DNA, og tilsett 43 mL vann for å gi et sluttvolum på 50 pl.
  4. Hold røret ved 4 ° C.

2. funksjon Surface Derivatisering

Merk:. For å tjore en ende av et DNA-molekyl på glassoverflate, er en primær amingruppe silanisert på et dekkglass, etterfulgt av biotin-PEG belegg som vist i Figur 1. Denne PEGylering fremgangsmåte er viktig for enkelt-molekyl DNA avbildning fordi kan betydelig redusere tilfeldig støy som er opprettet ved festing av uønskede molekyler på overflaten.

  1. Piranha Rengjøring
    Merk: Piranha løsninger reagere kraftig med organisk materiale, derfor bør håndteres med forsiktighet, etter skikkelige retningslinjer for sikkerhet.
    1. Plasser Dekk på en polytetrafluoretylen (PTFE) rack, og holde dem by PTFE Gjengetape på langs, halvt på kanten av overflatene og halvparten på stativet. Etter innpakning, la et langt stykke (~ 5 cm) med tape for håndtering rack under rengjøringsprosessen.
    2. Fylle en 1-liters begerglass sammen med 350 ml H 2 SO 4 og 150 ml H 2 O 2 for å gjøre piraja oppløsning i en avtrekkshette. Plasser rack i piraja løsning for 2 timer.
    3. Målt piraja løsning fra begerglasset, og skyll Dekk grundig med avionisert vann inntil pH-verdien av vannet i begerglasset når nøytral. Bruk pH papir strimler.
    4. Sonikere stativer av dekkglass i begeret inneholdende vann, i 30 minutter. Tøm vann fra begeret like før amino silanisering. Bruk 75 W for lydbehandling makt til å rengjøre og derivatisere glassunderlag.
  2. Aminosilanization på Glass Surface
    1. Tilsett 2 ml av N - [3- (trimetoksysilyl) propyl] etylendiamin og 10 ml iseddik i 200 mlmetylalkohol i en ren polypropylen beholder for fremstilling av aminosilanization løsning.
    2. Plasser renset Dekk i polypropylenboks. Riste dem ved 100 rpm og værelsetemperatur i 30 min.
    3. Sonikere begerglass med derivatiserte dekkglass i 15 minutter ved 75 W. riste dem ved 100 rpm og værelsetemperatur i minst 30 min.
    4. Tømme løsningen fra begerglasset, og skyll Dekk forsiktig, en gang med metylalkohol, og to ganger med etylalkohol. Oppbevar Dekk i etylalkohol og bruke dem innen to uker.
  3. PEGyleringen av dekk
    1. Gjøre 10 ml 0,1 M natriumbikarbonat (NaHCO3). Filtrer løsningen med en 0,22-um sprøytefilter.
    2. Oppløs 2 mg biotin-PEG-succinimidyl karbonat (biotin-PEG-SC) og 80 mg PEG-succinimidyl-valerat (mPEG-SVG) i 350 ul av NaHCO3. Bruk en lett beskyttelse tube.
    3. Vortex røret kraftig i en0 sek, og sentrifuger det ved 10.000 x g i 1 min for å fjerne bobler.
    4. Skyll en glassplate med aceton, etterfulgt av skylling med etylalkohol. Tillat lysbildet til luft tørke helt.
    5. Plasser en dråpe (50 pl) av PEG løsning på rent glass lysbilde. Dekk dråpe forsiktig med en amino HSTTanBeTiandlet dekkglass, uten å generere noen bobler.
    6. Plasser lysbilder for 3 timer til over natten i et mørkt, godt utjevnet fuktkammer ved romtemperatur. Bruke en tom pipettespissen holderen som kammeret, med vann på bunnen. Forsegl gjenværende PEG oppløsning i røret og holde det ved 4 ° C.
    7. Skyll PEGylert dekk grundig med avionisert vann. Oppbevar den på et mørkt og tørt sted før bruk.

3. Sette sammen en Flow Chamber

  1. Fabrikere en utstanset akryl holder, som i figur 2. Påse at diameteren av røret innsatsen er 0,762 mm, og bruker den ene hull er et innløp, og den andre eret utløp (figur 2).
  2. Plasser dobbeltsidig tape strimler (bredde 5-6 mm) på en akrylholderen (figur 2), reguleringsvinkelrett på et innløp og utløpshull, ikke å perturbere alle kanal hull. Bruk disse tapestripe som flerkanals vegger for å lage kammer. Skrubb båndet med en pipette tips
  3. Plasser et pegylert og dekk på toppen for å gjøre flyt kamre, med PEGylert siden ned.
  4. For å hindre at noen løsning lekker, trykker du på toppen av et dekkglass over området der tosidige tape er plassert. Legg hurtigtørkende epoksylim for å lukke kantene av kammeret ved toppen og ved bunnen (gul farge i figur 2).
  5. Koble et kort stykke (2,5 cm) av røret (ytre diameter, OD, 0,042 ") til en gasstett sprøyte, og tette skjøten med epoksylim.
  6. Koble en lang fleksibel slange (OD: 0.03 ») til røret er knyttet til sprøyten og tette skjøten med epoksylim.
  7. Fyll tubing koblet til sprøyten med DI vann. Pass på at det ikke er noen luftboble.
  8. Sett slangen inn i hullet av strømningskammeret forseglet med epoksylim.
  9. Plasser en gul spiss (200 mL spiss) på det andre hullet som et reservoar.

4. Prøve Laster inn Flow Chamber

Merk: Neutravidin kan erstattes med andre avidin proteiner som streptavidin. Alle reaksjoner kan utføres ved romtemperatur, med mindre det er nevnt. Ta prøveløsningen i en gul spiss, og installere den spissen med løsningen på hullet i akryl holderen (Figur 2b).

  1. Angi strømningshastigheten for sprøytepumpen 50 mL / min. Belastning 20 ul avidin protein (25 ug / ml i T50-oppløsning, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), og holder den i 10 min.
  2. Load 20 mL av biotinylerte oligodeoksynukleotider (100 mikrometer i 1 x TE), og holde den i 10 min. Hvis terminal transferase brukes, hoppe over lastingav oligodeoksynukleotider.
  3. Belastning 20 ul av DNA-oppløsningen fra trinn 1 i strømningskammeret ved en strømningshastighet på 10 mL / min, og holder den i 30 minutter.
  4. Vask flyten kammer med 1 x TE, og legg 40 ul FP-DBP 10 (~ 80 nM).
  5. Observer DNA under et fluorescerende mikroskop med kontinuerlig strøm av flekker molekyler i en × TE på en 60X objektiv. Bruk 488 nm solid state laser for eksitasjon av FP (EGFP) -DBP. For full strekk av DNA-molekyler, bruke forskjellige strømningsrater i henhold til de DNA-lengder som brukes. For eksempel gjelde 50 mL / min til 48,5 kbp av λ DNA, og 100 ul / min til 166 kbp av T4 DNA.
    1. For resirkulering av akryl holder, suge samlet flyt kamre i en husholdning vaskemiddel 12. Fjern bånd og epoxy med et barberblad og gni med hendene for å helt ta dem av. Rense hullene med sprøyte nåler. Hold eierne i avionisert vann til videre bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser to forskjellige DNA fortøyningsmetoder avhengig av terminale strukturer i DNA-molekylet. Figur 1a viser hvordan de klebrige endede DNA-molekyler blir hybridisert med komplementære biotinylerte oligonukleotider, som er immobilisert på avidin-belagte PEG overflate. Figur 1b viser tilsetning av biotinylert ddNTP eller dNTP til 3'-hydroksylgruppen i en stump endet DNA ved hjelp av terminal transferase. Vi har lagt fleksible forbindelsesledd mellom DNA-molekyler og biotin. Dette økte ligerings og avidin-biotin-binding effektivitet for å gi tilstrekkelig plass for reaksjonene. Figur 1c viser det generelle skjematiske representasjon for DNA-deling på avidin-belagte PEG overflate.

Figur 2 viser sammenstillingen av strømningskammeret sammen med en akryl holder. Sammenlignet med glass / kvarts glide briller, forenkler en skreddersydd akryl holderen fremstillingen av strømningskammeret for epi-fluorescerende mikroskopi. 12 Strømningskammeret muliggjør umiddelbar endring av bufferbetingelsene for enzymreaksjoner, 6 og strekker molekyler DNA.

Figur 3 viser enkelt tethered DNA og T4 λDNA farget med FP-DBP. Microfluidic skjær renner langstrakte enkle DNA-molekyler opp til full kontur lengder som 16,5 mikrometer (48,5 kb λ DNA x 0,34 nm) og 56,4 mikrometer (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). Vi var i stand til å gjenta DNA-strekking og avslapping flere ganger i løpet av en lengre periode (for eksempel halv time), siden vi utnyttet FP-DBP som ikke forårsaker foto-cleavage.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av DNA-tilknytning. a) En sticky ended DNA hybridisert med en biotinylert komplementære oligonukleotid. Trietylenglykol er en fleksibel linker mellom oligonukleotidet og biotin. B) Biotinylert dNTP tilsettes til en butt ende av dobbelttrådet DNA, ved terminal transferase. Polycarbon avstandsstykke (11-atomer) er en fleksibel linker mellom dNTP og biotin. C) biotinylert DNA er forankret til en avidin-protein, som er koblet til en biotinylert PEG kovalent bundet til glassoverflaten. Forholdet mellom biotinylert PEG til normal PEG var 0.025 (01:40). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Flow kammer. a) Flow kammer består av en akrylsyre harpiks holder, strimler av tosidige tape og et pegylert og dekke slip. Akryl Innehaveren av dimensjoner 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x B x H), ble fremstilt med laserskjæring b) fra siden av strømningskammeret. Stansede hull har en innløpsåpning på hvilken en gul spiss er installert for en buffer reservoar, og en utløpsport som er koblet til et rør som styres av en sprøyte-pumpe. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Fluorescent mikroskopiske bilder av strukket DNA-molekyler farget med FP-DBP. a) Bakteriofag λ DNA (48,5 kbp) bundet på overflaten etter ligering med biotinylerte komplementære oligonukleotider. b) Bakteriofag T4 DNA (166 kbp) bundet på overflaten etter tilsetning av biotin med terminal transferase. Indikert pilene viser DNA molecules strekkes opp til sitt fulle kontur lengder som 16,5 mikrometer for λ DNA og 56,4 mikrometer for T4 DNA. Skala barer:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en plattform for å visualisere lange DNA-molekyler biotinylert for forankring på overflater. Vi har rapportert en tilnærming for DNA-molekyler tjoret på en avidin protein belagt overflate med biotinylert bovin serum albumin. 6 I tidligere tilnærmingen, har vi funnet en avgjørende spørsmålet om DNA foto spalting forårsaket av bis-interkaleringsforbindelser fargestoffer som flekker DNA-molekyler bundet på flate. Ettersom disse stadig eksiterte fluoroforer har en høy sannsynlighet for å angripe en DNA-fosfat-hovedkjeden, 9 eksitasjonslyset kraft måtte bli minimalisert for å unngå foto-spalting.

For å overvinne denne ulempe, har vi utviklet genetisk konstruert fluorescerende proteiner med DNA-bindingsevne (FP-DBP) for farging DNA uten bilde-spalting. 10 Vi har observert pålitelig DNA flekker på avidinbelagte protein overflater. Likevel, denne plattformen hadde en annen utgave av uønsket aggregering av fluorescerende proteiner påprotein overflaten, noe som resulterer i øket bakgrunnsstøy. Det er viktig å minimere denne tilfeldig støy for enkelt-molekyl DNA-analyse for å forbedre kontrasten til DNA og proteiner fra bakgrunnen. Bruken av FP-DBP krever derfor overflatepassivering for å forhindre den fluorescerende protein fra å bli adsorbert på overflaten. PEG kan være en kraftig kandidat for dette formål. 12 Derfor brukte vi biotinylert-PEG, noe som dramatisk forbedret signal-til-støyforholdet for avbildning FP-DBP farget DNA-molekyler tjoret på overflaten.

Det er flere viktige skritt og notater i denne metoden for høyere avkastning. For å tjore en ende av et DNA-molekyl på en glassoverflate, er en primær amingruppe silanisert på et dekkglass, etterfulgt av biotin-PEG belegg som vist i figur 1. Denne overflatepassivering prosessen er avgjørende for enkelt-molekyl DNA avbildning fordi kan betydelig redusere støygenererende tilfeldig adsorpsjon på flatene.Derfor blir over natten aminosilanization og PEGyleringen anbefales sterkt. I tillegg, rengjøring av glass-slide, samt dekkglasset med piraja løsning kan ytterligere redusere bakgrunnsstøy.

Et biotinylert oligonukleotid må ha en fosfatgruppe i 5'-enden for å knytte den til 3'-hydroksylgruppen til et stort DNA-molekyl. Sekvensen av biotinylert oligonukleotid er 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-Biotin-3 'for λ DNA-deling. Den λ DNA-oppløsningen må være lastet kort tid etter fremstillingen av λ DNA-oppløsning (beskrevet i 1.1), fordi λ DNA ofte danner concatemers med lang-tidslagring. For buttendede DNA slik som T4 DNA, kan terminal transferase legge biotinylerte dUTPs ved begge ender av DNA uten spesifisitet. Således har terminal transferase reaksjonstiden være nøye justeres omkring en time, ellers forlenget reaksjon kan gi dobbelt-merket DNA (dvs. at begge ender merket med biotin). i addition til viral DNA, slik som λ og T4 kan alle typer av DNA som benyttes i denne plattformen. Imidlertid er det anbefalt å bruke fragmenter fra gigantisk genomisk DNA etter fordøyelse av sjeldne Kjærerestriksjonsenzymer som Swai eller Noti.

Ulike hastighet er søkt om forskjellige lengder av DNA. Vanligvis lengre DNA-molekyler krever raskere strømningsrater til fullt strekke DNA-molekyler, for å matche den eksakte konturen lengden. For eksempel kan λ DNA strekke seg til 16,5 mikrometer, som tilsvarer den beregnede verdi på 0,34 nm x 48 502 bp.

Det er ganske viktig å tilbereder alle materialer, spesielt alle proteiner og knagger. For eksempel, Neutravidin mister raskt sin funksjon å binde biotins hvis det er lagret som en fortynnet oppløsning. For PEG-løsninger, er pH-verdien viktig å konjugere funksjonelle grupper i et primært amin og N-hydroksysuccinimid. Derfor anbefales det å tilbereder alle materialer minst hver uke.

Visualisering av store DNA-molekyler tjoret på overflaten er en allsidig plattform som skal brukes for en rekke applikasjoner som genomikk, Epigenomics, biokjemiske studier for DNA og protein interaksjon og polymer fysikk studier. Imidlertid er denne metode for tiden begrenset bare til å modellere systemer ved hjelp av forholdsvis enkle og kjente DNA-molekyler, slik som det virale genom. Å bli utvidet til det menneskelige genom og epigenome, er det kritisk viktig å etablere en robust, pålitelig og enkel plattform for praktisk bruk. Ved å overvinne lys-indusert DNA foto-spalting og hindre tilfeldig opptak av fluorescerende protein på overflaten, gir denne plattformen derfor klare og bilder med høy kontrast for DNA forlenget med skjærstrømninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats